基于單精子SNP單體型的1例遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥患者植入前遺傳學(xué)檢測(cè)

鄧天勤，謝雨莉，江旋，焦淑靜，連文昌，李雪梅*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，深圳 518028；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，深圳 518028；3.蘇州億康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司，蘇州 215021)

遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥(hereditary spherocytosis，HS)是一種紅細(xì)胞膜蛋白缺陷導(dǎo)致的遺傳性溶血性疾病[1]，以北歐和北美地區(qū)發(fā)病率最高，達(dá)1/2 000[2]，在國內(nèi)成人HS的發(fā)病率約1/100 000[3]。HS的臨床表現(xiàn)具有個(gè)體差異性，從無癥狀到輕、中及重度貧血，主要癥狀為貧血、黃疸、脾腫大和膽石癥；脾切除是治療HS的最有效方法[4-5]。

目前發(fā)現(xiàn)與HS相關(guān)的編碼紅細(xì)胞膜蛋白的基因有5個(gè)，以ANK1 基因(OMIM 612641)發(fā)生突變最常見[6]。ANK1基因定位于8號(hào)染色體p11.21，其編碼的蛋白稱為錨蛋白。ANK1基因突變所致的HS主要為顯性遺傳，約占75%，其中ANK1基因突變中有15%～20%為新生突變或無家族史[7]。對(duì)于有HS家族史的夫婦，可選擇單基因病植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing for monogenetic disease，PGT-M)生育健康子代。為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免因等位基因脫扣(allele drop-out，ADO)、基因重組等因素所導(dǎo)致的診斷不明，目前臨床上普遍采用致病基因變異位點(diǎn)的直接檢測(cè)聯(lián)合基于第二代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)的連鎖分析技術(shù)[8]。針對(duì)家系成員不全的情況或針對(duì)新發(fā)變異患者，則可以利用攜帶致病突變的極體或者單個(gè)精子或胚胎作為連鎖分析的依據(jù)[9]。

本研究基于基因芯片檢測(cè)分析單精子SNP單體型方法，為1例因ANK1基因c.3641delC新發(fā)突變導(dǎo)致的HS男性患者構(gòu)建單體型，并為患者夫婦提供了PGT-M準(zhǔn)確有效的檢測(cè)，結(jié)果呈現(xiàn)如下。

資料與方法

一、研究對(duì)象

先證者，男性，30歲，因貧血10年，行脾切除術(shù)后20年，行孕前遺傳咨詢。全外顯子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，先證者攜帶ANK1基因c.3641delC雜合突變，其父母均未攜帶相同變異。在人類外顯子數(shù)據(jù)庫、參考人群千人基因組和人群基因組突變頻率數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)該突變，且該突變?yōu)橐拼a突變，依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南[10]，提示該位點(diǎn)為致病變異(PVS1+PM2+PP4)。為阻斷致病基因的垂直傳遞，先證者夫婦在我院經(jīng)遺傳學(xué)咨詢后，選擇應(yīng)用單精子SNP單體型進(jìn)行PGT-M。本研究征得了先證者夫婦充分的知情同意，并通過了醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查(LLYJ2022-056-030)。

二、研究方法

1.突變位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)和體系建立：先證者為HS患者，檢測(cè)診斷報(bào)告顯示突變基因?yàn)锳NK1基因c.3641delC雜合突變，考慮為新發(fā)突變，需設(shè)計(jì)能夠在外周血基因組DNA(genomic DNA，gDNA)和單精子全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification，WGA)產(chǎn)物都能夠得到擴(kuò)增的突變檢測(cè)體系，使用PrimerPremier5軟件設(shè)計(jì)該突變位點(diǎn)的引物，并通過多次PCR反應(yīng)調(diào)試出穩(wěn)定檢測(cè)突變的反應(yīng)體系。

2.SNP位點(diǎn)選擇和檢測(cè)體系設(shè)計(jì)：根據(jù)歐洲人類生殖及胚胎學(xué)會(huì)發(fā)布的指南以及胚胎植入前遺傳學(xué)診斷篩查技術(shù)的專家共識(shí)的要求[11-12]，利用Illumina公司Asian Screening Array(ASA)基因芯片對(duì)樣本基因組范圍內(nèi)SNP檢測(cè)，共檢測(cè)659 184位點(diǎn)。根據(jù)指南要求在患者突變基因的上下游1 Mb范圍內(nèi)，選擇至少2個(gè)可分析位點(diǎn)進(jìn)行分析，同時(shí)擴(kuò)展上游2 Mb、下游1 Mb范圍內(nèi)分析位點(diǎn)進(jìn)行SNP單體型分析，保證上下游有充足可用的SNP位點(diǎn)用于單倍體連鎖分析。

3.單精子獲取和WGA擴(kuò)增：將冷凍精液(不加精子保護(hù)液)解凍混勻，梯度稀釋500倍左右，使用顯微鏡在100×鏡下觀察，視野內(nèi)1～10個(gè)單細(xì)胞為最佳挑取濃度，一共分離50份單精子，分離好的單精子使用基于多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)原理的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒(KT110700150，蘇州億康)[13]，進(jìn)行單精子的WGA擴(kuò)增。由于分離過程有可能取到多條精子，因此單精子的WGA產(chǎn)物，最終通過位點(diǎn)驗(yàn)證、拷貝數(shù)變異(copy number variation，CNV)及SNP確定是否成功分離單個(gè)精子。

4.家系樣本和單精子突變位點(diǎn)檢測(cè)：收集患者夫婦雙方的外周血，提取gDNA，和單精子WGA產(chǎn)物作為模板，使用方法1中設(shè)計(jì)的突變位點(diǎn)引物和反應(yīng)體系，進(jìn)行男方新發(fā)突變的位點(diǎn)檢測(cè)，復(fù)核男方突變位點(diǎn)，以及女方是否為野生型，同時(shí)查看每個(gè)單精子的突變攜帶情況，選取單精子WGA產(chǎn)物的基因突變位點(diǎn)驗(yàn)證為突變或者野生型的樣本(初步判定為單精子)，繼續(xù)做CNV和SNP單體型構(gòu)建。

5.單精子CNV建庫、NGS和分析：使用單精子樣本的WGA產(chǎn)物(突變或無突變位點(diǎn)的)為模板，按照基因測(cè)序文庫試劑盒(XK-038-48，序康)說明書進(jìn)行，完成單精子CNV文庫的制備。文庫混合后使用illumina Nextseq550測(cè)序儀進(jìn)行SE55測(cè)序方式完成測(cè)序。CNV數(shù)據(jù)使用億康開發(fā)的ChromGo生信分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，明確為單倍體的單精子樣本再進(jìn)行SNP的文庫構(gòu)建和ASA基因芯片測(cè)定，分別挑選3個(gè)以上的野生型和突變型的單精子樣本開展SNP的檢測(cè)，構(gòu)建有效的SNP單體型。

6.家系樣本和單精子樣本的SNP擴(kuò)增、文庫制備以及ASA基因芯片檢測(cè)：使用家系樣本gDNA和單精子樣本的WGA產(chǎn)物(突變或無突變位點(diǎn)的)為模板，再進(jìn)行DNA擴(kuò)增、DNA片段化、片段產(chǎn)物純化、重懸DNA、雜交、芯片洗滌、延伸和染色、上機(jī)掃描，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得相應(yīng)SNP位點(diǎn)信息。

7.SNP連鎖分析：使用億康開發(fā)的ChromGo生信分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。選取男女方標(biāo)本以及突變型和野生型的單精子SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建有效的SNP單體型，用于后續(xù)協(xié)助胚胎攜帶情況的診斷。

8.胚胎PGT-M的檢測(cè)(含診斷和篩查)：選擇形態(tài)學(xué)較好的囊胚進(jìn)行活檢，取3～5個(gè)左右的滋養(yǎng)層細(xì)胞，活檢細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有5 μl裂解液的專用采集管(XK-043，序康)，使用基于MALBAC原理的基因測(cè)序通用樣本處理試劑盒(XK-028-24，序康)[13]，進(jìn)行囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的WGA擴(kuò)增。使用相同的分析軟件ChromGo進(jìn)行CNV和SNP的連鎖分析。

9.羊水檢測(cè)：抽取先證者妻子孕中期羊水10 ml，用試劑盒提取gDNA后，進(jìn)行母源污染排查、突變位點(diǎn)檢測(cè)以及核型分析，通過Sanger測(cè)序檢測(cè)胎兒攜帶ANK1基因c.3641delC雜合突變致病變異的情況。

結(jié) 果

一、單精子的WGA檢測(cè)結(jié)果

一共挑取40份編號(hào)為SSYC1～40單精子進(jìn)行WGA擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳條帶主要集中在200～2 000 bp，呈現(xiàn)典型的彌散狀條帶(圖1)，濃度在13～25 ng/μl，符合WGA擴(kuò)增的質(zhì)控預(yù)期。

除了2號(hào)和3號(hào)泳道的SSYC40單精子樣本為WGA擴(kuò)增失敗，其他13號(hào)、31號(hào)和39號(hào)泳道可能是挑取轉(zhuǎn)管等原因?qū)е?，其?5份精子樣本均擴(kuò)增成功。

二、先證者夫妻雙方和部分單精子的突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

先證者男方為胚系突變攜帶，女方為野生型，單精子SSYC07和SSYC10攜帶ANK1基因c.3641delC突變；單精子SSYC16和SSYC18不攜帶ANK1基因c.3641delC突變(圖2)。

圖1 單精子WGA擴(kuò)增電泳驗(yàn)證圖

三、部分單精子的CNV結(jié)果

單精子的檢測(cè)判斷標(biāo)準(zhǔn)是染色體為23，X或23，Y，而且SNP檢測(cè)均為純合位點(diǎn)。SSYC07、SSYC16和SSCY18為23，Y的單精子染色體拷貝數(shù)結(jié)果，SSYC10為23，X的單精子染色體拷貝數(shù)結(jié)果(圖3)。

圖3 單精子CNV結(jié)果

四、先證者夫妻雙方及單精子的SNP分析

選取男方雜合、女方純合的SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析，一共30個(gè)可用位點(diǎn)，結(jié)合單精子SSYC07、SSYC10、SSYC16、SSYC18的SNP結(jié)果，可以得出30個(gè)SNP位點(diǎn)的單體型結(jié)果，足夠用于單體型構(gòu)建。分析精子突變位點(diǎn)上游2 Mb及下游2 Mb總共407個(gè)SNP位點(diǎn)，突變型單精子SNP位點(diǎn)共有43個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生ADO，ADO率為10.56%；野生型單精子SNP共有30個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生ADO，ADO率為7.37%，均符合PGT-M指南對(duì)于SNP位點(diǎn)分析要求。隱馬爾科夫的SNP單體型連鎖圖展示了部分上下游可用位點(diǎn)(各15個(gè))，藍(lán)色rs號(hào)為突變位點(diǎn)上游可用位點(diǎn)，黃色rs號(hào)為突變位點(diǎn)下游可用位點(diǎn)(圖4)。

五、胚胎PGT-M的檢測(cè)結(jié)果(含診斷和篩查)

一共獲得了4枚胚胎，進(jìn)行PGT-M檢測(cè)后，結(jié)果顯示2枚胚胎不攜帶父源突變(WYN01、WYN03)，4枚胚胎為46，XN胚胎(WYN01、WYN02、WYN03、WYN04)，綜合分析WYN01和WYN03號(hào)兩枚胚胎為可移植胚胎(表1)。其中胚胎平均SNP可用位點(diǎn)數(shù)(1 Mb范圍內(nèi))9以上(表2)，且胚胎的突變位點(diǎn)檢測(cè)(圖5)和SNP單體型分析均一致(圖6)。

■：患病男性，攜帶突變；○：正常女性，不攜帶突變；◇：性別未知，不攜帶突變；◆：患病，性別未知，攜帶突變；spm：單精子樣本；pat：父源單體型；mat：母源單體型；*：ADO；0：缺失數(shù)據(jù)；數(shù)字：距離基因上下游的相對(duì)距離(單位Kb)；左側(cè)SNP位點(diǎn)：藍(lán)色和黃色代表基因所在染色體位置上游或下游的 SNP 位點(diǎn)；單體型內(nèi)部的斜杠：左斜杠為與女方突變位點(diǎn)連鎖的SNP單體型，右斜杠為與男方突變位點(diǎn)連鎖的SNP單體型。

表1 胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果

表2 SNP分型連鎖分析結(jié)果

紅色框示突變位點(diǎn)。

六、產(chǎn)前診斷結(jié)果

2022年2月22日女方移植WYN01囊胚1枚，確認(rèn)成功妊娠后，于18周左右抽取胎兒羊水樣本提取DNA，進(jìn)行染色體核型、染色體微陣列分析及Sanger測(cè)序明確胎兒是否攜帶染色體變異及致病變異。2022年5月13日結(jié)果提示胎兒染色體核型及染色體微陣列分析正常，且未攜帶父源ANK1基因c.3641delC突變(圖7)，表明成功阻斷該新發(fā)突變的遺傳。

■：患病男性，攜帶突變；○：正常女性，不攜帶突變；◇：性別未知，不攜帶突變；◆：患病，性別未知，攜帶突變；spm：單精子樣本；pat：父源單體型；mat：母源單體型；*：ADO；0：缺失數(shù)據(jù)；數(shù)字：距離基因上下游的相對(duì)距離(單位Kb)；左側(cè)SNP位點(diǎn)：藍(lán)色和黃色代表基因所在染色體位置上游或下游的SNP位點(diǎn)；單體型內(nèi)部的斜杠：左斜杠為與女方突變位點(diǎn)連鎖的SNP單體型，右斜杠為與男方突變位點(diǎn)連鎖的SNP單體型。

箭頭示突變位點(diǎn)。

討 論

HS是一種常見的遺傳性溶血性疾病，其發(fā)病機(jī)制是基因突變導(dǎo)致紅細(xì)胞膜蛋白缺陷，主要致病基因有5種：ANK1、SLC4A1、SPTA1、SPTB和EPB42[14]。75%的HS為常染色體顯性遺傳，子代發(fā)病概率為50%，PGT-M是阻斷該疾病遺傳的有效途徑之一。ANK1基因突變中有15%～20%為新生突變或無家族史，這對(duì)PGT-M的連鎖分析提出了挑戰(zhàn)，無法按照常規(guī)的檢測(cè)流程進(jìn)行連鎖分析，增加了臨床開展PGT-M檢測(cè)的難度[15]。同時(shí)，在PGT-M過程中，擴(kuò)增失敗、優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增、ADO、樣本污染等因素均可導(dǎo)致誤診或診斷不明[16]，ADO的發(fā)生率為10%～20%[17]。目前為降低誤診風(fēng)險(xiǎn)的策略是聯(lián)合使用突變位點(diǎn)的直接測(cè)序和SNP連鎖分析[9]。

目前應(yīng)用于PGT的主要有兩種芯片技術(shù)：比較基因組雜交芯片(array comparative genome hybridization，aCGH)及SNP，SNP芯片技術(shù)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)片段重復(fù)缺失或非整倍體的同時(shí)，還可以檢測(cè)單倍體以及多倍體異常。本研究采用ASA基因芯片方法，以突變型和野生型的單精子SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建有效的SNP單體型，協(xié)助胚胎攜帶情況的篩查和診斷。通過對(duì)4枚胚胎進(jìn)行CNV、SNP單體型以及突變位點(diǎn)檢測(cè)，結(jié)果顯示兩枚胚胎為可移植胚胎；孕中期羊水檢查證實(shí)胎兒未攜帶致病變異，有效阻斷HS致病突變基因的遺傳。國內(nèi)呂遠(yuǎn)等[18]通過NGS構(gòu)建單精子SNP單體型在軟骨發(fā)育不良患者的應(yīng)用，篩選2枚未攜帶致病基因胚胎，羊水驗(yàn)證胎兒未攜帶致病突變基因，成功阻斷致病基因的遺傳，其ADO為12.5%。Shi等[19]采用同樣的方法對(duì)PKD1基因新發(fā)突變的常染色體顯性遺傳多囊腎患者行PGT-M，目前已出生2名未攜帶致病基因小孩。而本研究采用基因芯片方法，構(gòu)建精子SNP單體型，與上述研究構(gòu)建精子SNP單體型不一樣，ADO率為10.56%。單精子SNP單體型也應(yīng)用于其他新發(fā)突變的單基因疾病中，如脊髓性肌肉萎縮癥[20]、成骨不全癥[21-21]、馬方綜合征[23]和血紅蛋白H病[24]；同時(shí)也應(yīng)用于羅氏易位男性患者，成功篩選出正常胚胎[25]。也有報(bào)道應(yīng)用高通量測(cè)序多SNP單體型連鎖分析技術(shù)區(qū)分?jǐn)y帶或不攜帶親代羅氏易位染色體的胚胎，從而篩查出染色體正常的胚胎，幫助患者生育染色體正常的嬰兒[26]。

本研究采用的方法與常規(guī)的PGT-M相比較，有過程復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長以及構(gòu)建單精子SNP單體型檢測(cè)費(fèi)用較高的不足之處。在缺乏先證者或新發(fā)突變單基因疾病通過鏈讀測(cè)序構(gòu)建單體型的方法，不需要精子或極體，只需患者外周血，較本研究方法更簡單、SNP位點(diǎn)更豐富、應(yīng)用范圍更廣，且本研究采用的方法只能在男性患者中應(yīng)用[27]。

綜上，針對(duì)無家族史，新發(fā)突變的HS男性患者，因缺乏先證者，無法進(jìn)行連鎖分析，可采用基因芯片方法，構(gòu)建單精子SNP單體型，結(jié)合CNV及突變位點(diǎn)檢測(cè)，篩查未攜帶致病突變的胚胎，阻斷致病基因垂直傳遞。這也為其他新發(fā)突變常染色體顯性遺傳的單基因疾病的男性患者，在PGT-M過程中提供一種檢測(cè)方法，可提高PGT-M的準(zhǔn)確性。