多組學(xué)技術(shù)探討GRAP2在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的潛在作用機(jī)制

王琳琳，鄧志敏，周林燕，楊靜，趙玉林，李龍飛*，程艷香*

(1．武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430060；2．深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

近年來(lái)隨著社會(huì)發(fā)展帶來(lái)的生活方式的改變、工作壓力的增大以及女性生育年齡的上升等因素，我國(guó)不孕不育患者的數(shù)量逐年增加。不孕不育已成為影響人類(lèi)發(fā)展與健康的全球性醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)問(wèn)題，嚴(yán)重干擾患者身心健康和家庭幸福，同時(shí)也給社會(huì)穩(wěn)定和醫(yī)療衛(wèi)生等諸多方面帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[1]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥，定義為發(fā)生于孕20周前、連續(xù)2次或2次以上的自然流產(chǎn)，其發(fā)病率占育齡女性的1%～5%[2]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因極其復(fù)雜，除染色體異常外，生殖道解剖因素、感染性疾病、內(nèi)分泌紊亂、自身免疫疾病、高凝傾向、心理及環(huán)境因素等均有可能導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生[3]。然而，仍有近半數(shù)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者病因不明[4]。本文擬結(jié)合多組學(xué)技術(shù)及生物信息學(xué)手段探討復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的可能機(jī)制，為臨床診療提供新思路。

資料與方法

一、研究對(duì)象

在NCBI(National center for biotechnology)的公共GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索含有人源復(fù)發(fā)性流產(chǎn)早孕期絨毛樣本信息的數(shù)據(jù)芯片，下載可用數(shù)據(jù)集(GSE43256、GSE73025、GSE22490)作為分析對(duì)象。GSE43256芯片信息：Illumina Human Methylation27 BeadChip，平臺(tái)是GPL8490，該芯片中包含10例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)早孕期絨毛組織和10例正常早孕期絨毛組織的甲基化數(shù)據(jù)；GSE73025芯片信息：Exiqon miRCURY LNA microRNA array，平臺(tái)是GPL20917，包含5例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和5例健康女性早孕期絨毛組織的miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)；GSE22490芯片信息：Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，平臺(tái)是GPL570，包含4例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)早孕期胎盤(pán)組織和6例健康女性胎盤(pán)組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。

二、方法

1.關(guān)鍵基因的篩選：通過(guò)R包(GEOquery、limma、dplyr、tidyverse)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校對(duì)、數(shù)據(jù)ID轉(zhuǎn)換及分析。不同數(shù)據(jù)集采用不同的|log2FC|進(jìn)行篩選，主要是考慮在獲取足夠數(shù)量數(shù)據(jù)的同時(shí)，盡量讓|log2FC|保持較高的值。GSE43256篩選的標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|>0.1[5-6]，GSE73025篩選的標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|>1.5，GSE22490篩選的標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|>0.5，全部數(shù)據(jù)為調(diào)準(zhǔn)后P<0.05。GSE73025篩選獲得的差異miRNA經(jīng)miRWalk(http：//mirwalk. umm.uni-heidelberg.de/)、miRDB(http：//www. mirdb.org/)和Diana Tools(http：//diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php)網(wǎng)站，進(jìn)行目標(biāo)mRNA的配對(duì)，并取3個(gè)網(wǎng)站數(shù)據(jù)的交集，得到GSE73025數(shù)據(jù)集關(guān)鍵的mRNA信息。最后，GSE43256、GSE73025和GSE22490的差異分子取交集(Vennny 2.1.0)[5,7-8]，得到GRB2相關(guān)銜接蛋白2(GRB2-related adapter protein 2，GRAP2)。

2.關(guān)鍵基因的qPCR驗(yàn)證：為了驗(yàn)證目的基因的表達(dá)水平，本研究納入2018—2021年于深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心就診的21例早孕期自然流產(chǎn)女性，其中包括3例復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者及18例早孕期健康妊娠但由于個(gè)人原因選擇行人流手術(shù)的患者(患者夫妻雙方及胎兒均染色體正常)。采集蛻膜及絨毛組織，提取組織總RNA(Qiagen RNeasy Plus Mini Kit，Qiagen，德國(guó))，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行定量分析(PrimeScript RT Reagent Kit，Takara，日本；Luna Universal qPCR Master Mix，NEB，美國(guó))。actin前向引物：5′-GCCTTTGCCGATCCGC-3′；actin反向引物：5′-GCCGTAGCCGTTGTCG-3′。GRAP2前向引物：5′-GGCCGCCTGCACAACA-3′；GRAP2反向引物：5′-GAAGAGTTTATCGGGTCATGGG-3′。數(shù)據(jù)以actin作為內(nèi)參，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算，并進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

3.關(guān)鍵基因的信息獲?。和ㄟ^(guò)Human protein atlas(https：//www.proteinatlas.org/)和GeneCards(https：//www.genecards.org/)獲取GRAP2的組織、細(xì)胞表達(dá)水平及亞細(xì)胞定位。通過(guò)String(https：//string-db.org/)獲取GRAP2前10的互作蛋白。通過(guò)UCSC(http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)獲取GRAP2的基本信息，包括基因ID、轉(zhuǎn)錄本信息、蛋白ID等，并通過(guò)GeneCards獲取GRAP2的突變信息，進(jìn)一步采用SnapGene(版本4.1.9)和DOG(版本2.0)軟件，分別繪制GRAP2外顯子序列及蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)PDB(https：//www.rcsb.org/)獲得。

4.基因突變對(duì)轉(zhuǎn)錄本及蛋白結(jié)構(gòu)的影響：采用varSEAK(https：//varseak.bio/)和Mutation Taster(https：//www.mutationtaster.org/)分別預(yù)測(cè)GeneCards中獲得的GRAP2基因突變位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)錄本剪切、蛋白結(jié)構(gòu)的影響，及是否造成疾病。varSEAK中對(duì)轉(zhuǎn)錄本剪切的預(yù)測(cè)等級(jí)，分為1～5，等級(jí)越高，代表影響轉(zhuǎn)錄本剪切的概率越高。Mutation Taster中對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響：PhyloP值介于-15～6之間，越高越保守，越高對(duì)蛋白的影響越大；Phast Cons值介于0～1之間，越高越保守，越高對(duì)蛋白的影響越大。

結(jié) 果

一、數(shù)據(jù)處理與關(guān)鍵分子獲取

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，按照“Recurrent miscarriage + Homo sapiens + Series”的條目搜索后得到14個(gè)GSE數(shù)據(jù)集，剔除非復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)合并其他疾病、非絨毛組織、非早孕期標(biāo)本、原始數(shù)據(jù)不全等數(shù)據(jù)，得到可用數(shù)據(jù)集3個(gè)(GSE43256、GSE73025、GSE22490)(圖1A)。在|log2FC|>0.1且調(diào)整后P<0.05的條件下，從數(shù)據(jù)集GSE43256中共得到1 690個(gè)DNA甲基化差異表達(dá)基因。|log2FC|>1.5且調(diào)整后P<0.05的條件下，GSE73025得到48個(gè)差異表達(dá)的miRNA，進(jìn)一步通過(guò)miRWalk、miRDB和Diana Tools得到差異表達(dá)miRNA的互作mRNA，取交集得到1 828個(gè)關(guān)鍵mRNA。|log2FC|>0.5且調(diào)整后P<0.05的條件下，GSE22490得到110個(gè)差異表達(dá)mRNA。將上述3個(gè)數(shù)據(jù)集取交集后得到關(guān)鍵分子GRAP2(圖1B、C)。

二、GRAP2的表達(dá)及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位

Human protein atlas的數(shù)據(jù)顯示，在蛋白層面，GRAP2主要表達(dá)于胎盤(pán)組織及免疫細(xì)胞富集的器官，包括扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟等(圖2A)；在母胎界面，GRAP2具體表達(dá)于絨毛(圖2B)和蛻膜(圖2C)，并且在內(nèi)膜組織(圖2D)中也有表達(dá)；在RNA層面，GRAP2除了高表達(dá)于免疫細(xì)胞富集的器官，還在血液淋巴細(xì)胞中也有豐富的表達(dá)，特別是T細(xì)胞(圖2E)。有趣的是，在胎盤(pán)組織中，GRAP2主要表達(dá)于纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞(圖2F)。

組學(xué)原始數(shù)據(jù)顯示，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛組織中GRAP2存在高甲基化現(xiàn)象，且靶miRNA表達(dá)水平升高。胎盤(pán)組織含有絨毛組織及蛻膜組織，組學(xué)數(shù)據(jù)顯示復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者胎盤(pán)組織GRAP2的表達(dá)水平升高。本研究qPCR數(shù)據(jù)顯示，與正常對(duì)照組相比，自然流產(chǎn)患者蛻膜組織顯著高表達(dá)GRAP2(P=0.034 6)，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者蛻膜組織的GRAP2表達(dá)水平亦有升高的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與正常對(duì)照組相比，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛的GRAP2表達(dá)水平有下降的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，相反，自然流產(chǎn)患者絨毛的GRAP2表達(dá)水平顯著升高(P=0.002 3)(圖2G、H)。

A：原始GEO數(shù)據(jù)集的獲?。籅、C：GRAP2的獲取。

GRAP2的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位數(shù)據(jù)顯示，GRAP2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有高表達(dá)(圖3A、B)。

三、GRAP2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

String的數(shù)據(jù)顯示，GRAP2前10的互作蛋白包括跟T細(xì)胞免疫功能相關(guān)的分子，如LCP2、LAT、ZAP70、CD28、FYB和CD4，還包括與細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的分子，如PLCG1、SHC1、MAP4K1和CBL(圖4、表1)。與GRAP2相關(guān)的主要通路(表2)也主要集中在跟T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的通路(T cell receptor signaling pathway、TCR signaling、ICos-ICosL pathway in T-helper cell和CD28 co-stimulation)及與細(xì)胞增殖分化、血管新生相關(guān)的通路(RET signaling)。

四、GRAP2基因突變對(duì)轉(zhuǎn)錄本及蛋白結(jié)構(gòu)的影響

UCSC的數(shù)據(jù)顯示，GRAP2的轉(zhuǎn)錄本NM_004810(ENST00000344138.9)總的外顯子為8個(gè)，編碼外顯子為7個(gè)(圖5A)。GeneCards的突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)，有4個(gè)落在外顯子區(qū)域(圖5B)，分別是：c.834G>A(p.Ala278=)、c.739G>A(p.Gly247Ser)、c.466C>T(p.Arg156Trp)和c.801C>G(p.Leu267=)。其中，c.834G>A(p.Ala278=)位于蛋白結(jié)構(gòu)域SH3中(圖5C)。GRAP2的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5D。

varSEAK和Mutation Taster的數(shù)據(jù)顯示，GRAP2的上述突變不會(huì)影響轉(zhuǎn)錄本的剪切(圖6)，但c.834G>A(p.Ala278=)、c.466C>T(p.Arg156Trp)和c.801C>G(p.Leu267=)很可能會(huì)引起蛋白結(jié)構(gòu)改變，并導(dǎo)致疾病的發(fā)生(表3)。

A：GRAP2在不同組織中的蛋白表達(dá)水平；B～D：GRAP2在絨毛組織、蛻膜組織及內(nèi)膜組織中的定位表達(dá)；E：GRAP2在不同組織及血液細(xì)胞中的RNA表達(dá)水平；F：GRAP2在胎盤(pán)細(xì)胞中的RNA表達(dá)水平；G：GRAP2在正常蛻膜組織(NP-D)、自然流產(chǎn)蛻膜組織(SM-D)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)蛻膜組織(RM-D)中的RNA表達(dá)水平；H：GRAP2在正常絨毛組織(NP-F)、自然流產(chǎn)絨毛組織(SM-F)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)絨毛組織(RM-F)中的RNA表達(dá)水平。A～F：數(shù)據(jù)來(lái)源Human Protein Atlas。

A：數(shù)據(jù)來(lái)源GeneCards(大數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)模式圖)；B：數(shù)據(jù)來(lái)源Human Protein Atlas(免疫熒光實(shí)驗(yàn)；3種腫瘤細(xì)胞系分別為：A-431、HEL和U-251-MG)。

圖4 GRAP2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

表1 GRAP2互作蛋白的功能介紹

表2 GRAP2蛋白主要相關(guān)通路

A：GRAP2基因及蛋白信息表；B：GRAP2外顯子展示及相應(yīng)的突變位點(diǎn)(采用SnapGene軟件繪制)；C：GRAP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及突變位點(diǎn)展示(采用DOG軟件繪制)；D：GRAP2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)展示(數(shù)據(jù)來(lái)源PDB)。

圖6 GRAP2基因突變對(duì)轉(zhuǎn)錄本剪切的影響(varSEAK網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果)

表3 GRAP2基因突變對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響及對(duì)疾病的預(yù)測(cè)(Mutation Taster網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果)

討 論

本研究通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索得到與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)早孕期絨毛標(biāo)本相關(guān)的3個(gè)GSE數(shù)據(jù)集，通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選到關(guān)鍵分子GRAP2。GRAP2調(diào)控細(xì)胞的增殖分化，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[9]，并且GRAP2作為一種銜接蛋白，參與白細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)[10]，介導(dǎo)免疫細(xì)胞包括T、B、NK細(xì)胞等的免疫應(yīng)答[11]。GRAP2包含一個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域，兩側(cè)是SH3結(jié)構(gòu)域[12]，該蛋白質(zhì)通過(guò)其SH3結(jié)構(gòu)域與其他蛋白質(zhì)相互作用。因此，c.834G>A(p.Ala278=)位于蛋白結(jié)構(gòu)域SH3中，該突變對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)及功能影響的可能性較高。但是，GRAP2的突變位點(diǎn)(c.466C>T(p.Arg156Trp)和c.801C>G(p.Leu267=))即使不在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中，也可能影響蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生；并且即使GRAP2的突變位點(diǎn)不影響轉(zhuǎn)錄本的剪切位點(diǎn)，但由于翻譯過(guò)程中氨基酸的改變，也會(huì)導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終影響疾病的發(fā)生發(fā)展。GRAP2基因突變對(duì)疾病的影響，提示GRAP2在生命過(guò)程中發(fā)揮的重要作用。

GRAP2的表達(dá)水平與其甲基化水平呈負(fù)相關(guān)[13]。GRAP2在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)女性的絨毛組織中呈現(xiàn)高甲基化水平，且其上游miRNA(miR-4667-3p)高表達(dá)，均提示其在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛中低表達(dá)。我們的PCR數(shù)據(jù)也顯示，GRAP2基因在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的絨毛中有表達(dá)下降的趨勢(shì)，而自然流產(chǎn)組GRAP2表達(dá)顯著上升，可能是自然流產(chǎn)與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的疾病差異導(dǎo)致的。此外，組學(xué)數(shù)據(jù)中復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者胎盤(pán)組織GRAP2的表達(dá)水平升高，提示蛻膜組織可能高表達(dá)GRAP2，我們的數(shù)據(jù)也顯示GRAP2在自然流產(chǎn)及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的蛻膜中均有升高的趨勢(shì)。GRAP2與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，但在其他領(lǐng)域，有報(bào)道顯示，子癇前期患者與正常妊娠女性相比，產(chǎn)后血液中GRAP2高甲基化，并且與T細(xì)胞免疫紊亂相關(guān)[14]。孕期高NO2暴露也被報(bào)道與產(chǎn)后新生兒血液中GRAP2高甲基化水平相關(guān)[15]。Lin等[16]的報(bào)道顯示，妊娠期糖尿病小鼠的后代心臟組織中GRAP2低表達(dá)，并且與T細(xì)胞功能紊亂相關(guān)。原發(fā)性免疫血小板減少癥患者外周血Treg細(xì)胞中miR-4667-3p表達(dá)上調(diào)[17]。GRAP2在血液中主要表達(dá)于T細(xì)胞，并且其許多生物學(xué)功能也與T細(xì)胞的免疫應(yīng)答相關(guān)。但是，GRAP2在母胎界面主要表達(dá)于纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，這可能與GRAP2在細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮作用相關(guān)，同時(shí)也提示GRAP2可能通過(guò)調(diào)控絨毛組織中巨噬細(xì)胞的免疫功能來(lái)發(fā)揮作用。

本研究提示，早孕期絨毛組織中GRAP2基因的高甲基化水平或者其上游miR-4667-3p的上調(diào)，均可能下調(diào)絨毛GRAP2的表達(dá)，并且蛻膜組織中GRAP2的異常高表達(dá)，均可能干擾免疫應(yīng)答或抑制胎兒細(xì)胞的增殖、分化、遷移等過(guò)程，導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生。另外，GRAP2基因的突變可能通過(guò)影響蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。GRAP2有望作為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診療的潛在靶點(diǎn)，但相關(guān)機(jī)制有待開(kāi)展深入的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。