正交實驗優(yōu)化高濃玉米燃料乙醇發(fā)酵條件

惠繼星，金香梅，寧艷春，楊艷妮，伊 鳳，陳希海，范 銳

(1.中國石油吉林石化公司研究院，吉林 吉林 132021；2.中國石油吉林石化公司質(zhì)量檢驗中心，吉林 吉林 132021；3.吉林燃料乙醇有限責(zé)任公司，吉林 吉林 132101)

國家“十四五”規(guī)劃提到要構(gòu)建現(xiàn)代能源體系，推進(jìn)能源革命，建設(shè)清潔低碳、安全高效的能源體系，提高能源供給保障能力，加快發(fā)展非化石能源。燃料乙醇作為一種清潔、可再生能源，能有效緩解對化石燃料的依賴、提高能源安全性，對緩解石油短缺、降低環(huán)境污染、節(jié)能減排具有重要意義[1]。

目前，世界超過95%乙醇以農(nóng)副產(chǎn)品為原料生產(chǎn)，在中國燃料乙醇主要以不宜食用的陳化玉米為原料[2]，近年來，隨著能源危機(jī)、環(huán)境危機(jī)日益加重以及玉米價格的持續(xù)上漲，更多的燃料乙醇企業(yè)都紛紛關(guān)注如何最大限度地降低燃料乙醇生產(chǎn)成本和提高原料出酒率[3]。利用高濃乙醇發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)燃料乙醇，可降低物料輸送、精餾及烘干等工序的能耗，減少污水排放，符合國家清潔生產(chǎn)的要求，是今后燃料乙醇行業(yè)的發(fā)展趨勢[4]。

高濃乙醇發(fā)酵強(qiáng)度一方面取決于酵母菌自身的繁殖力、發(fā)酵力以及對發(fā)酵環(huán)境的耐受性，另一方面主要取決于對發(fā)酵工藝的控制[5]。發(fā)酵液pH值、糖化酶添加量及外加氮源等因素都直接影響酵母菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的效果，有關(guān)發(fā)酵工藝優(yōu)化方面的報道較多，但是利用正交實驗方法優(yōu)化高濃玉米燃料乙醇發(fā)酵方面的報道相對較少。實驗以玉米粉為原料，采用同步糖化發(fā)酵工藝，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用正交實驗優(yōu)化發(fā)酵過程中酸性蛋白酶添加量、糖化酶添加量、尿素添加量及發(fā)酵液初始pH對高濃玉米燃料乙醇發(fā)酵效果的影響，以期為高濃玉米燃料乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑與儀器

市售玉米粉；酸性蛋白酶：市售，酶活力5萬U/mL；糖化酶：市售，10萬U/mL；耐高溫α-淀粉酶：市售，24萬U/mL；濃醪酵母：湖北安琪酵母股份有限公司。

硫酸：分析純，遼寧新興試劑有限公司；氫氧化鈉：分析純，北京化工廠；尿素：分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

立式全溫振蕩培養(yǎng)箱：ZQPL-200，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；潔凈工作臺：SW-CJ-1FD；高壓滅菌鍋：MJ-78A，施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司；離心機(jī)：A14，Sartorius公司；液相色譜：LC-20A，島津公司；數(shù)字酸度計：PP-25-P11，Sartorius公司；快速水分測定儀：MS-70，AND公司；恒溫水浴鍋：BWS-10，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯電動攪拌器：WB3000-D，維根技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液化

以料水質(zhì)量比1∶2將玉米與水混合，調(diào)節(jié)pH=5.0～5.5，加入30 U/g玉米粉的液化酶，90℃液化120 min，期間不斷攪拌，制備得到玉米液化醪。

1.3.2 酵母活化

稱量0.3 g安琪超級釀酒高活性干酵母，加入裝有100 mL無菌水的三角瓶中，在32 ℃，180 r/min的搖床中活化60 min。

1.3.3 同步糖化發(fā)酵

將玉米液化醪快速降溫至33 ℃，加入適量的糖化酶、酸性蛋白酶、尿素、1%的酵母活化液，在轉(zhuǎn)速180 r/min，溫度33 ℃的條件下開始發(fā)酵。

1.3 分析方法

1.3.1ρ(乙醇)和ρ(葡萄糖)測定

取發(fā)酵液樣品1.5 mL加入2.0 mL離心管中，在12 000 r/min下離心3 min，取上清液稀釋10倍，然后用0.22 μm的水系濾膜過濾，用液相色譜儀(檢測器：示差折光檢測器；流速：0.6 mL/min；流動相：0.005 mol/L硫酸；柱溫：55 ℃)測定發(fā)酵液中乙醇濃度和葡萄糖濃度，按公式(1)計算樣品中乙醇體積分?jǐn)?shù)，按公式(2)計算樣品中葡萄糖的濃度。

ρ(乙醇)=測定值×稀釋倍數(shù)/100

(1)

ρ(葡萄糖)=測定值×稀釋倍數(shù)/100

(2)

1.3.2 固含量測定

糖化醪固含量的測定參照GB/T2793—1995，干燥溫度為105 ℃。

1.4 實驗設(shè)計

該實驗以發(fā)酵成熟醪ρ(乙醇)為參考指標(biāo)，主要對玉米乙醇發(fā)酵的4個重要外部因素，即糖化酶添加量、尿素添加量、酸性蛋白酶添加量、發(fā)酵液初始pH值進(jìn)行研究。利用正交表L9(34)，設(shè)計4因素3水平的正交實驗(見表1)，根據(jù)正交實驗結(jié)果確定最佳發(fā)酵工藝條件。

表1 正交實驗設(shè)計

2 結(jié)果與討論

2.1 酸性蛋白酶添加量的確定

在通常發(fā)酵中，酵母菌不能直接利用淀粉質(zhì)原料中的蛋白質(zhì)，加入酸性蛋白酶后，其水解作用可增加發(fā)酵醪液中可被酵母利用的有機(jī)氮的濃度，促進(jìn)酵母生長繁殖，提高酒精產(chǎn)率[6]。在尿素添加量為1.0 g/kg干物、糖化酶添加量為50 U/g干物、發(fā)酵液初始pH=5.5(自然)的條件下，對不同酸性蛋白酶添加量進(jìn)行研究。結(jié)果見圖1。

酸性蛋白酶添加量/(U/g干物)圖1 蛋白酶加量對成熟醪ρ(乙醇)和ρ(葡萄糖)的影響

由圖1可知，發(fā)酵成熟醪中ρ(乙醇)隨著酸性蛋白酶添加量的增大而增大，殘余ρ(葡萄糖)隨著酸性蛋白酶添加量的增大逐漸下降，當(dāng)酸性蛋白酶添加量大于5 U/g干物時，ρ(乙醇)增長緩慢，考慮到酸性蛋白酶的價格及經(jīng)濟(jì)因素，確定最佳的酸性蛋白酶添加量為5 U/g干物。

2.2 尿素添加量的確定

在酒精生產(chǎn)中，氮源是構(gòu)成菌體物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物的必需營養(yǎng)元素，一般氮源分為無機(jī)氮源和有機(jī)氮源兩類[7]。尿素作為最常用的一種無機(jī)氮源，具有高效、廉價易得等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用于燃料乙醇生產(chǎn)中，成為酒精發(fā)酵生產(chǎn)中補(bǔ)充氮源的首選[8]。在酸性蛋白酶添加量為5 U/g干物、糖化酶添加量為50 U/g干物、發(fā)酵液初始pH=5.5(自然)的條件下，對不同尿素添加量進(jìn)行研究。結(jié)果見圖2。

尿素添加量/[g·(kg干物)-1]圖2 尿素添加量對成熟醪乙醇濃度和葡萄糖濃度的影響

由圖2可知，發(fā)酵成熟醪中ρ(乙醇)隨著尿素添加量的增大而增大，殘余ρ(葡萄糖)隨著尿素添加量的增大而逐漸下降，當(dāng)尿素添加量為1.6 g/kg干物時，ρ(乙醇)達(dá)到最大，相應(yīng)的殘余ρ(葡萄糖)達(dá)到最低，繼續(xù)增加尿素的添加量，發(fā)酵成熟醪中ρ(乙醇)上升不明顯，因此確定最佳的尿素添加量為1.6 g/kg干物。

2.3 糖化酶添加量的確定

在淀粉質(zhì)原料燃料乙醇生產(chǎn)過程中，淀粉通過蒸煮后，逐步從顆粒狀態(tài)的淀粉變成溶解狀態(tài)的糊精，該糊精不能被酵母菌直接利用，必須添加糖化酶，把液化后的短鏈淀粉和糊精徹底水解為葡萄糖，因此糖化酶添加量是影響高濃乙醇發(fā)酵的一個重要因素[9]。在酸性蛋白酶添加量為5 U/g干物、尿素添加量為1.6 g/kg干物、發(fā)酵液初始pH=5.5(自然)的條件下，對不同糖化酶添加量進(jìn)行研究。結(jié)果見圖3。

糖化酶添加量//[g·(kg干物)-1]圖3 糖化酶添加量對成熟醪乙醇濃度和葡萄糖濃度的影響

由圖3可知，發(fā)酵成熟醪中ρ(乙醇)隨著糖化酶添加量的增大而增大，相應(yīng)殘余ρ(葡萄糖)隨著糖化酶添加量的增大逐漸下降，當(dāng)糖化酶添加量大于60 U/g干物時，發(fā)酵成熟醪中ρ(乙醇)增長趨緩，因此確定最佳的糖化酶添加量為60 U/g干物。

2.4 發(fā)酵液初始pH值的確定

發(fā)酵液pH值是酵母菌生長最重要的外部條件之一，其對酵母的生長有顯著影響，發(fā)酵液pH值主要通過抑制或激活細(xì)胞中某些酶的活性，使酵母細(xì)胞的代謝途徑及細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生改變，從而影響酵母營養(yǎng)吸收及代謝產(chǎn)物的分泌[10]。在酸性蛋白酶加量為5 U/g干物、糖化酶加量為60 U/g干物、尿素加量為1.6 g/kg干物的條件下，對不同發(fā)酵液初始pH進(jìn)行研究。結(jié)果見圖4。

pH圖4 發(fā)酵液初始pH對成熟醪ρ(乙醇)和ρ(葡萄糖)的影響

由圖4可知，發(fā)酵成熟醪中ρ(乙醇)隨著發(fā)酵液初始pH值的增大而增大，相應(yīng)的殘余ρ(葡萄糖)逐漸下降，當(dāng)發(fā)酵液初始pH=5時，乙醇濃度達(dá)到最大，相應(yīng)殘余葡萄糖濃度達(dá)到最低值，繼續(xù)增大發(fā)酵液初始pH，發(fā)酵成熟醪中乙醇濃度有所下降，因此確定較佳的發(fā)酵液初始pH為5。

2.5 正交優(yōu)化玉米乙醇發(fā)酵工藝結(jié)果與分析

根據(jù)正交實驗設(shè)計對9種條件下發(fā)酵成熟醪進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果及分析

從發(fā)酵成熟醪乙醇濃度和各因素極差(R)值可知，實驗因素A(酸性蛋白酶添加量)的R值最大，為5.85，說明酸性蛋白酶添加量對發(fā)酵成熟醪ρ(乙醇)的影響最大；其次是D(發(fā)酵液初始pH)，為3.71；再次是B(尿素添加量)，為1.09；最后是B(糖化酶添加量)，為0.74；即各因素對發(fā)酵成熟醪乙醇濃度的影響程度從高到低依次為酸性蛋白酶添加量>發(fā)酵液初始pH值>尿素添加量>糖化酶添加量。

2.2 驗證性實驗

為驗證高濃玉米燃料乙醇發(fā)酵的穩(wěn)定性，按最佳工藝條件A2B3C2D2，即酸性蛋白酶添加量為5 U/g干物，尿素添加量為2.4 g/kg干物，糖化酶添加量為60 U/g干物，發(fā)酵液初始pH=5.0，于33 ℃發(fā)酵72 h，得到發(fā)酵成熟醪，實驗重復(fù)3次取平均。由表3可知，在該工藝條件下，發(fā)酵成熟醪ρ(乙醇)=136.34 g/L，殘余ρ(葡萄糖)=0.35 g/L，在此條件下高濃玉米燃料乙醇發(fā)酵具有較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

正交實驗結(jié)果表明，影響高濃玉米燃料乙醇發(fā)酵因素的順序為酸性蛋白酶添加量>發(fā)酵液初始pH值>尿素添加量>糖化酶添加量，最佳發(fā)酵工藝條件為酸性蛋白酶添加量為5 U/g干物，尿素添加量為2.4 g/kg干物，糖化酶添加量為60 U/g干物，發(fā)酵液初始pH=5。在以上最佳工藝條件下，72 h發(fā)酵成熟醪中ρ(乙醇)=136.34 g/L，ρ(葡萄糖)=0.35 g/L。