CTCF通過抑制p53信號通路促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲

閆晗，石培培，王亞會，高成明，周鋼橋,

(1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002； 2.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

肝臟膽管細(xì)胞癌(cholangiocarcinoma, CCA)簡稱膽管癌,是一種源于肝臟膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，占所有原發(fā)性肝癌(primary liver cancer, PLC)的10%～15%[1].近年來，在全球范圍內(nèi)膽管癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2].中國是世界上膽管癌發(fā)病率最高的國家之一，膽管癌嚴(yán)重危害國民的生命和健康[3].不同地區(qū)膽管癌的風(fēng)險因素差異較大，主要風(fēng)險因素包括肝吸蟲感染、膽總管囊腫、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染、肝結(jié)石和原發(fā)性硬化性膽管炎等[4].早期的膽管癌患者首選手術(shù)切除.然而，大多數(shù)診斷為膽管癌的患者已處于晚期，因此長期預(yù)后較差，3年生存率低于15%[5]，即使部分患者能夠?qū)嵤┦中g(shù)切除，術(shù)后復(fù)發(fā)的概率仍然很高.因此，研究膽管癌的發(fā)生發(fā)展過程，探索膽管癌相關(guān)分子的腫瘤生物學(xué)功能及其致病機(jī)制，對于提高膽管癌的防診治水平具有重要意義.

CCCTC 結(jié)合因子(CCCTC-binding factor, CTCF)是1990年被發(fā)現(xiàn)的一種真核轉(zhuǎn)錄因子[6-7]，其在哺乳動物遺傳進(jìn)化中高度保守.在人體中，CTCF位于染色體16q22.1[8]，編碼包含700個氨基酸的蛋白質(zhì)，主要包含1個N端結(jié)構(gòu)域、1個鋅指結(jié)構(gòu)域和1個C端結(jié)構(gòu)域[9-10].作為鋅指多功能蛋白，CTCF具有獨(dú)特的分子功能，廣泛參與基因調(diào)控的多個方面，主要包括轉(zhuǎn)錄抑制或激活[11-12]、隔離[13-14]、沉默或增強(qiáng)子[15]、基因印跡[16-17]和X染色體失活[18]等.已有研究表明，CTCF與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且在不同種類的腫瘤中具有功能異質(zhì)性，發(fā)揮著促癌基因或抑癌基因的作用.例如，CTCF在乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中顯著低表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞系MCF7中發(fā)揮抑制細(xì)胞生長的作用[19]；CTCF在前列腺癌中發(fā)生基因組拷貝數(shù)缺失[20]，并發(fā)揮抑癌基因的作用.與之相反的是，CTCF在肝癌中卻作為原癌基因，可通過調(diào)控FOXM1(forkhead box protein M1)的表達(dá)進(jìn)而影響肝癌的生長和轉(zhuǎn)移[21]；在結(jié)直腸癌中，CTCF可通過p53信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長[22].然而，CTCF在膽管癌進(jìn)展中發(fā)揮何種生物學(xué)功能迄今尚未被報道.因此，本研究旨在通過評價CTCF對膽管癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲能力的影響，探究其下游調(diào)控的信號通路，以期初步揭示CTCF在膽管癌進(jìn)展中的功能和潛在的作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

膽管上皮細(xì)胞系HIBEpiC；膽管癌細(xì)胞系QBC939、RBE、HCCC-9810、HuCCT1；人胚腎細(xì)胞系HEK293T.

1.1.2 質(zhì)粒載體

用于CTCF基因過表達(dá)的慢病毒載體pECMV-3×Flag-puro購自北京淼靈生物科技有限公司；靶向CTCF基因的shRNA片段由華大基因合成；用于病毒包裝的質(zhì)粒為psPAX2和pMD2.G.

1.1.3 抗體

CTCF抗體(1∶1 000(體積比，下同), # 3418S, Cell Signal Technology)；GAPDH抗體(1∶1 000, A01020, Abbkine)；p53抗體(1∶1 000, sc-393031, Santa Cruz Biotechnology)；p21抗體(1∶1 000, # 2947S, Cell Signal Technology)；羊抗兔二抗(1∶2 000, BS13278, Bioworld Technology)；羊抗鼠二抗(1∶2 000, BS12478, Bioworld Technology).

1.1.4 主要試劑

細(xì)胞培養(yǎng)所需的DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle Medium, DMEM)培養(yǎng)基購自北京細(xì)工生物科技公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶和胎牛血清FBS(foetal bovine serum, FBS, 201172, AusGeneX)購于北京榮夏生物科技公司；一抗稀釋液(P0023A)購于碧云天生物技術(shù)有限公司；RIPA(強(qiáng))細(xì)胞/組織蛋白裂解液、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒和SDS-PAGE濃縮膠緩沖液均購于康為世紀(jì)生物有限公司；蛋白酶抑制劑購于羅氏制藥有限公司；PBS緩沖液購于莫納生物有限公司.

1.1.5 主要儀器

高壓蒸汽滅菌鍋(YAMATO)；二氧化碳恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)；生化純水儀(Thermo Fisher)；光學(xué)顯微鏡(Nikon)；生物潔凈工作臺(北京哈東聯(lián))；高速離心機(jī)(Eppendorf 5810R)；振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚)；磁力加熱攪拌器(賽格捷)；電熱水浴鍋(長風(fēng))；PCR儀(Eppendorf)；微孔光柵酶標(biāo)儀(TECAN)；Wb電泳及轉(zhuǎn)印儀(Bio-RAD)；化學(xué)發(fā)光成像儀(Tanon)；凝膠成像儀(Tanon)和移液器(Eppendorf)等.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)所用完全培養(yǎng)基均為含體積分?jǐn)?shù)10% FBS和體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的DMEM，所有細(xì)胞系的培養(yǎng)條件均為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2，并保持一定的濕度.

1.2.2 載體構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找CTCF基因的全序列片段(NM_001191022)，通過PCR擴(kuò)增CTCF基因CDS區(qū)的全長序列，通過雙酶切法將其改構(gòu)至pECMV-3×Flag-puro慢病毒過表達(dá)載體上.擴(kuò)增引物：正向5′-CCGGAATTCATGGAAGGTGATGCAGTCGAAGCCA-3′；反向5′-CGCGGATCCCCGGTCCATCATGC-TGAGGATCA-3′.載體經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α后，挑取若干個單克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行測序.測序驗(yàn)證正確的過表達(dá)質(zhì)粒保存于-20 ℃待用.本課題組合成了2條特異性靶向CTCF的shRNA片段：shCTCF-1片段5′-GATCCGTGGACGATACCCAGATTATACTTCCTGTCAGATATAATCTGGGTATCGTCCACTTTTTG-3′；shCTCF-2片段5′-GATCCACGTGTCCACGGCGTTCAAATCTTCCTGTCAGAATTTGAACGCCGTGGACACGTTTTTTG-3′.然后通過退火形成雙鏈，連接至慢病毒載體pGreen中，測序驗(yàn)證正確后保存于-20 ℃待用.

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及慢病毒包裝

將HEK293T細(xì)胞用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰酶消化、離心，按照70%的密度接種于6 cm小皿中培養(yǎng).將目的質(zhì)粒、病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G按質(zhì)量比3∶2∶1(總質(zhì)量為12 μg)混合，然后在Lip2000(LipofectamineTM2000 Transfection Reagent, 11668-027, Invitrogen)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞.6～8 h后更換含血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基.轉(zhuǎn)染后48～72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用0.45 μm濾器過濾后按照體積比1∶5加入病毒濃縮液，4 ℃過夜.次日，4 ℃、4 500 r/min離心30 min，去除上清液，加入1 mL無雙抗培養(yǎng)基溶解，-80 ℃保存待用.將細(xì)胞RBE和HCCC-9810按照50%密度鋪6孔板，細(xì)胞貼壁后，在8 μg/mL的polybrene介導(dǎo)下利用慢病毒感染細(xì)胞，6～8 h后更換無雙抗的完全培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)72 h，然后加入5 μg/mL的嘌呤霉素篩選慢病毒感染的陽性細(xì)胞.擴(kuò)大培養(yǎng)后收取蛋白進(jìn)行表達(dá)鑒定.

1.2.4 蛋白質(zhì)提取及蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting, Wb)實(shí)驗(yàn)

膽管癌組織及癌旁組織經(jīng)液氮研磨后，按照1∶20的體積比加入適量的組織蛋白抽提液，冰上充分裂解30 min，并每5 min渦旋震蕩1次；提取培養(yǎng)細(xì)胞的蛋白，經(jīng)胰酶消化后收集等量的對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，用PBS洗2次，加入含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，置于冰上充分裂解30 min.裂解完成后，4 ℃下將細(xì)胞裂解混合液12 000 r/min離心10 min.吸取蛋白上清混合液轉(zhuǎn)移至新管中，與等體積的2×上樣緩沖液混合均勻，沸水煮沸10 min后-20 ℃保存待用.配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SDS-PAGE膠，將蛋白樣品加入分離膠加樣孔，恒壓80 V進(jìn)行凝膠電泳，當(dāng)?shù)鞍讟悠分袖宸铀{(lán)跑至分離膠底層1～2 cm時停止電泳.用濕轉(zhuǎn)法將蛋白從SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，恒流200 mA轉(zhuǎn)膜約2 h.TBST清洗硝酸纖維素膜2次，每次5 min.利用TBST配制含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 %脫脂奶粉的封閉液，將硝酸纖維素膜室溫封閉1 h，然后用TBST洗膜2 min.用蛋白抗體稀釋液孵育膜，4 ℃冰箱搖晃過夜.一抗孵育結(jié)束后，用TBST洗脫3次，每次5 min.用HRP標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗稀釋液室溫孵育1～2 h.TBST洗脫3次，每次5 min.將發(fā)光試劑A液和B液等體積混勻后孵育硝酸纖維素膜，充分反應(yīng)后放于成像儀(Tanon 5200)中進(jìn)行曝光，記錄并分析結(jié)果.

1.2.5 細(xì)胞CCK-8檢測實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、離心和重懸后進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照2 000/孔將細(xì)胞種植于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，然后置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2恒溫箱中培養(yǎng).細(xì)胞貼壁后，每孔加入90 μL的空DMEM和10 μL的CCK-8試劑混合液，37 ℃孵育1 h，然后取90 μL的上清液檢測OD450值，持續(xù)監(jiān)測5～7 d.

1.2.6 平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

消化、收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，按照1 000/孔將細(xì)胞種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中.將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài).2～4周后，待平板細(xì)胞克隆形成，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%結(jié)晶紫溶液染色，輕緩清洗多余染料，避免細(xì)胞克隆脫落，晾干后采集數(shù)據(jù)，分析結(jié)果.

1.2.7 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞消化、收集并種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后吸棄完全培養(yǎng)基，更換為空DMEM饑餓處理12 h.然后采用胰酶消化收集細(xì)胞，用空DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并計(jì)數(shù).選擇細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)專用的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在Transwell遷移小室上層每200 μL細(xì)胞重懸液(空DMEN重懸)加入6 × 104個細(xì)胞，下層加入800 μL的體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清培養(yǎng)基，檢測細(xì)胞遷移能力.24～36 h后，取出小室用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定15 min，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%結(jié)晶紫溶液染色10 min.最后用清水及棉簽洗去多余的結(jié)晶紫染料及未遷移的小室內(nèi)細(xì)胞，室溫晾干后對其進(jìn)行圖像采集并計(jì)數(shù).

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的基本步驟同上述的細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，不同之處在于所使用的Transwell小室內(nèi)多了一層基質(zhì)膠，用以模仿細(xì)胞外基質(zhì)，所鋪細(xì)胞量為上述細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)的2倍，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～48 h后取出小室固定、染色、清洗、拍照和計(jì)數(shù).

1.2.8 實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)

按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取.然后，取500 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以2 μL cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，引物如下：CTCF，正向5′-CAAGCTGAAAAGGCACATGA-3′，反向5′-TGTGTCACAGTGGGGAC-AGT-3′；p53，正向5′-GCGAGCACTGCCCAACAACA-3′，反向5′-GG-ATCTGAAGGGTGAAATATTCT-3′；p21，正向5′-ACTCTCAGGGTCGAAAACGG-3′，反向5′-GATGTAGAGCGGGCCTTTGA-3′；GAPDH，正向5′-CG-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，反向5′-TCTCAGCCTTGACGGTGCCA-3′.所有樣本均設(shè)3個重復(fù)，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)對照，使用△△Ct法對mRNA的定量結(jié)果進(jìn)行歸一化處理.所有的PCR實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行熔解曲線分析，以排除非特異性擴(kuò)增.

1.2.9 通路富集分析

為探索CTCF在肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞中的功能機(jī)制，下載了臨床腫瘤蛋白質(zhì)組分析聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫(clinical proteomics tumor analysis consortium ,CPTAC)中膽管癌的mRNA測序數(shù)據(jù)集(n=255).使用DEseq2(v1.26.0)進(jìn)行基因表達(dá)值標(biāo)準(zhǔn)化以及批間差效應(yīng)的校正，根據(jù)CTCF基因mRNA測序讀段數(shù)的中值(5613)分為高表達(dá)(>5613，n=127)和低表達(dá)(≤5613，n=128)2組.隨后，采用NetworkAnalyst(v2019)軟件在CCA數(shù)據(jù)集中篩選高、低表達(dá)2組間差異基因(差異倍數(shù)>1.2，錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.05)，共得到428個顯著差異表達(dá)的基因.以428個基因作為輸入進(jìn)行Panther通路富集分析.此外，還使用全部轉(zhuǎn)錄組表達(dá)矩陣作為輸入進(jìn)行了基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA).使用分子圖譜數(shù)據(jù)庫(molecular signatures database，MSigDB，v 7.0)定義GSEA分析的通路基因集，并對基因集進(jìn)行1 000次置換檢驗(yàn)以計(jì)算統(tǒng)計(jì)量，錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.05的通路為顯著富集的通路.通路富集分析的結(jié)果通過qRT-PCR和Wb實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證.

1.2.10 臨床相關(guān)性分析

為探索CTCF基因在肝內(nèi)膽管癌組織中的異常表達(dá)情況及其與膽管癌病人預(yù)后的相關(guān)性，收集了國際癌癥基因組圖譜計(jì)劃(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中的膽管癌(cholangiocarcinoma，CHOL，包括36個癌組織和9個癌旁組織)和高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus database，GEO)中GSE107943數(shù)據(jù)集(包括30個癌組織和27個癌旁組織)的RNA測序數(shù)據(jù)，并下載了TCGA-CHOL的臨床生存數(shù)據(jù).根據(jù)癌組織中CTCF基因mRNA表達(dá)的中值(10.51)分為高表達(dá)(≥10.51、n= 18)和低表達(dá)(<10.51、n= 18)2組，首先比較了這2個數(shù)據(jù)集中CTCF在癌和癌旁組織間的差異表達(dá)情況，并進(jìn)一步根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)集的膽管癌組織中CTCF基因mRNA表達(dá)的中值(10.51)分為高表達(dá)(≥10.51、n=18)和低表達(dá)(<10.51、n=18)2組，分析了CTCF的表達(dá)與患者總體生存期和無病生存期的相關(guān)性.

1.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0和GraphPad(v6)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.實(shí)驗(yàn)組間數(shù)據(jù)的比較采用Student’s t檢驗(yàn).CTCF基因在癌和癌旁組織間的mRNA差異表達(dá)分析采用GraphPad軟件(v6)的Mann-Whitney U檢驗(yàn).Kaplan-Meier法用于繪制生存曲線，2組間生存率的差異分析采用GraphPad中的Log-rank檢驗(yàn).所有表型實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)中，P<0.05視為具有顯著性意義.

2 結(jié)果

2.1 CTCF在膽管癌組織及膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)

首先，對配對的膽管癌組織和癌旁組織進(jìn)行了CTCF蛋白表達(dá)水平的檢測，Wb檢測顯示，在隨機(jī)選取的12例膽管癌患者中，CTCF在10對膽管癌組織(T)中的表達(dá)均明顯高于配對的癌旁組織(圖1a).其次，檢測膽管上皮細(xì)胞和膽管癌細(xì)胞系中CTCF的表達(dá)，結(jié)果顯示，CTCF在膽管癌細(xì)胞系RBE、HCCC-9810、QBC939和HuCCT1中的表達(dá)明顯高于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞系HIBEpiC(圖1b).這些結(jié)果提示，CTCF可能在膽管癌中發(fā)揮癌基因的功能.

a.膽管癌組織及其配對癌旁組織中CTCF蛋白表達(dá)水平的檢測(N.癌旁組織；T.膽管癌組織)；b.肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞HIBEpiC，膽管癌細(xì)胞系RBE、HCCC-9810、QBC939和HuCCT1中CTCF表達(dá)的檢測(采用CTCF抗體進(jìn)行Wb檢測，GAPDH為內(nèi)參)圖1 Wb檢測膽管癌組織及膽管癌細(xì)胞系中CTCF的表達(dá)Fig.1 Wb detects the expression of CTCF in cholangiocarcinoma tissue and cholangiocarcinoma cell lines

2.2 CTCF對膽管癌細(xì)胞生長能力的影響

采用慢病毒包裝的方法構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)CTCF的膽管癌細(xì)胞株，采用轉(zhuǎn)染特異性靶向CTCF的shRNA構(gòu)建穩(wěn)定敲低CTCF的膽管癌細(xì)胞株，采用Wb實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CTCF的過表達(dá)和敲低效果.結(jié)果顯示，在HCCC-9810和RBE細(xì)胞中，與對照組(Vector)相比，過表達(dá)(3 × Flag-CTCF)組中CTCF的蛋白表達(dá)水平顯著增加，證明成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)CTCF的細(xì)胞株(圖2a)；與對照組(shCtrl)相比，敲低組(shCTCF-1和shCTCF -2)中CTCF的蛋白表達(dá)水平顯著降低，證明成功抑制了內(nèi)源性CTCF的表達(dá)(圖2b).

隨后，采用CCK-8法評價了CTCF對膽管癌細(xì)胞生長能力的影響.結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)CTCF可顯著促進(jìn)HCCC-9810(圖2c)和RBE(圖2e)細(xì)胞的生長能力，而敲低CTCF則顯著抑制HCCC-9810(圖2d)和RBE(圖2f)細(xì)胞的生長能力.此外，還通過細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)以檢測CTCF對膽管癌細(xì)胞克隆生長能力的影響.結(jié)果顯示，過表達(dá)CTCF可顯著促進(jìn)HCCC-9810和RBE細(xì)胞的克隆生長能力(圖2g)，而敲低CTCF則顯著抑制HCCC-9810和RBE細(xì)胞的克隆生長能力(圖2h).這些結(jié)果表明，CTCF可顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的生長能力.

a-b.HCCC-9810和RBE細(xì)胞中對照組(Vector)和過表達(dá)組(3×Flag-CTCF)、對照組(shCtrl)和敲低組(shCTCF-1及shCTCF-2)中CTCF蛋白表達(dá)水平的檢測；c-f.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)或敲低CTCF對膽管癌細(xì)胞HCCC-9810和RBE生長的影響；g-h.平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)或敲低CTCF對膽管癌細(xì)胞HCCC-9810和RBE克隆形成能力的影響圖2 CTCF對膽管癌細(xì)胞生長能力的影響Fig.2 Effect of CTCF on the cholangiocarcinoma cells growth ability

2.3 CTCF對膽管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

為評價CTCF是否影響膽管癌細(xì)胞系的遷移及侵襲能力，在膽管癌細(xì)胞HCCC-9810和RBE中穩(wěn)定過表達(dá)或敲低CTCF，進(jìn)而采用不同的Transwell小室進(jìn)行遷移和侵襲實(shí)驗(yàn).結(jié)果顯示，過表達(dá)CTCF可顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖3a-b)，而敲低CTCF則顯著抑制膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖3c-d).上述結(jié)果表明，CTCF可顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力.

a, c.Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)或敲低CTCF對膽管癌細(xì)胞HCCC-9810和RBE遷移能力的影響；b,d.基質(zhì)膠Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)或敲低CTCF對膽管癌細(xì)胞HCCC-9810和RBE侵襲能力的影響圖3 CTCF對膽管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effect of CTCF on the cholangiocarcinoma cells migration and invasion ability

2.4 CTCF對p53信號通路的影響

將含有255例膽管癌的RNA測序數(shù)據(jù)集CPTAC，根據(jù)癌組織中CTCF基因mRNA表達(dá)水平的中值分為高表達(dá)和低表達(dá)2組，并使用Network Analyst(v2019)進(jìn)行差異表達(dá)分析，結(jié)果顯示，428個基因存在顯著差異表達(dá).進(jìn)一步使用Enrichr進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示，這428個差異表達(dá)基因顯著富集于p53、血管生成、鈣黏素等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.此外，還針對該數(shù)據(jù)集使用全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)矩陣進(jìn)行了GSEA分析，發(fā)現(xiàn)p53下游的靶基因(如編碼p21的CDKN1A)顯著富集于低表達(dá)組，提示CTCF的表達(dá)與p53信號通路的活性顯著負(fù)相關(guān)(圖4a-b).已有研究報道，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，CTCF可通過調(diào)控p53及其靶基因p21的表達(dá)來促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長[22].因此，推測，CTCF在膽管癌細(xì)胞中可能通過調(diào)控p53通路來發(fā)揮促癌功能.

a-b.通路富集分析顯示低表達(dá)組顯著富集于p53信號通路；c-f.在HCCC-9810和RBE細(xì)胞中敲低CTCF后，p53和p21的表達(dá)水平顯著增加，而過表達(dá)CTCF后，p53和p21的表達(dá)水平顯著減少；g-h.在HCCC-9810和RBE細(xì)胞中過表達(dá)或敲低CTCF后，Wb檢測p53和p21的蛋白水平變化圖4 CTCF對p53通路的影響Fig.4 Effect of CTCF on the p53 signaling pathway

在穩(wěn)定敲低或過表達(dá)CTCF的HCCC-9810和RBE細(xì)胞系中，采用qRT-PCR和Wb實(shí)驗(yàn)分別檢測了p53及其下游的p21蛋白的表達(dá)水平.結(jié)果顯示，在膽管癌細(xì)胞HCCC-9810和RBE中過表達(dá)CTCF后，與對照相比，p53和p21的轉(zhuǎn)錄水平(圖4c-d)和蛋白表達(dá)水平(圖4g)均顯著降低；反之，敲低CTCF后，p53和p21的轉(zhuǎn)錄水平(圖4e-f)和蛋白表達(dá)水平(圖4h)均顯著升高.上述結(jié)果初步提示，CTCF在膽管癌細(xì)胞中可能通過抑制p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮促癌功能.

2.5 CTCF在膽管癌中的臨床相關(guān)性研究

進(jìn)一步探索CTCF在膽管癌中的異常表達(dá)情況及其與膽管癌患者預(yù)后的相關(guān)性.首先，在TCGA-CHOL和GSE107943數(shù)據(jù)集中分析了CTCF在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異.結(jié)果顯示，膽管癌組織中CTCF的mRNA表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織(圖5a-b).然而，TCGA-CHOL數(shù)據(jù)集中評估了CTCF的表達(dá)水平和患者生存期之間的關(guān)系.結(jié)果顯示，雖然CTCF高表達(dá)組的風(fēng)險比(hazard ratio，HR)大于1，提示CTCF高表達(dá)是患者預(yù)后的風(fēng)險因素，但是，由于樣本量較少，組間的差異不顯著(圖5c-d).上述結(jié)果表明，CTCF在膽管癌組織中異常高表達(dá)，且其高表達(dá)可能是膽管癌患者預(yù)后的風(fēng)險因素.

a-b. 在TCGA-CHOL和GSE107943數(shù)據(jù)集中，CTCF在膽管癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織；c-d.在TCGA-CHOL數(shù)據(jù)集中，CTCF的表達(dá)與膽管癌患者的預(yù)后無顯著相關(guān)性圖5 CTCF在膽管癌組織中差異表達(dá)分析以及生存分析Fig.5 Differential expression analysis and survival analysis of CTCF in cholangiocarcinoma tissue

3 討論

近年來，全球膽管癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢.大多數(shù)膽管癌患者因早期沒有明顯癥狀，從而錯過最佳的治療時間[23].目前膽管癌的治療手段仍然非常有限，并且復(fù)發(fā)率高[24]，長期預(yù)后差，生存率低[5].因此，深入了解膽管癌相關(guān)基因的生物學(xué)功能以及作用機(jī)制，對膽管癌的防診治至關(guān)重要.

CTCF是一種重要的表觀遺傳調(diào)控因子，涉及多種細(xì)胞過程，包括生長、增殖、分化和凋亡等.已有研究顯示，CTCF的突變或異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[8,14,25]，但其在膽管癌中的生物學(xué)功能一直未有報道.在本研究中，發(fā)現(xiàn)CTCF不僅在膽管癌組織和膽管癌細(xì)胞系中顯著高表達(dá)，同時，細(xì)胞學(xué)水平初步的功能研究證實(shí)其顯著促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的生長、遷移和侵襲能力，提示CTCF在膽管癌中發(fā)揮癌基因的作用.

然而，已有的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，CTCF在腫瘤中的功能具有高度的腫瘤異質(zhì)性.例如，在結(jié)直腸癌中，CTCF在結(jié)直腸癌的癌組織中顯著高表達(dá)；并且，CTCF可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控抑制p53的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞存活，發(fā)揮癌基因的功能[22].在原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中，CTCF也作為癌基因通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控FOXM1的表達(dá)促進(jìn)肝癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[21].相反，CTCF在人乳腺癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)顯著低于正常乳腺細(xì)胞和組織.機(jī)制研究提示，CTCF可通過減弱p65與啟動子區(qū)域的結(jié)合能力，抑制NF-κB通路及其靶基因的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[26].在前列腺癌中，CTCF發(fā)生顯著的基因組拷貝數(shù)缺失，提示其是潛在的抑癌基因[20].CTCF在腫瘤中功能異質(zhì)性的機(jī)制尚不明確，未來尚需更多的研究.

為探索CTCF在膽管癌中發(fā)揮促癌功能的機(jī)制，利用TCGA和GSE107943數(shù)據(jù)集中膽管癌的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，通過通路富集分析發(fā)現(xiàn)顯著差異表達(dá)基因可顯著富集于p53信號通路.初步的實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證CTCF確實(shí)能夠抑制p53及其下游靶基因p21的表達(dá)，提示CTCF在膽管癌細(xì)胞中可能通過抑制p53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮促癌功能.眾所周知，在大多數(shù)腫瘤中p53均可發(fā)生突變，引起基因組不穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的生長能力及耐藥性[27].以往研究也發(fā)現(xiàn)，p53突變也廣泛存在于膽管癌中.因此，CTCF在膽管癌中調(diào)控p53等信號通路的詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步的深入研究.

總之，本課題組發(fā)現(xiàn)CTCF在膽管癌中可能發(fā)揮癌基因的功能，并初步揭示了其在膽管癌進(jìn)展中的機(jī)制線索.未來我們將進(jìn)一步探索CTCF在膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中的腫瘤生物學(xué)功能和分子機(jī)制，以期為研發(fā)新的膽管癌防診治措施提供理論依據(jù).