樣本分析前質(zhì)量控制對新型冠狀病毒核酸檢測結(jié)果的影響

李艷 郭心靈 馬曉霞 靳福旭

作者單位：300308 天津，天津醫(yī)科大學總醫(yī)院空港醫(yī)院檢驗科

2019 年12 月以來，由新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）引起的新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）疫情在全球各地持續(xù)發(fā)生。2020 年1 月12日國際病毒分類委員會將該病毒命名為嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）［1］。有研究表明，2019-nCoV 在塑料和鋼表面可存活3 d［2-3］，收治新冠肺炎患者的醫(yī)院環(huán)境采樣存在2019-nCoV 污染，表明病毒可以通過物體表面間接傳播［4］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的建議，及時準確地檢出鼻咽拭子樣本中2019-nCoV的RNA，是直接診斷新冠肺炎的首選方法，血清學檢測可作為疾病診斷以及流行病學研究的補充方法［5-8］。檢測出無癥狀感染者體內(nèi)的2019-nCoV，并追蹤他們的所有潛在的接觸者，被認為是限制病毒進一步傳播的關鍵［9］。2019-nCoV 的傳播可能發(fā)生在窗口期，潛伏期內(nèi)也可能傳播，在任何臨床癥狀出現(xiàn)前的一到兩周甚至更長時間段內(nèi)均有可能傳播［9-10］。因此，無癥狀感染者和近期發(fā)病者的鑒定必須是基于病毒RNA 的直接鑒定［7-8］。然而，在新冠肺炎大流行和2019-nCoV 高突變的背景下，以及考慮到病毒核酸檢測試劑的潛在局限性，不能滿足及時檢測樣本中病毒RNA 的要求。在2019-nCoV核酸檢測過程中，由于RNA 降解導致的假陰性結(jié)果都可能影響臨床醫(yī)師對疾病的診斷。

對臨床實驗室來說，標準化的樣本運輸方式、樣本儲存時間和溫度要求是至關重要的，也是實驗室分析前質(zhì)量控制（質(zhì)控）的重要組成部分。本研究收集10例新冠肺炎住院患者的20份鼻咽拭子樣本，將每份鼻咽拭子樣本進行21 等分，其中1 份于當日進行檢測，另外于室溫（25 ℃）、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃條件下分別存放5 等份樣本，并于存放的第1、2、3、7、14 天進行2019-nCoV 核酸提取與擴增，比較循環(huán)閾值（cycle threshold，CT 值），探討樣本保存時間和溫度對核酸檢測結(jié)果的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 樣本采集 采集10 例新冠肺炎住院患者（由于醫(yī)院性質(zhì)原因，非同一時期住院患者）鼻咽拭子，將樣本置于（4.0±0.3）mL 運送培養(yǎng)基內(nèi)。采用實驗當日本院職工篩查標本（＞40 份/d）作為陰性對照，同時采用3 份生物安全柜內(nèi)紫外線照射過的生理鹽水參與提取和擴增的全過程。弱陽性質(zhì)控采用第三方質(zhì)控品參與提取和擴增全過程。

1.2 儀器與試劑 使用含有胍鹽成分的滅活樣本保存液（購自天津灝洋華科生物科技有限公司）保存拭子，2019-nCoV RNA 液體室內(nèi)質(zhì)控品S0 購自廣州邦德盛生物科技有限公司，濃度為9.86×102個拷貝/mL，采用NSE-32 核酸提純儀（購自西安天隆科技有限公司）進行樣本核酸提取，擴增使用的實時熒光聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）2019-nCoV 核酸檢測試劑盒購自廣州達安基因股份有限公司，ABI 7500 擴增儀購自賽默飛世爾科技（中國）公司，實驗所用耗材均為無酶耗材。

1.3 檢測方法 采集每位患者的兩份鼻咽拭子，分別混勻、靜置，在標本采集后3 h 內(nèi)進行20 等分。在標本分裝完成之前，所有標本除加樣、分裝外，均置于4 ℃保存待用。當日檢測標本從采樣到上機擴增時間控制在2 h 內(nèi)，并以此CT 值作為參考。剩余標本分為4 組：25 ℃（室溫）、4 ℃（冰箱）、-20 ℃（冷凍）、-80 ℃（低溫冷凍），每個溫度5 份；在第1、2、3、7、14 天后進行核酸提取和擴增，并記錄CT 值，與參考CT 值進行比較。

使用自動化核酸提取平臺NSE-32 核酸提純儀提取RNA，使用ABI 7500 擴增儀進行qRT-PCR 反應，每次實驗都由一個外部陽性質(zhì)控品（廣州邦德盛生物科技有限公司）和3 個陰性來料質(zhì)控（incoming quality control，IQC）監(jiān)控，以當日本院職工篩查標本作為對照，上述質(zhì)控始終與患者樣本平行運行。

1.4 倫理學 本研究符合醫(yī)學倫理學標準，并經(jīng)本院倫理審批（審批號：IRB2022-WZ-02），所有檢測均獲得過患者或家屬的知情同意。

1.5 統(tǒng)計學分析 根據(jù)變量分布，使用Wilcoxon 符號秩和檢驗對當日檢測CT 值和剩余等分標本的檢測CT 值進行比較。多次重復的方差分析用于評估溫度和時間對標本檢測的影響。P＜0.05 被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 相同保存溫度不同保存時間2019-nCoV 核酸檢測結(jié)果 樣本在-20 ℃和-80 ℃儲存7 d、4 ℃保存48 h 后相對穩(wěn)定；樣本在-20 ℃和-80 ℃儲存7 d、4 ℃儲存48 h和室溫儲存24 h后核酸檢測CT值有明顯的上升趨勢。見圖1～2。

圖1 相同保存溫度不同保存時間樣本2019-nCoV核酸檢測N 基因CT 值比較

2.2 不同樣本在不同變量下2019-nCoV 核酸檢測CT 值的CV 值比較 對20 份樣本在不同變量下的2019-nCoV 核酸檢測結(jié)果CT 值的CV 值進行統(tǒng)計分析，在忽略保存時間的條件下，樣本保存在25 ℃（室溫）下保存時，ORF-1ab 和N 基因CT 值的CV 偏大；樣本保存在-80 ℃條件下，樣本的ORF-1ab 和N 基因CT 值的CV 偏小。在不同溫度下，ORF-1ab基因在保存第7 天時CV 均＞5%；N 基因在保存第7 天時25 ℃、4 ℃和-20 ℃出現(xiàn)CV 值＞5%。見表1。在忽略保存溫度的條件下，樣本保存時間為7 d 時標本的ORF-1ab 基因和N 基因CT 值的CV 偏大，樣本保存時間為14 d 時，20 份標本中有6 份標本ORF-1ab 基因CT 值的CV＞5%，7 份標本N 基因CT值的CV＞5%。見表2。

表2 保存不同時間2019-nCoV 核酸檢測ORF-1ab 和N 基因CT 值的CV 值

圖2 相同保存溫度不同保存時間樣本2019-nCoV核酸檢測ORF-1ab 基因CT 值比較

表1 不同保存溫度下2019-nCoV 核酸ORF-1ab和N 基因CT 值的CV 值

3 討論

本研究表明，在分析2019-nCoV 核酸兩個靶基因的CT 值時，鼻咽拭子樣本的儲存溫度及儲存時間等條件可被視為2019-nCoV 核酸檢測分析中潛在的分析前誤差因素。

有研究表明，在現(xiàn)有的出院標準下，仍有部分患者是2019-nCoV 攜帶者，目前疫情已進入常態(tài)化階段，及時進行重點人群核酸檢測和隨訪，對預防疫情反彈至關重要［11］。在疫情常態(tài)化防控階段，核酸檢測結(jié)果的準確性至關重要，而檢驗前的標本質(zhì)控是保證檢測結(jié)果準確性的重要一環(huán)。對疑似新冠肺炎患者的鼻咽拭子進行RT-PCR 可以準確診斷新冠肺炎［10，12］。RT-PCR 基于指數(shù)擴增動力學，CT 值與樣本中的病毒載量密切相關［12］。RT-PCR 結(jié)果還與以下因素相關：① 樣本采集質(zhì)量；② 樣本采集到檢測的時間；③ 樣本保存以及運輸溫度；④ 樣本保存緩沖液；⑤ 提取核酸過程（包括提取試劑、儀器、加樣量以及人員操作）；⑥ RT-PCR 擴增試劑的前期處理、RNA 加樣、擴增過程以及不同人員對結(jié)果的解釋等。在以上因素中，任何步驟產(chǎn)生誤差都有可能影響檢測結(jié)果，從而影響臨床診斷。為降低標本采集誤差對研究結(jié)果的影響，本研究選擇同一患者的鼻咽拭子兩份標本充分混勻再進行等分，盡量減少變量以外的因素對檢測結(jié)果的影響。從采集樣本到將樣本運送到實驗室進行檢測可能需要較長的時間間隔，特別是病毒大面積隱匿傳播，需要進行重點人群核酸篩查時。在上述情況下，要控制樣本的運輸溫度與運送時間，將對核酸檢測結(jié)果的影響降到最小。本研究結(jié)果表明，樣本在-20 ℃和-80 ℃條件儲存的前7 d 內(nèi)和在4 ℃條件保存的48 h 內(nèi)相對穩(wěn)定；樣本在-20 ℃和-80 ℃條件儲存7 d、4 ℃條件儲存48 h 和室溫儲存24 h 后核酸檢測CT 值結(jié)果有明顯的上升趨勢。

本研究的局限性主要在于僅使用一種類型的采樣拭子、一種提取試劑和一種擴增試劑，缺乏不同試劑間的比較，這可能對樣本的完整性和測試結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

綜上所述，樣本儲存溫度和時間是2019-nCoV核酸檢測中潛在的分析前誤差，由于RNA 的不穩(wěn)定性，當檢測延遲時，尤其是在處于較高的儲存溫度，經(jīng)過較長的儲存時間，且病毒載量較低的情況下，由于樣本的保存溫度和保存時間不恰當可能會造成假陰性結(jié)果，從而影響臨床診斷。樣本采集后應在低溫保存運輸并盡快檢測，以減少因儲存溫度和時間導致的分析前誤差。本研究數(shù)據(jù)可能會為制定新冠肺炎分子診斷的標準操作規(guī)程提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突