外源蛋白對(duì)大豆油脂體穩(wěn)定性的影響

劉子豪，梅雅欣，彭 郁，傅 嬈，秦琛強(qiáng)，倪元穎，溫 馨

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

油脂體也被稱為油體或脂質(zhì)體，是植物儲(chǔ)存油脂的細(xì)胞器[1-2]，其核心基質(zhì)為甘油三酯，在其周圍覆蓋著一層混合性保護(hù)膜——油脂體膜，由磷脂單分子層與嵌入其中的油脂體蛋白組成[3]。油脂體蛋白包括油體蛋白、油體鈣蛋白及油體固醇蛋白，其分子質(zhì)量分別為14～17、24～28 kDa和35～60 kDa[2]。通過(guò)水提法提取油脂體能較好地保持其天然結(jié)構(gòu)，并以水包油乳液形式穩(wěn)定存在，相比于使用傳統(tǒng)的高度精煉植物油結(jié)合額外的乳化劑和均質(zhì)步驟制備乳液，天然油脂體在乳液相關(guān)應(yīng)用方面具有廣闊前景[4]。

天然油脂體的穩(wěn)定性主要由其獨(dú)特的膜結(jié)構(gòu)決定。Yang Nan等[5]利用原子力顯微鏡對(duì)大豆、芝麻和花生油脂體的機(jī)械性能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)油脂體是一種柔性液滴，在對(duì)其施加的壓縮應(yīng)變高達(dá)0.3時(shí)亦能很快恢復(fù)。Nikiforidis等[6]研究發(fā)現(xiàn)玉米胚芽油脂體在長(zhǎng)時(shí)間貯藏過(guò)程中較為穩(wěn)定，不易聚集。但在油脂體作為食品配料的應(yīng)用過(guò)程中，不同的加工處理?xiàng)l件會(huì)使油脂體穩(wěn)定性受到一定影響[7]。Iwanaga等[8]研究發(fā)現(xiàn)大豆油脂體在相對(duì)較低的鹽濃度（≤25 mmol/L）或pH值遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)較為穩(wěn)定，不易聚集和分層，而在高鹽濃度或pH值位于等電點(diǎn)（pH 4）附近時(shí)穩(wěn)定性較差；在熱處理（30～90 ℃）條件下較為穩(wěn)定，但當(dāng)溫度超過(guò)60 ℃時(shí)，Zeta電位降低，界面特性發(fā)生改變。

水提法提取油脂體時(shí)，研磨和浸泡過(guò)程會(huì)使種子中一部分貯藏蛋白附著在油脂體外，形成油脂體膜以外的第2層蛋白膜[7]。這些外源蛋白與油脂體膜相互作用，可能會(huì)對(duì)油脂體的穩(wěn)定性和界面性質(zhì)產(chǎn)生正面或負(fù)面影響。Nikiforidis等[9]對(duì)玉米胚芽油脂體的研究表明，有外源蛋白附著的油脂體在貯藏過(guò)程中具有更好的物理穩(wěn)定性。大豆蛋白含量較高，且部分大豆蛋白具有兩親性，在油脂體的提取中容易附著在油脂體膜上，從而對(duì)大豆油脂體的穩(wěn)定性造成影響。Ishii等[10]通過(guò)對(duì)比富含外源蛋白的大豆粗油脂體（crude oil bodies，COB）與不含外源蛋白的純油脂體（purified oil bodies，POB）的界面和乳化特性發(fā)現(xiàn)外源蛋白賦予COB更高的電位，但卻使其更容易聚集。然而，在食品加工中常見(jiàn)的酸堿、鹽和熱處理等因素對(duì)大豆COB和POB穩(wěn)定性的影響仍然未知。因此，本研究以大豆為原料，探究外源蛋白對(duì)大豆油脂體穩(wěn)定性的影響，以期為提高天然油脂體在加工中的穩(wěn)定性提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（墾豐十六）采自黑龍江省巴彥縣；氫氧化鈉、鹽酸、硫酸和氯化鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine，TEMED）、丙烯酰胺、蛋白上樣緩沖液、電泳蛋白標(biāo)品北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16C高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FE-500DE pH計(jì) 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；Mastersizer 2000激光粒度儀、Zetasizer Nano ZS電位分析儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；LUMI Fuge全功能穩(wěn)定性分析儀德國(guó)LUM GmbH公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳槽 美國(guó)Bio-Rad公司；HR2095破碎機(jī) 飛利浦電子香港有限公司；SE206脂肪測(cè)定儀、KN520自動(dòng)凱氏定氮儀器、SPH620消解儀濟(jì)南阿爾瓦儀器有限公司；DSH-50A-1水分測(cè)定儀 上海佑科儀器儀表有限公司；DHR-2旋轉(zhuǎn)流變儀 美國(guó)TA Instruments公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆COB和POB的提取

參照Chen Yeming等[11]的方法并加以改進(jìn)。稱取60 g大豆，按1∶7（g/mL）比例在去離子水中4 ℃浸泡18 h，使用破碎機(jī)最大擋位破碎90 s，三層紗布過(guò)濾后獲得濾液。將濾液于離心機(jī)中4 ℃、10 000×g離心30 min后用藥匙分離上層懸浮乳膏于燒杯中。按1∶5（g/mL）比例加入去離子水洗滌乳膏，重復(fù)洗滌后4 ℃、10 000×g離心30 min，離心兩次，收集上層懸浮乳膏即為COB。

參照Chen Yeming等[11]的方法并加以改進(jìn)。稱取60 g大豆，按1∶7（g/mL）比例在去離子水中4 ℃浸泡18 h，使用破碎機(jī)最大擋位破碎90 s，三層紗布過(guò)濾后獲得濾液。使用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)濾液至pH 11后于離心機(jī)中4 ℃、10 000×g離心30 min。用藥匙分離上層懸浮乳膏于燒杯中，按1∶5（g/mL）比例加入去離子水，使用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)乳膏懸浮液至pH 11，重復(fù)洗滌后4 ℃、10 000×g離心30 min，離心兩次，收集上層懸浮乳膏即為POB。

1.3.2 油脂體組分分析

1.3.2.1 含水率測(cè)定

精確稱取1.00 g新鮮油脂體于水分測(cè)定儀中，設(shè)定烘干溫度105 ℃，持續(xù)烘干至質(zhì)量不再變化，記錄含水率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2.2 脂肪含量測(cè)定

將烘干的油脂體置于剪裁好的脫脂濾紙中封口，將濾紙放入索氏提取器中，設(shè)定恒溫循環(huán)器溫度8 ℃，索氏提取器溫度60 ℃，提取試劑為石油醚，索氏抽提5 h。提取完成后室溫冷卻，取出并轉(zhuǎn)移至蒸餾燒瓶進(jìn)行旋蒸，測(cè)定旋蒸前后質(zhì)量差計(jì)算脂肪含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2.3 蛋白含量測(cè)定

精確稱取0.25 g烘干的油脂體于消化管中，加入6 g硝酸鉀、0.4 g硫酸銅和8 mL濃硫酸，于消解儀420 ℃消解1 h。消化管冷卻至室溫后于自動(dòng)凱氏定氮儀中進(jìn)行測(cè)定，使用標(biāo)定過(guò)的鹽酸溶液進(jìn)行滴定至溶液變?yōu)榛揖G色，記錄滴定所用鹽酸體積，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按下式計(jì)算蛋白質(zhì)含量（X）：

式中：V1為鹽酸消耗體積/mL；V0為空白鹽酸消耗體積/mL；c為鹽酸濃度/（mol/L）；F為大豆蛋白系數(shù)6.25；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.2.4 蛋白組成分析

使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析蛋白組成。分別用去離子水稀釋新鮮制備的COB和POB為質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的乳液，分別加入30 μL乳液與10 μL含β-巰基乙醇的蛋白上樣緩沖液，95 ℃加熱5 min，冷卻后離心。采用5%濃縮膠和15%分離膠，取10 μL樣品上清液，設(shè)置恒壓80 V，待溴酚藍(lán)前沿道分離膠時(shí)，改變電壓為110 V進(jìn)行電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)玻璃板底部。電泳完成后，將凝膠于快速染色液中染色并脫色至電泳條帶清晰，背景脫色干凈后用凝膠成像系統(tǒng)成像，使用ImageJ軟件分析結(jié)果。

1.3.3 油脂體乳液粒徑和Zeta電位測(cè)定

參照Iwanaga等[8]的方法，將新鮮制備的COB和POB分別用去離子水稀釋100 倍，持續(xù)攪拌30 min，使用激光粒度儀測(cè)定乳液粒徑，設(shè)定分散相折射率為1.47，連續(xù)相折射率為1.33，得到粒徑分布圖，并計(jì)算平均粒徑（D4,3）。使用電位分析儀測(cè)定乳液Zeta電位。

1.3.4 油脂體乳液物理穩(wěn)定性測(cè)定

使用全功能穩(wěn)定性分析儀測(cè)定油脂體乳液在加速離心過(guò)程中乳液透光率動(dòng)態(tài)變化，獲得澄清指數(shù)-時(shí)間變化曲線。將新鮮制備的COB和POB分別用去離子水稀釋100 倍，攪拌均勻后準(zhǔn)確加至LUMi離心管的刻度線，設(shè)置溫度25 ℃，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，間隔10 s，循環(huán)360次進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 油脂體乳液穩(wěn)定性觀察

將新鮮制備的COB和POB分別用去離子水稀釋100 倍，取9 mL于玻璃試管中，觀察油脂體乳液狀態(tài)并采集圖像。

1.3.6 油脂體流變學(xué)特性測(cè)定

1.3.6.1 靜態(tài)流變學(xué)特性測(cè)定

使用旋轉(zhuǎn)流變儀進(jìn)行分析。選用40 mm不銹鋼椎板夾具，設(shè)置Flow Ramp模式，在測(cè)定溫度25 ℃，平衡時(shí)間30 s，間距1 050 μm，剪切速率1～100 s-1，測(cè)定時(shí)間60 s條件下，測(cè)定黏度/剪切速率曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6.2 動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性測(cè)定

采用TA型流變儀的平板夾具進(jìn)行測(cè)定。在25 ℃、角頻率1～100 rad/s、應(yīng)變1%條件下，對(duì)各樣品進(jìn)行頻率掃描，從而得到樣品的彈性模量（G'）、黏性模量（G″）和損耗角正切值（tanδ），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.7 不同環(huán)境因素對(duì)大豆油脂體乳液穩(wěn)定性的影響

1.3.7.1 pH值的影響

將制備的COB和POB分別稀釋3 倍制成油脂體乳液，分成9 份，分別加入到pH 3、4、5、6、7、8、9、10、11的緩沖溶液中，測(cè)定油脂體乳液的粒徑和Zeta電位[8,11]。

1.3.7.2 離子強(qiáng)度的影響

參照Iwanaga等[8]的方法，將制備的COB和POB分別用0、10、25、50、100、250 mmol/L NaCl溶液稀釋100 倍，靜置1 h后測(cè)定油脂體乳液的粒徑和Zeta電位。

1.3.7.3 溫度的影響

將制備的COB和POB分別稀釋100 倍，分成8 份，置于恒溫水浴鍋內(nèi)，使中心溫度分別達(dá)到30、40、50、60、70、80、90、100 ℃后保持加熱30 min，然后迅速冷卻至室溫后測(cè)定油脂體乳液的粒徑和Zeta電位。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS Statistics 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（P＜0.05，差異顯著），采用Origin Pro 2019軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆COB和POB組分分析

如表1所示，COB含水率更高，這可能是由于油脂體表面附著的較厚的蛋白質(zhì)層在離心期間阻礙了油脂體的進(jìn)一步聚集和濃縮，從而使其較POB保留了更多的水分。與POB相比，COB較POB具有更高的蛋白含量，這表明部分大豆蛋白附著在油脂體表面，隨油脂體被共同提取。

表1 大豆COB和POB組分Table 1 Major components of soybean COB and POB

由圖1可知，大豆POB蛋白由明顯的3 條條帶組成，24、17 kDa和16 kDa，均為大豆油體蛋白，而大豆COB除含有以上油體蛋白外還含有多種外源蛋白，主要是大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的亞基，以及一些過(guò)敏蛋白。油體蛋白具有延伸的中心疏水結(jié)構(gòu)域，根據(jù)分子模型，其形成兩個(gè)由轉(zhuǎn)彎區(qū)隔開(kāi)的α-螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)[12]，油體蛋白N末端和C末端結(jié)構(gòu)域與磷脂極性端締合，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與兩親性的表面活性劑的結(jié)構(gòu)類似，為油脂體提供了維持穩(wěn)定的界面活性[13-14]。除了由于兩親性蛋白質(zhì)錨定在油脂體界面上，界面網(wǎng)絡(luò)還可能通過(guò)靜電相互作用維持穩(wěn)定[15]。界面上的極性脂質(zhì)可以帶負(fù)電荷，并通過(guò)靜電吸引力與界面蛋白的堿性氨基酸殘基相互作用[16]。此外，外源蛋白可能存在蛋白酶和酯酶活性，對(duì)油脂體膜結(jié)構(gòu)酶解破壞，造成油脂體破乳。Zhao Luping等[17]也通過(guò)堿液洗滌去除了大豆油脂體表面附著的β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白和致敏蛋白（如Gly m Bd 30K），得到了完整的大豆POB。

圖1 大豆COB和POB蛋白電泳圖Fig. 1 Electropherograms of soybean COB and POB proteins

2.2 大豆COB和POB乳液穩(wěn)定性分析

油脂體乳液的穩(wěn)定性與油脂體之間靜電排斥和靜電吸引的平衡有關(guān)。乳滴的表面電荷量決定著乳滴間的斥力大小，而表面電荷的多少可以通過(guò)Zeta電位的絕對(duì)值反映[18]。如圖2所示，大豆COB和POB乳液的Zeta電位分別為（-35.03±0.60）、（-14.00±1.86） mV。油脂體膜由磷脂層和蛋白組成，油體蛋白是油脂體膜蛋白的主要組成部分[19]，其中部分疏水基團(tuán)會(huì)與油脂體內(nèi)部的甘油三酯接觸，而其N端和C端帶正電荷的氨基酸殘基與帶負(fù)電荷的磷脂通過(guò)鹽橋作用相結(jié)合而處于水相，構(gòu)成了大豆POB的電位體系。而大豆COB表面的外源蛋白可為其提供一定的負(fù)電荷，因此具有較POB更高的電位絕對(duì)值。Matsumura等[20]研究發(fā)現(xiàn)，這些外源蛋白的附著提高了大豆COB的表面電荷密度，增加了油脂體之間的靜電斥力，可能對(duì)其穩(wěn)定性有積極的作用。

圖2 大豆COB和POB的Zeta電位Fig. 2 Zeta potential of soybean COB and POB

粒徑大小也可以從一定程度上反映乳液的穩(wěn)定性，通常當(dāng)乳液粒徑分布越均一且粒徑越小時(shí)，乳液體系越穩(wěn)定。由圖3A可知，大豆COB和POB粒徑均呈現(xiàn)單峰分布，表明提取得到了較為均一的油脂體。由圖3B可知，大豆COB和POB的D4,3分別為（552.93±9.40）、（475.06±4.49）nm，COB呈現(xiàn)出顯著較大的D4,3。這可能是因?yàn)樵贑OB提取過(guò)程中部分大豆蛋白可能會(huì)通過(guò)疏水作用、靜電作用、氫鍵或二硫鍵與油脂體膜中的油體蛋白結(jié)合[1]，附著在油脂體膜上，從而增加了COB粒徑，而經(jīng)過(guò)多次堿液洗滌，這些外源蛋白可以溶解在堿液中而被去除，因此POB粒徑較小。Ishii等[10]測(cè)得大豆COB和POB的D4,3分別為（0.70±0.08）、（0.59±0.03）μm，與本研究結(jié)果相近。

圖3 大豆COB和POB的粒徑分布圖（A）和D4,3（B）Fig. 3 Particle size distribution (A) and D4,3 (B) of soybean COB and POB

澄清指數(shù)-時(shí)間變化曲線中，澄清指數(shù)越高則說(shuō)明乳液體系越不穩(wěn)定[21-22]。由圖4A、B可知，與大豆POB乳液相比，大豆COB乳液在離心過(guò)程中透光率變化較小，表明其穩(wěn)定性較好。同樣，由圖4C可以看出，大豆COB和POB乳液澄清指數(shù)在前期保持相對(duì)穩(wěn)定，但在20 min后急劇上升，表明兩者均發(fā)生了不同程度的失穩(wěn)；在失穩(wěn)過(guò)程中，POB乳液澄清指數(shù)始終高于COB乳液，這表明COB乳液體系在離心條件下具有更好的物理穩(wěn)定性。油脂體膜上的油體蛋白與磷脂相互作用，可以在油/水界面形成強(qiáng)大的彈性網(wǎng)絡(luò)保護(hù)油脂體[23]，而外源蛋白通過(guò)增加油脂體的電荷密度，提供了額外的靜電斥力，從而進(jìn)一步增加了油脂體的穩(wěn)定性。此外，外源蛋白增加了油脂體的空間位阻。有研究表明部分物質(zhì)和大豆的油脂體膜結(jié)合，可通過(guò)增加空間位阻而提高油脂體的乳化穩(wěn)定性[24]。

圖4 COB（A）和POB（B）穩(wěn)定性分析圖譜和透光率曲線（C）Fig. 4 Stability of COB (A) and POB (B) and light transmittance curves (C)

2.3 COB和POB流變學(xué)特性分析

從圖5可以看出，大豆COB和POB的黏度都表現(xiàn)出隨剪切速率升高而降低的趨勢(shì)，這個(gè)結(jié)果說(shuō)明大豆COB和POB均具有剪切稀化特性，為假塑性流體。當(dāng)剪切速率增大時(shí)，乳液體系中存在的比較散亂的粒子因?yàn)闀?huì)受到流層之間的剪應(yīng)力作用，而減少互相黏連和鉤掛，或發(fā)生旋轉(zhuǎn)滾動(dòng)進(jìn)而收縮成團(tuán)，于是表現(xiàn)為黏度降低的現(xiàn)象[25]。另外，在不同剪切速率下，大豆COB的黏度始終高于大豆POB，這可能是由于大豆COB中含有大量的外源蛋白，這些蛋白分子之間，以及蛋白分子與水之間可能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增加了大豆COB乳液的流動(dòng)阻力，從而使其黏度高于不含有外源蛋白的大豆POB乳液。

圖5 COB和POB的黏度隨剪切速率的變化曲線Fig. 5 Viscosity verses shear rate curves of COB and POB

G'代表材料貯存能量的能力，G″代表材料釋放能量的能力。從圖6A可以看出，在角頻率掃描測(cè)定過(guò)程中，大豆COB、POB的G'均高于G″。隨著角頻率的增大，大豆COB和POB的G'和G″逐漸增大，說(shuō)明大豆COB和POB的彈性和黏性都逐漸升高，均表現(xiàn)出黏彈性。此外，在不同角頻率下，大豆POB的G'和G″始終高于COB，說(shuō)明大豆POB內(nèi)部結(jié)構(gòu)可能較為緊密，在遭受變形后，具有更強(qiáng)的恢復(fù)能力。由圖6B可知，大豆COB和POB各組的tanδ都小于1。tanδ越大，體系中黏性成分比重較大，體系表現(xiàn)流體的特征；相反，tanδ值越小，體系中彈性成分越多，體系表現(xiàn)固體的特征[26-27]。相較于大豆POB，COB具有更高的tanδ值，這表明COB具有更好的黏彈性，這可能是由于COB中的外源蛋白附著在油脂體表面，為COB提供了額外的空間位阻，因此為油脂體之間的擠壓碰撞提供了緩沖?；谶@一特性，COB可以作為穩(wěn)定劑等功能性配料應(yīng)用于肉制品等食品加工產(chǎn)業(yè)。

圖6 大豆COB和POB的G'、G″（A）和tanδ（B）隨角頻率的變化曲線Fig. 6 Angular frequency-dependent curves of G', G″ (A) and tanδ (B) of soybean COB and POB

2.4 不同環(huán)境因素對(duì)大豆COB和POB乳液穩(wěn)定性的影響

2.4.1 pH值對(duì)大豆COB和POB乳液穩(wěn)定性的影響

由圖7可知，大豆COB和POB乳液的Zeta電位分別在pH 4.5和pH 5.5左右趨近于0 mV，表明兩者的等電點(diǎn)分別位于該值。大豆COB的等電點(diǎn)與大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白接近[28]，這表明COB較高的電荷量主要是由外源蛋白提供，也再次證實(shí)了COB表面附著有大量的大豆貯藏蛋白。此外，盡管多數(shù)POB乳液的Zeta電位絕對(duì)值低于COB乳液（除pH 4附近），即維持乳液穩(wěn)定的靜電作用力較小，但POB乳液電位隨pH值變化幅度較小，始終維持在-15～15 mV，這表明POB乳液相較于COB乳液受酸堿因素影響較小。Nikiforidis等[9]研究發(fā)現(xiàn)由于外源蛋白的存在，玉米胚芽COB在不同pH值下電位始終低于POB，這與本研究在大豆油脂體上的結(jié)果相似。

圖7 不同pH值下大豆COB和POB乳液的Zeta電位變化Fig. 7 Zeta potential of soybean COB and POB emulsions at different pH

由圖8可知，不管是大豆COB乳液，還是POB乳液，在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，其D4,3顯著小于等電點(diǎn)附近pH值的粒徑，這表明乳液在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)pH值時(shí)處在較為穩(wěn)定的狀態(tài)。結(jié)合圖9可知，大豆COB乳液在pH 4、5，POB乳液在pH 5、6時(shí)，出現(xiàn)沉淀和上浮現(xiàn)象，乳液失穩(wěn)，粒徑無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定，此時(shí)pH值接近油脂體等電點(diǎn)，說(shuō)明靜電斥力在維護(hù)油脂體乳液穩(wěn)定性中具有重要作用。有研究表明，靜電斥力較小會(huì)使乳液中的蛋白質(zhì)絮凝、聚集導(dǎo)致乳化性降低，而遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，靜電斥力提高，增加了蛋白的溶解性從而提高乳液的穩(wěn)定性[29]。Lawal等[30]認(rèn)為，隨酸堿度增加，蛋白質(zhì)逐漸變性，導(dǎo)致蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，更多疏水基團(tuán)指向油相，增強(qiáng)了與油相之間的作用，從而使乳液穩(wěn)定性有所上升。而Qi Baokun等[31]研究發(fā)現(xiàn)在堿性條件下，隨pH值增加大豆油脂體蛋白的β-折疊結(jié)構(gòu)數(shù)量增加，促進(jìn)了大豆油脂體的聚集。因此，在較高pH值下大豆油脂體的穩(wěn)定性變化有待進(jìn)一步探究。

圖8 不同pH值下大豆COB和POB乳液的D4,3（A、B）和粒徑分布圖（C、D）Fig. 8 D4,3 (A, B) and droplet size distribution (C, D) of COB and POB emulsions at different pH

圖9 不同pH值下大豆COB（A）和POB（B）乳液狀態(tài)Fig. 9 Pictures of COB (A) and POB (B) emulsions at different pH

2.4.2 離子強(qiáng)度對(duì)大豆COB和POB乳液穩(wěn)定性的影響

由圖10可知，隨著Na+濃度逐漸升高，大豆POB和COB乳液的Zeta電位絕對(duì)值逐漸減??；當(dāng)Na+濃度超過(guò)100 mmol/L后POB乳液的Zeta電位穩(wěn)定在-2 mV左右，當(dāng)Na+濃度達(dá)到250 mmol/L時(shí)Zeta電位絕對(duì)值降低到9.0 mV。與POB乳液相比，富含外源蛋白的COB乳液在Na+濃度變化的過(guò)程中，Zeta電位絕對(duì)值下降幅度較大且劇烈。由于組成油脂體膜的磷脂和蛋白質(zhì)在膜外側(cè)攜帶負(fù)電荷，同時(shí)，COB含有大量帶電蛋白質(zhì)，因此COB在中性提取環(huán)境中呈現(xiàn)更高負(fù)電性。而當(dāng)?shù)蜐舛鹊腘a+加入時(shí)，Na+與外層蛋白質(zhì)分子相結(jié)合，吸附在其表面，由于Na+攜帶正電荷，從而通過(guò)靜電屏蔽效應(yīng)降低了油脂體表面電荷，導(dǎo)致Zeta電位絕對(duì)值逐漸降低[18]。

圖10 不同Na+濃度下大豆COB和POB乳液的Zeta電位變化Fig. 10 Zeta potential of soybean COB and POB emulsions at different sodium concentrations

由圖11和12可知，大豆POB乳液在不同Na+濃度環(huán)境中，粒徑分布始終呈現(xiàn)單峰的穩(wěn)定狀態(tài)，且乳液呈現(xiàn)均一的乳白色；而COB乳液的D4,3隨著Na+濃度的增加快速增加，在Na+濃度為50 mmol/L時(shí)，可觀察到有沉淀生成，隨著Na+濃度的進(jìn)一步增加，出現(xiàn)嚴(yán)重的絮凝和沉淀。上述結(jié)果表明，在不同Na+濃度下，大豆POB乳液較COB乳液具有更高的穩(wěn)定性。Huang等[32]在提取番茄籽油脂體時(shí)，發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象，富含蛋白的番茄籽油脂體更易受陽(yáng)離子的影響而發(fā)生聚集。研究表明，陽(yáng)離子通過(guò)靜電屏蔽作用降低油脂體之間的靜電斥力，從而使油脂體容易發(fā)生絮凝[33]。此外，陽(yáng)離子可能與蛋白相互作用，改變它們的構(gòu)型并抑制蛋白質(zhì)間疏水相互作用，從而破壞油脂體膜結(jié)構(gòu)，影響油脂體乳液穩(wěn)定性[34]。

圖11 不同Na+濃度下大豆COB和POB乳液D4,3（A、B）和粒徑分布圖（C、D）Fig. 11 D4,3 (A, B) and droplest size distribution (C, D) of COB and POB emulsions at different sodium concentrations

圖12 不同Na+濃度下大豆COB（A）和POB（B）乳液狀態(tài)Fig. 12 Pictures of soybean COB (A) and POB (B) emulsions at different sodium concentrations

2.4.3 溫度對(duì)大豆COB和POB乳液穩(wěn)定性的影響

由圖13可知，不同溫度加熱對(duì)大豆POB乳液Zeta電位影響均較小，熱處理后仍帶負(fù)電荷，帶電性質(zhì)并沒(méi)有發(fā)生改變。大豆COB乳液經(jīng)過(guò)40 ℃處理后，Zeta電位絕對(duì)值隨著處理溫度的增加稍有下降，當(dāng)處理溫度為90 ℃時(shí)，電位絕對(duì)值達(dá)到最低值。電位絕對(duì)值的下降可能是由于熱處理改變了其外源蛋白構(gòu)象，使環(huán)境中的負(fù)電離子與其作用減弱，導(dǎo)致其表面電荷密度下降[35]。此外，研究表明，外源蛋白中含有磷脂酶，會(huì)水解磷脂生成帶負(fù)電的脂肪酸和脂活性物質(zhì)，部分負(fù)電性物質(zhì)附著在油脂體膜上，增加油脂體電荷密度[36]。經(jīng)過(guò)熱處理的油脂體Zeta電位絕對(duì)值比未經(jīng)過(guò)熱處理的Zeta電位絕對(duì)值小，可能是由于熱處理導(dǎo)致酶失活，減少了負(fù)電性物質(zhì)的生成，從而導(dǎo)致COB乳液Zeta電位絕對(duì)值下降。

圖13 不同溫度下大豆COB和POB乳液的Zeta電位變化Fig. 13 Zeta potential of soybean COB and POB emulsions at different temperatures

由圖14可知，30 ℃加熱30 min后大豆COB乳液的D4,3為（654.63±7.56）nm，100 ℃加熱30 min后為（426.73±6.33）nm，其D4,3總體隨熱處理溫度的上升顯著下降，且較大的聚集體在50 ℃以上加熱處理后消失，這可能是由于隨著溫度的升高，COB乳液體系活動(dòng)逐漸劇烈，原本發(fā)生聚集的小部分油脂體重新分散，導(dǎo)致其D4,3下降。而大豆POB乳液的D4,3隨溫度變化幅度較小，這表明大豆POB乳液相較于COB乳液具有更強(qiáng)的耐熱性，這與Zeta電位結(jié)果一致。由圖15可知，在不同溫度處理下COB和POB乳液的宏觀狀態(tài)并未發(fā)生改變。陳業(yè)明等[33]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)80 ℃熱處理，油脂體上外源蛋白明顯減少，油脂體的純度增加。大豆球蛋白的變性溫度為（90±2） ℃，β-伴大豆球蛋白的變性溫度為（70±2）℃，熱處理可能使外源蛋白變性脫落，導(dǎo)致COB的粒徑減小[37]。Chen Yeming等[38]研究發(fā)現(xiàn)熱處理可以鈍化大豆油脂體中脂肪酶活性，有利于油脂體的貯藏，防止油脂氧化，進(jìn)一步增加油脂體的穩(wěn)定性。

圖14 不同溫度下大豆COB和POB乳液的D4,3（A、B）和粒徑分布圖（C、D）Fig. 14 D4,3 (A, B) and droplet size distribution (C, D) of COB and POB emulsions at different temperatures

圖15 不同溫度下大豆COB（A）和POB（B）乳液狀態(tài)Fig. 15 Pictures of soybean COB (A) and POB (B) emulsions at different temperatures

3 結(jié) 論

通過(guò)水提法輔助去離子水洗滌或堿液洗滌，成功提取并得到蛋白組分具有明顯差異的大豆COB和POB。提取所得大豆POB只含有油體蛋白，而COB除含有油體蛋白外，還含有大量其他大豆蛋白，主要包括大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白和過(guò)敏蛋白。大豆COB和POB的D4,3分別為（552.93±9.40）nm和（475.06±4.49）nm，Zeta電位分別為（-35.03±0.60）mV和（-14.00±1.86）mV。COB和POB均具有剪切稀化特性，但在不同剪切速率下，大豆COB的黏性均高于POB，外源蛋白的存在改變了大豆油脂體的加工性能；此外，外源蛋白附著在COB上，形成了油脂體膜以外的第2層蛋白膜，并提供額外的電荷，導(dǎo)致COB粒徑和Zeta電位絕對(duì)值均大于POB。大豆POB中蛋白等電點(diǎn)位于pH 5.5左右，而大豆COB中蛋白等電點(diǎn)位于pH 4.5左右，此pH值也是大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的等電點(diǎn)。外源蛋白的存在導(dǎo)致大豆COB在酸堿環(huán)境下較POB更容易失穩(wěn)。大豆COB的D4,3隨Na+濃度增加迅速增大，并出現(xiàn)大量聚集，而大豆POB則更為穩(wěn)定，這可能是由于Na+會(huì)通過(guò)靜電屏蔽作用降低蛋白間的靜電斥力，而大量外源蛋白的存在導(dǎo)致COB更容易發(fā)生絮凝，穩(wěn)定性降低。熱處理過(guò)程中，大豆COB的D4,3隨熱處理溫度升高而降低，這可能是由于加熱導(dǎo)致外源蛋白變性脫落，但大豆COB和POB乳液在不同熱處理溫度下都呈現(xiàn)出了較好的穩(wěn)定性。