黃曲霉毒素B1致肉雞急性肝損傷模型的建立

張月瑩，姚強(qiáng)，朱彥彬，任欣慧，王琳，陳志寶，，5，張華

（1.鹽城師范學(xué)院藥學(xué)院，鹽城 224007；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；3.中國動物疾病預(yù)防控制中心；4.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院；5.國家耐鹽堿水稻創(chuàng)新中心華南中心）

霉菌毒素對人類和動物的健康有害，因為它們經(jīng)常存在食品和飼料中，并且有很大可能影響人類的生命健康，以及牲畜和家禽的生產(chǎn)力[1-2]。黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）由許多種真菌菌株產(chǎn)生，是一種被廣泛研究的霉菌毒素[3-4]。AFs可以污染花生、玉米、小麥等飼料谷物。曾有文章報道，AFs在許多國家都引起過中毒事件，例如在英國的養(yǎng)殖廠就發(fā)生過火雞食用AFs后大量死亡事件，在印度也曾有人因服用了AFs含量過高的毒玉米而導(dǎo)致死亡，并且在中國廣東廣西兩省都出現(xiàn)過花生油AFs超標(biāo)事件等。因此，AFs對動物和人類的健康都有著巨大的威脅，同時也給世界上眾多國家均造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在1993年世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)將AFs列為Ⅰ類致癌物[5-6]。

黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）由曲霉真菌產(chǎn)生，在AFs家族中具有極強(qiáng)的毒性和致癌性，具有耐高溫，難溶于水，易溶于二甲基亞砜（DMSO）等有機(jī)溶劑的特性[7-8]。在目前的農(nóng)業(yè)實踐中，AFB1已經(jīng)成為動物飼料中的一種自然污染物，是氰化物的10倍、砒霜的68倍，而且它對人類和動物的肝臟都具有毒性[9-12]。有人發(fā)現(xiàn)，AFB1可以增加肉雞的易感性，容易受病原體感染，導(dǎo)致生產(chǎn)力下降，其代謝產(chǎn)生物可以累積在肉雞的肝臟中，通過食物鏈的作用，導(dǎo)致人類的慢性或急性肝損傷，甚至肝癌[5]。AFB1可以通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥導(dǎo)致動物或人類的肝損傷。

動物模型是疾病研究和藥物開發(fā)的奠基石，選擇合適的動物模型可以更好地幫助人們了解各種疾病的機(jī)理，并且也可以因此研究防治措施[13]。目前在肝損傷動物模型的制作中，人們通常選擇哺乳動物（如小鼠、大鼠、家兔等）來作為實驗動物，很少使用禽類；但在AFB1誘導(dǎo)的疾病過程中，禽類最為敏感[5]。由于禽類在食用AFB1污染的飼料后，大約有1/2經(jīng)血液運(yùn)至肝臟代謝解毒，由此肝臟就會嚴(yán)重受損。在人們的日常生活飲食中，雞作為人類最喜愛的食物之一，它具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如飼養(yǎng)周期短，方便養(yǎng)殖等[14-15]。但在肉雞飼養(yǎng)的過程中感染了一些疾病，人們通常不易察覺，若是不小心誤食這些病雞，也會因此感染該疾病，這樣研究肉雞疾病機(jī)理就變得十分有意義。該試驗的主要目的是，通過探討AFB1暴露的雞肝組織形態(tài)學(xué)，抗氧化能力以及氧化損傷的影響，建立雞急性肝損傷的模型，為后續(xù)研究家禽的肝臟損傷作用機(jī)制及治療AFB1的藥物研發(fā)奠定動物模型，也為今后養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

1日齡艾拔益加肉雞（AA肉雞）（哈爾濱益農(nóng)禽業(yè)有限公司），養(yǎng)于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院動物房，飼料為普通適于0~20日齡肉仔雞飼料（溫嶺市城東興源飼料廠），每日自由采食、飲水，自然光照，定時通風(fēng)換氣，保持空氣流通。

1.1.2 藥物與試劑

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%）（Pribolab公司）；AST、ALT、CAT和TBIL檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；MDA含量檢測試劑盒（Solarbio公司）；RIPA強(qiáng)裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強(qiáng)型）、CuZn/Mn-SOD活性檢測試劑盒和ALP檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；Nrf2，HO-1和β-actin抗體（美國Proteintech公司）；過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（美國Jackson ImmunoResearch公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物的分組及處理

將40只健康的1日齡AA肉雞先正常喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為4組，每組10只。從第4 d開始每日使用不同劑量的AFB1（見表1）給雛雞染毒，連續(xù)飼喂7 d。最后1次飼喂后，只禁食，正常飲水，24 h后心臟采血，斷頭處死雛雞，將右側(cè)肝葉用4%多聚甲醛溶液固定，于組織病理學(xué)觀察，將剩下的肝臟組織保存在-80℃超低溫冰箱中備用，根據(jù)后續(xù)試驗檢測內(nèi)容不同，分別作不同處理。

表1 AFB1誘導(dǎo)雞肝損傷模型分組表Table 1 Grouping AFB1 induced chicken liver injury

1.2.2 肝組織病理學(xué)檢測

將用4%的多聚甲醛浸泡且固定好的雞肝臟拿出，通過梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋等處理后，然后使用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)開始石蠟修塊和切片（厚度大約為5 μm），之后進(jìn)行H&E染色，再經(jīng)過切片梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、鏡檢步驟后，隨機(jī)挑選出10個視野在100倍顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3 血清肝功能指標(biāo)測定

心臟取血于離心管中，4℃，3 000 rpm離心15 min獲得血清，按照試劑盒中的說明書所述方法分別檢測血清中AST、ALT、TBIL和ALP水平。

1.2.4 肝組織抗氧化指標(biāo)測定

從-80℃冰箱中取出雞肝臟樣品，在稱量臺上稱取大約30 mg，之后加入4℃預(yù)冷的PBS，用研磨棒將組織研磨，研磨后吸出勻漿液。之后，將勻漿液在4℃條件下進(jìn)行12 000 rpm離心，用移液槍吸取上清液即為待測樣品，利用試劑盒測定SOD抑制率和CAT含量。

利用電子天平稱取大約50 mg的雞肝組織，隨后加入4℃體積比為100 mg∶1 mL的MDA提取液，再用已經(jīng)提前預(yù)冷好的研磨棒進(jìn)行組織研磨，吸出勻漿液，之后4℃，10 000 rpm·min-1，離心10 min，用移液槍吸取上清液于1.5 mL的離心管中，該液體為待測樣品，根據(jù)試劑盒說明書方法測定組織MDA含量。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡分析

稱取一定量的雞肝組織后，將組織用含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA裂解液在冰上處理30 min，隨后在4℃，12 000 rpm離心10 min，得到的上清液即為所需蛋白。首先將蛋白濃度用BCA法檢測并定量為3 μg·μL-1，上樣10 μL。配置12%的分離膠和5%的濃縮膠跑電泳，隨后利用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜法，80 V，45 min將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用5%的脫脂奶粉在搖床上慢搖、封閉2 h。然后再4℃過夜孵育Nrf2、HO-1、β-actin抗體（按說明書比例進(jìn)行稀釋），之后用TBST清洗4次，每次10 min；再室溫置搖床上慢搖孵育相對應(yīng)的羊抗鼠（或兔）二抗（1∶10 000稀釋）2 h，TBST清洗4次，每次10 min；將顯色A、B液按1∶1比例配置ECL發(fā)光液進(jìn)行顯色，使用凝膠成像儀收集圖像。用β-actin作為內(nèi)參，對目的蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，比較。

1.3 統(tǒng)計分析

上述所有實驗均重復(fù)進(jìn)行3次，以確保其準(zhǔn)確性和重復(fù)性。試驗所有圖利用GraphPad Prism軟件制作，免疫印跡圖像用Image J軟件定量分析，用SPSS 19.0軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。P<0.05代表具有統(tǒng)計學(xué)意義，**代表P<0.01，*代表P<0.05，所有數(shù)值表示均為平均值±相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟表觀觀察

對雞肝組織進(jìn)行表觀觀察，如圖1所示。正常對照組（左圖）肝組織呈現(xiàn)暗紅色，表面平滑，而AFB1組（右圖）肝臟質(zhì)脆、腫大黃染，表面不平滑，有較多出血點(diǎn)。

2.2 肝組織病理切片觀察

試驗7 d的肝臟組織病理變化如圖2所示。對照組肝組織正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整、中央靜脈、生發(fā)中心及肝細(xì)胞索清晰可見，無明顯的病理組織學(xué)變化（圖2A）。然而用不同濃度AFB1飼糧處理的肉雞肝組織切片，肝細(xì)胞腫脹，脂肪變性明顯；肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞索雜亂，高劑量組尤為嚴(yán)重。這說明試驗采用連續(xù)飼喂7 d肉雞5 mg·kg-1AFB1日糧已經(jīng)造成嚴(yán)重的肝臟損傷（圖2 B，C，D）。

圖1 肉雞肝臟剖檢圖Fig.1 Liver section of broiler liver

圖2 肝組織病理切片（HE染色，100×）Fig.2 Liver histopathological sections（HE staining，100×）

2.3 AFB1對血清生化指標(biāo)的影響

隨著ALT、AST、ALP酶活性和TBIL水平升高，肝細(xì)胞膜通透性增加，表明了肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷[16]；根據(jù)圖3可知，AFB1各組的血清中ALT、AST酶活性，低劑量組與對照組比略升高，無明顯差異，中劑量和高劑量組均比對照組顯著升高，AFB1組的血清中TBIL含量都高于對照組，高劑量組升高的更為明顯，ALP的表達(dá)也有升高趨勢，這表明肝細(xì)胞受到損傷，這與肝組織H&E病理切片圖結(jié)果吻合。

圖3 各組肉雞血清肝功能指標(biāo)Fig.3 Serum liver function indicators of broiler chickens in each group

2.4 AFB1對肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

機(jī)體脂質(zhì)過氧化的嚴(yán)重程度和抗氧化能力的高低可以依據(jù)肝臟MDA、SOD和CAT水平的表達(dá)高低所反映[17]。結(jié)果如圖4所示，模型組中MDA含量顯著上升，高劑量組達(dá)到最高；CAT和SOD活性也均明顯下降，SOD活性降低更明顯。這說明AFB1濃度的增加會減弱肝臟抗氧化能力。

圖4 各組肉雞肝臟抗氧化指標(biāo)Fig.4 Liver antioxidant indicators of all broiler groups

2.5 AFB1對Nrf2/HO-1通路的影響

Nrf2是調(diào)節(jié)肝臟一系列解毒的重要轉(zhuǎn)錄因子[18-19]。血紅素加氧酶-1（HO-1）作為其下游重要的基因之一。如下圖5結(jié)果顯示，與對照組比較，Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)水平隨著AFB1的劑量增加而降低。

圖5 各組肉雞肝臟Nrf2/HO-1信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.5 Expression of Nrf2/HO-1 signal pathway related proteins in the liver of broilers

3 討論

肝臟是動物和人類機(jī)體內(nèi)主要的代謝和解毒器官，在日常生活中人類感染細(xì)菌、病毒或者過量服用藥物，在有毒的環(huán)境中長期生存等都會引發(fā)各種肝臟疾病[14]。肝臟作為與AFB1第一個接觸的器官，是AFB1毒性的重要作用器官，AFB1會導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷已被大量文獻(xiàn)證明[18]。肝臟受到損害后，主要表現(xiàn)為肝小葉結(jié)構(gòu)不正常，肝細(xì)胞索雜亂無序。該試驗中AFB1組的肝臟病理切片圖觀察結(jié)果與上述描述的內(nèi)容相切合，證明肝臟已受損害。

在臨床上，肝臟是否損傷，主要由血清中的ALT和AST的變化判定。這兩種酶主要是由肝細(xì)胞合成。若肝臟未受損，血清中這兩種酶的活性極低。如果肝臟受到嚴(yán)重破害，引起肝細(xì)胞膜破損，則ALT和AST這兩種酶會進(jìn)入血液，使得血清中ALT和AST酶活性嚴(yán)重上調(diào)[19]。ALP也可以判斷肝臟是否損傷，它在人和動物體內(nèi)各組織器官中分布范圍都很廣范，尤其是肝臟這一器官。ALP可以直接參與生物體內(nèi)的鈣和磷的合成與分解，以及磷酸基團(tuán)在各種物質(zhì)間的轉(zhuǎn)移等的生理過程的調(diào)控，臨床上常作為診斷骨骼系統(tǒng)疾病和肝膽系統(tǒng)疾病的指標(biāo)[20-22]。ALP升高一般出現(xiàn)在膽汁淤積等病癥中。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)灌胃小鼠21 d 300 μg·kg-1AFB1，可以導(dǎo)致小鼠肝臟損傷，血清中ALT、AST、ALP表達(dá)水平顯著增加[23]；0.125 mg·kg-1AFB1連續(xù)灌胃大鼠21 d，大鼠肝臟病理學(xué)發(fā)生明顯改變；AFB1攻毒的雄性大鼠，肝細(xì)胞索紊亂，細(xì)胞發(fā)生明顯的空泡變性，血液中ALT、AST、ALP水平顯著升高[24]，上述研究結(jié)果與試驗結(jié)果一致，模型組ALT、AST酶活性升高，TBIL表達(dá)水平增高，其中高劑量組升高至對照組的2倍以上；較對照組比，ALP活性也有升高趨勢，說明AFB1造成了肉雞嚴(yán)重的肝臟結(jié)構(gòu)及功能損傷。

AFB1誘導(dǎo)肝臟損傷，其毒性主要與氧化應(yīng)激反應(yīng)為特征[25]，AFB1可以引發(fā)活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的產(chǎn)生。脂質(zhì)過氧化、抗氧化酶活力的降低，以及機(jī)體氧化應(yīng)激損傷都是由ROS的產(chǎn)生引起的[18]。MDA、SOD以及CAT同樣能夠反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的氧化程度和細(xì)胞遭受氧化損傷的程度[21-22]。體外研究發(fā)現(xiàn)，人的正常肝細(xì)胞系L-02、HL7702細(xì)胞經(jīng)過AFB1誘導(dǎo)損傷后，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞內(nèi)ROS活性明顯增加，MDA表達(dá)水平也顯著增加，而且SOD、CAT的活力極顯著降低[24-26]；經(jīng)過AFB1處理的肉雞原代肝細(xì)胞，也同樣發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨著AFB1濃度的升高而增加，而SOD活力與AFB1濃度成反比[18]。試驗研究結(jié)果表明，與對照組比較，模型組MDA含量顯著增高、SOD和CAT酶活性顯著降低，與上述文獻(xiàn)結(jié)果一致。

Nrf2是抗氧化應(yīng)激的主要轉(zhuǎn)錄因子，它會刺激大多數(shù)抗氧化劑或解毒酶的基因編碼，保護(hù)細(xì)胞免受損害，一旦機(jī)體無法抵御這種過激狀態(tài)，細(xì)胞的保護(hù)作用轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲龌驂乃雷饔肹27]。HO-1是一種限速血紅素降解的酶，發(fā)生氧化應(yīng)激時，氧化劑激活Nrf2核易位，并引發(fā)HO-1的上調(diào)，HO-1可以阻止游離血紅素參與氧化反應(yīng)，抑制細(xì)胞調(diào)亡等作用，從而抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激[28]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠Nrf2基因被敲除后，大鼠對AFB1的敏感度會增加[29]；AFB1刺激體外大鼠肝細(xì)胞后，顯著降低Nrf2和HO-1的轉(zhuǎn)錄水平，同時也降低了則兩種氧化因子的蛋白水平[30]；在給大鼠灌胃AFB1后，大鼠的肝臟Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)下調(diào)，肝臟抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px的表達(dá)水平也顯著下降[31]。試驗結(jié)果同樣表明AFB1模型組肉雞肝臟組織中Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)量均顯著下降，說明AFB1可以通過抑制Nrf2的活化和HO-1的表達(dá)來抑制動物機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的生成，并且在AFB1代謝過程中產(chǎn)生的ROS，動物自身也不能及時地清除，這破壞了體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，造成了肝臟的結(jié)構(gòu)和功能損傷。

近年來，關(guān)于建立AFB1致大鼠（或小鼠）的肝損傷模型的文章報道有很多，例如唐日益[32]連續(xù)灌胃大鼠40 d劑量為250 μg·（kg bw）-1的AFB1，造成了顯著的肝臟病理損傷，成功制備了AFB1中毒大鼠模型；Li Huang[23]連續(xù)灌胃小鼠21 d劑量為300 μg·（kg bw）-1的AFB1，可以導(dǎo)致小鼠肝臟損；高穎等[33]人將小鼠經(jīng)口灌服300 μg·kg-1的AFB1溶液8周，造成小鼠慢性中毒肝損傷，同時小鼠口服2 mg·kg-1的AFB1溶液1周，導(dǎo)致小鼠急性中毒肝損傷等。報道AFB1致雞肝損傷的文章較少，而在臨床上，雞黃曲霉中毒病例很多，由此建立雞AFB1中毒模型具有重大意義。有文章報道，例如卞正容[34]在正常飼糧里添加50 μg·kg-1AFB1連續(xù)喂養(yǎng)雛雞28 d，造成雞慢性中毒；王興赫等[35]飼喂肉雞5 mg·kg-1AFB1日糧28 d，發(fā)現(xiàn)雞肝臟損傷嚴(yán)重；李瑞娟等[36]在飼料中添加AFB1 2.8 mg·kg-1，連續(xù)喂養(yǎng)7 d，誘發(fā)雛雞肝損傷。然而AFB1引起雛雞急性肝損傷的濃度和時間報道文獻(xiàn)較少，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選擇3種AFB1濃度（1，3，5 mg·kg-1）進(jìn)行試驗，最終結(jié)果表明，連續(xù)飼喂雛雞7 d 1，3，5 mg·kg-1AFB1日糧都可以造成雞肝臟不同程度損傷，5 mg·kg-1AFB1導(dǎo)致雞肝臟損傷更為嚴(yán)重，效果最明顯。

4 結(jié)論

綜上發(fā)現(xiàn)證明了連續(xù)飼喂7 d 5 mg·kg-1AFB1日糧可以建立肉雞急性肝損傷模型，這為臨床上治療AFB1引發(fā)的雞肝損傷以及尋找緩解AFB1致肝損傷的獸藥奠定了基礎(chǔ)，為開發(fā)新型保肝飼料添加劑提供實驗依據(jù)。