應(yīng)用低分子肝素對≥2次著床失敗患者妊娠結(jié)局的影響

姚文，遠(yuǎn)孝瓊，姚青云，覃丹俞，李倪捷，黃勇，李豫峰

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，武漢 453000)

2018年一項包含18 571對夫婦的橫斷面研究顯示，中國育齡婦女中不孕癥的患病率為15.5%，在有生育意向的人群中則高達(dá)25%[1]。輔助生殖技術(shù)(ART)作為治療不孕不育疾病的重要手段，在近30年取得了極大進(jìn)步。但胚胎著床依然是制約活產(chǎn)的關(guān)鍵因素，提高患者的著床率仍然是一大挑戰(zhàn)。

低分子肝素(LMWH)是通過用不同的化學(xué)或酶法裂解肝素獲得的平均分子量在4 500～5 000 Da、范圍在1 000～10 000 Da的肝素鹽。因其更安全有效且更可控而逐漸取代肝素廣泛應(yīng)用于臨床[2]。LMWH具有抗凝抗栓作用，主要用于靜脈血栓、心血管疾病和缺血性中風(fēng)以及炎癥性疾病[3]。此外，LMWH還可以通過與多種蛋白相互作用調(diào)控胚胎著床和發(fā)育的生理過程[4]。

多次著床失敗的患者中出現(xiàn)獲得性或遺傳性血栓形成傾向的概率遠(yuǎn)高于正?；颊遊5-6]。一項Meta分析顯示，LMWH可顯著提高多次著床失敗患者的活產(chǎn)率[7]。但另一項Meta分析則表明，LMWH對妊娠結(jié)局沒有明顯影響[8]。使用LMWH是否會改善多次著床失敗患者的妊娠結(jié)局目前還需要進(jìn)一步證實(shí)。

雖然反復(fù)著床失敗(RIF)指3次及以上優(yōu)質(zhì)胚胎移植著床失敗[9]，但在臨床上2次著床失敗患者即開始使用LMWH的情況比較常見，為了明確LMWH對≥2次著床失敗患者妊娠結(jié)局的影響，遂進(jìn)行本項研究，以期為臨床上多次著床失敗患者的診療提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

本研究為回顧性隊列研究，納入對象為2018年1月至2020年12月于我院生殖醫(yī)學(xué)中心行凍融胚胎移植(FET)助孕患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者有2次及以上著床失敗史；(2)均行FET。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)LMWH用藥時間不足1月；(2)夫妻雙方任何一方染色體異常；(3)供精或供卵周期；(4)有黃體轉(zhuǎn)換但最終未移植；(5)失訪。

按照納排標(biāo)準(zhǔn)，共納入2 140個解凍周期(1 547例患者)。根據(jù)是否使用LMWH分為LMWH組(n=182)和未使用LMWH的對照組(n=1 958)。本研究經(jīng)同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會審批通過(倫理批號：TJ-IRB20210956)。

二、研究方法

1.促排卵方案：根據(jù)患者情況主要采用激動劑方案、拮抗劑方案及其他方案進(jìn)行促排卵。激動劑方案于月經(jīng)周期第2天給予促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，達(dá)必佳，輝凌制藥，德國或達(dá)菲林，博福益普生，法國)3.75 mg，拮抗劑方案于月經(jīng)周期第2天給予促性腺激素釋放激素拮抗劑(GnRH-ant,抑那通，武田藥品，日本)3.75 mg，30 d后給予起始劑量的卵泡刺激素(FSH，麗申寶，珠海麗珠或果納芬，默克雪蘭諾，德國)(通常為150～300 U/d)，根據(jù)患者的身高、體重、卵巢反應(yīng)、卵泡大小及數(shù)目等調(diào)整用量。當(dāng)出現(xiàn)2個以上卵泡直徑≥18 mm或3個以上卵泡直徑≥17 mm時給予人絨毛膜促性腺激素(HCG，艾澤，默克雪蘭諾，德國)10 000 U肌肉注射，34～36 h后進(jìn)行取卵。

2.胚胎培養(yǎng)及FET：獲卵后采用常規(guī)體外受精(IVF)/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)授精，16～18 h后觀察受精情況，并將正常受精的合子繼續(xù)培養(yǎng)至卵裂胚或囊胚。胚胎根據(jù)患者情況遵循醫(yī)生建議及患者意愿進(jìn)行凍存或鮮胚移植。根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會實(shí)驗室學(xué)組共識[10]、Istanbul共識[11]和Gardner囊胚評分體系[12]將胚胎(包括卵裂胚和囊胚)分為優(yōu)質(zhì)胚胎、中等胚胎和劣質(zhì)胚胎。將未移植的優(yōu)質(zhì)胚胎和中等胚胎進(jìn)行玻璃化凍存。轉(zhuǎn)化內(nèi)膜3或5 d后快速解凍胚胎，放入胚胎復(fù)蘇液(GMOPS Plus，Vitrolife，瑞典)中5 min后轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液(G2，Vitrolife，瑞典)中1～3 h后行FET。解凍后的胚胎存活總細(xì)胞數(shù)>50%認(rèn)為胚胎復(fù)蘇成功。

3. FET前內(nèi)膜準(zhǔn)備及黃體支持給藥方法：對照組僅給予常規(guī)黃體轉(zhuǎn)化和黃體支持，所用方法同既往研究[13]。具體方案為月經(jīng)第2天開始按遞增法口服戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，拜耳，德國)至內(nèi)膜厚度達(dá)到7 mm及以上且雌激素作用時間不少于10 d時，給予黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)肌肉注射，40 mg/次，1次/d，轉(zhuǎn)化內(nèi)膜。移植后繼續(xù)黃體支持直至測定血清HCG水平。LMWH組從解凍周期黃體轉(zhuǎn)化日起一并給予那屈肝素鈣注射液(速碧林，ASPEN Notre Dame de Bondeville，法國)皮下注射，4 100 U/次，1次/d或磺達(dá)肝癸鈉注射液(澤瑞妥，江蘇恒瑞)皮下注射，2.5 mg/次，1次/d，至B超下見到胎心搏動后停藥。

4. 結(jié)果評價及隨訪：胚胎移植后12～14 d后測定血清HCG水平，血清HCG>10 U/L為HCG陽性。對于HCG陽性患者，28 d后行經(jīng)陰道B超檢查，B超探及孕囊存在為臨床妊娠，孕囊數(shù)目為著床胚胎數(shù)目。對臨床妊娠的患者電話隨訪至產(chǎn)后6周。

5. 觀察指標(biāo)：主要結(jié)局指標(biāo)為活產(chǎn)率(活產(chǎn)周期數(shù)/總周期數(shù)×100%)；次要結(jié)局指標(biāo)包括：HCG陽性率(HCG陽性周期數(shù)/總周期數(shù)×100%)，著床率(B超下妊娠囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%)，臨床妊娠率(臨床妊娠周期數(shù)/總周期數(shù)×100%)，流產(chǎn)率(妊娠28周前流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%)，異位妊娠率(異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者基本資料及胚胎移植情況比較

LMWH組和對照組患者的年齡、不孕年限、不孕因素、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、移植胚胎類型等比較均無顯著性差異(P>0.05)。LMWH組的基礎(chǔ)FSH和移植日子宮內(nèi)膜厚度顯著高于對照組，而基礎(chǔ)竇卵泡計數(shù)(AFC)則顯著低于對照組(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者基礎(chǔ)資料及胚胎移植情況比較[(-±s)，n(%)]

續(xù)表

二、LMWH對妊娠結(jié)局的影響

兩組患者的活產(chǎn)率比較無顯著性差異(P>0.05)；LMWH組的HCG陽性率、著床率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率均顯著高于對照組(P<0.01)；對照組有12個周期(1.31%)發(fā)生異位妊娠，LMWH組無異位妊娠發(fā)生，因樣本數(shù)相差較大，未行統(tǒng)計學(xué)分析(表2)。多因素GEE回歸分析發(fā)現(xiàn)，LMWH[OR=2.13，95%CI(1.40，3.22)]、年齡[OR=1.08，95%CI(1.03，1.12)]、不孕類型[OR=1.89，95%CI(1.36，2.63)]、移植胚胎數(shù)目[OR=0.56，95%CI(0.40，0.77)]和移植胚胎類型[OR=0.71，95%CI(0.58，0.87)]是流產(chǎn)率的獨(dú)立影響因素(P<0.001)；年齡[OR=0.93，95%CI(0.91，0.95)]、移植日內(nèi)膜厚度[OR=1.09，95%CI(1.02，1.17)]、不孕類型[OR=0.72，95%CI(0.59，0.88)]、移植胚胎數(shù)目[OR=1.76，95%CI(1.45，2.14)]、移植胚胎類型[OR=1.81，95%CI(1.59，2.07)]、移植胚胎質(zhì)量[OR=0.75，95%CI(0.67，0.84)]是活產(chǎn)率的獨(dú)立影響因素(P<0.01)(表3)。

表2 兩組患者妊娠結(jié)局的比較(%)

三、PSM后LMWH對妊娠結(jié)局的影響

為減少兩組樣本量差異過大產(chǎn)生的偏倚，根據(jù)1∶2的比例進(jìn)行PSM，匹配后所有變量的絕對標(biāo)準(zhǔn)均值差均小于0.1(圖1)。匹配后LMWH組納入182個解凍周期，對照組納入364個解凍周期。PSM后兩組患者的妊娠結(jié)局比較顯示，兩組的活產(chǎn)率仍無顯著性差異(P>0.05)；LMWH組的HCG陽性率、著床率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率仍顯著高于對照組(P<0.05)；結(jié)果與匹配前一致(表4)。

表3 兩組患者流產(chǎn)率和活產(chǎn)率的GEE分析

圖1 PSM前后協(xié)變量的絕對標(biāo)準(zhǔn)均值差變化

表4 PSM后兩組患者妊娠結(jié)局的比較(%)

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)LMWH可顯著提高患者的HCG陽性率、著床率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率(P<0.05)，但兩組的活產(chǎn)率并無顯著差異(P>0.05)，推測LMWH雖可以提高臨床妊娠率，但因流產(chǎn)率也相應(yīng)升高，故最終活產(chǎn)率并無顯著差異。

LMWH對多次移植失敗患者妊娠結(jié)局的影響目前還存在爭議。一項隨機(jī)開放性研究發(fā)現(xiàn)，≥2次移植失敗的患者使用LMWH后的活產(chǎn)率比對照組高8%(n=150)，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)[15]。Lodigiani等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，≥2次移植失敗的患者使用LMWH后的妊娠率顯著高于對照組(P<0.05)，遺憾的是文中并沒有把活產(chǎn)率作為結(jié)局指標(biāo)。另一項隨機(jī)對照研究(RCT)同樣發(fā)現(xiàn)，使用LMWH后的RIF患者活產(chǎn)率、著床率和臨床妊娠率顯著升高，流產(chǎn)率顯著降低(P<0.05)；但因該研究樣本量較小(n=83)，且LMWH組僅1人流產(chǎn)，對照組僅2人流產(chǎn)，故流產(chǎn)率的組間差異可能存在一定的偏倚[17]。熊正方等[18]對RIF患者開展的研究也表明，使用LMWH可以增加臨床妊娠率。Berker等[19]對207例≥2次移植失敗患者進(jìn)行的RCT研究并沒有發(fā)現(xiàn)LMWH對患者的妊娠結(jié)局存在顯著影響；但這一研究僅限于新鮮周期移植的患者，而多次移植失敗的患者往往更傾向于解凍周期移植。另一項多中心回顧性隊列研究的結(jié)果同樣認(rèn)為，使用LMWH并沒有改善≥2次移植失敗患者的妊娠結(jié)局[20]；但該研究未把活產(chǎn)率作為最終結(jié)局指標(biāo)且未對相關(guān)混雜因素進(jìn)行調(diào)整。此外，還有一些無移植失敗史或僅移植失敗1次的研究也顯示，LMWH并不能改善移植患者的妊娠結(jié)局[21-22]。由于各個研究的異質(zhì)性較大，用藥人群、用藥時間和方式等都不盡相同，因此，還需要更高等級的證據(jù)進(jìn)一步探究LMWH對多次移植失敗患者妊娠結(jié)局的影響。

目前關(guān)于LMWH影響妊娠的機(jī)制研究仍較少。Qublan等[5]發(fā)現(xiàn)，68.9%的3次及以上著床失敗患者至少存在一項遺傳或獲得性血栓形成傾向的危險因素，而移植1次就成功妊娠的患者中這一概率僅為25.6%。對使用LMWH患者的子宮進(jìn)行血流動力學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，LMWH可以降低子宮動脈血流阻力，增加子宮灌注，從而營造有利于胚胎著床的子宮環(huán)境[23]。免疫調(diào)節(jié)在這一過程中也可能起重大作用[24]。有研究表明，LMWH可以改變RIF患者Th-1相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)免疫耐受[25]。此外，LMWH還可以與L-選擇素、鈣粘素、肝素結(jié)合性表皮生長因子(HB-EGF)、胰島素樣生長因子Ⅰ/Ⅱ(IGF-Ⅰ/Ⅱ)、白介素(IL)-1、IL-6、白血病抑制因子(LIF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等胚胎著床相關(guān)分子相互作用[4]，從而調(diào)控胚胎著床過程。LMWH影響著床及妊娠的具體機(jī)制目前尚不明確，血栓形成傾向、子宮血流灌注、免疫調(diào)節(jié)等均有可能在其中發(fā)揮作用，具體作用機(jī)制還需要更進(jìn)一步的研究探討。

本研究中LMWH組的流產(chǎn)率顯著升高(P<0.05)，推測其原因是一些可能發(fā)生生化妊娠的胚胎在LMWH使用后雖然成功著床但并不能順利發(fā)育。但該推測尚需要進(jìn)一步的臨床及機(jī)制研究加以證實(shí)。

本研究聚焦于LMWH使用對≥2次移植失敗患者妊娠結(jié)局的影響，更貼近于臨床上LMWH在多次移植失敗患者中應(yīng)用的情況。同時，本研究只納入了用藥超過1個月即具有良好依從性的患者，減少了患者不規(guī)律用藥可能造成的偏倚；并且通過PSM及GEE對樣本量和年齡、BMI等多個混雜因素進(jìn)行調(diào)整，減少了多周期移植及相關(guān)混雜因素對結(jié)果造成的影響。

本研究為回顧性隊列研究，仍然存在一些局限性：首先，本研究未對所有患者血栓前狀態(tài)進(jìn)行檢測，血栓前狀態(tài)及一些其他可能被忽略的潛在混雜因素可能影響妊娠結(jié)局；第二，本研究中兩組樣本量差異過大，可能會影響最終結(jié)果，因此按照1∶2的比例進(jìn)行了PSM來減少樣本量差異引起的偏倚；第三，本研究為單中心研究，結(jié)論的外推性還需要進(jìn)一步確定；最后，本研究未對藥物使用不良反應(yīng)等情況進(jìn)行隨訪記錄，這可能對臨床最終決策產(chǎn)生影響。

綜上所述，LMWH可以提高≥2次胚胎移植失敗患者的HCG陽性率、著床率、臨床妊娠率及流產(chǎn)率，但活產(chǎn)率并未明顯提高。LMWH對妊娠結(jié)局的影響還需要進(jìn)一步的RCT加以證實(shí)。臨床醫(yī)生在應(yīng)用LMWH來改善≥2次胚胎移植失敗患者的妊娠結(jié)局時需要關(guān)注其增高流產(chǎn)率的風(fēng)險。