外泌體環(huán)狀RNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的研究進展*

謝 哲 李一帆 王小祥 潘 翔 張逸蓮 曹 倩 田浩宇 殷桂草

（揚州大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院泌尿外科，揚州 225000）

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是指適合腫瘤細胞生長、侵襲和轉移的特殊內在環(huán)境，包括基質細胞、免疫細胞、細胞外基質、外泌體等亞細胞成分以及缺氧等環(huán)境因素［1-4］。

外泌體（exosomes）的直徑一般在30～150 nm［5］，從多泡體（multivesicular body，MVB）釋放到細胞外環(huán)境后，將內容物，如蛋白質、RNA、脂類、氨基酸等，遞送到受體細胞和特定器 官［6-9］。 環(huán) 狀RNA （circular RNA， 簡 稱circRNAs）是一類曾被認為是共價閉合環(huán)狀結構的非編碼RNA，但現(xiàn)在也有研究表明，circRNAs 在經過N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）介導后，可以編碼蛋白質［10］。circRNAs 在外泌體中富集且穩(wěn)定表達，可以抵抗核酸外切酶的降解［11］，且可在體液中檢測到［12-13］。外泌體來源的circRNAs 調控上皮間質轉化（epithelialmesenchymal transformation，EMT）、腫瘤血管生成、化療耐藥等，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用［14-17］。外泌體circRNAs 與臨床病理特征密切相關，因此具有臨床診斷意義和治療價值。

1 外泌體環(huán)狀RNA的分選、釋放及檢測方法

1.1 外泌體的形成以及外泌體環(huán)狀RNA的分選

外泌體存在于血液、尿液、腹水、唾液、膽汁、腦脊液和其他體液中［18］。外泌體的形成大致分為3個階段，即起始內吞期、MVB 形成期和外泌體分泌期［19］（圖1）。起始內吞期：質膜內陷，經內吞作用，形成內吞室，內吞室相互融合形成早期內體［20］。MVB 形成期：內體膜向內體內褶返，通過逆出芽方式形成胞內囊泡（intraluminal vesicle，ⅠLV）［21］。ⅠLV在內體中積累，富含ⅠLV的晚期內體為MVB。外泌體分泌期：含有高膽固醇的MVB，其膜表面有溶酶體相關膜蛋白1（lysosomal membrane-associated protein1，LAMP1）、LAMP2、CD63（即LAMP3）等，可介導其與細胞質膜融合，并向胞外釋放外泌體［22-25］；其余的MVB與溶酶體融合，降解其內容物。

研究表明，circRNAs 與細胞內microRNAs（miRNAs）結合，且外泌體中也富含miRNAs，所以circRNAs 分選進入外泌體受到細胞中相關miRNAs水平變化的調控。例如，Li等［12］將miR-7模擬物引入細胞并測量其中circRNA CDR1as 的豐度，結果顯示，外泌體中CDR1as的豐度降低，而細胞中的CDR1as 豐度輕微增加，說明miRNAs 對circRNAs分選進入外泌體產生了影響。

MVB 上的RNA 結合蛋白（RNA binding proteins，RBP）在外泌體分選RNA 中發(fā)揮作用，RBP 可識別RNA 的特定基序并將其分選裝載入外泌體，同時保護它們不被降解。而AGO 蛋白被認為是非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）的重要載體，參與ncRNA 包裝入外泌體的過程。蘇素化的蛋白質異質核核糖核蛋白A2B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1，hnRNPA2B1）能通過miRNA 上的外泌體基因序列結合miRNA，控制其在外泌體的裝載，故hnRNPA2B1可能是miRNA分選進入外泌體的關鍵點［26］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，KRAS-MEK-ERK通路促進了AGO2 蛋白磷酸化，抑制AGO2 蛋白將miRNAs 分選進入外泌體，從而影響miRNA 在外泌體中的分泌［27］。

綜上所述，MVB 上的RBP、AGO 蛋白、hnRNPA2B1 都可能通過調控miRNAs 分選進入外泌體這一過程，進而影響circRNAs 分選進入外泌體，但circRNAs 分選進入外泌體的具體機制目前仍未研究清楚。

1.2 外泌體環(huán)狀RNA的釋放

細胞分泌外泌體circRNAs，將其釋放到細胞外環(huán)境可能與circRNAs 的大小有關。Preusser等［28］發(fā)現(xiàn)，外泌體優(yōu)先釋放較小的circRNAs，細胞內未分泌出去的circRNAs平均為459 nt，而外泌體釋放的circRNAs平均為435 nt。外泌體的分泌由不同的分子調節(jié)，一些Rab分子可以促進外泌體的分泌，如Rab27［29］、Rab35 和Ral 蛋白［30］。MVB蛋白TSG101 的ⅠSG 修飾（泛素化修飾）可促進MVB與溶酶體融合，減少外泌體的分泌［31］。

可溶性NSF 附著蛋白受體 （soluble NSFattachment protein receptor，SNARE）家族是外泌體分泌中另一個重要的調節(jié)分子。MVB 膜上的V-SNARE 與細胞質膜上的t-SNARE 結合，形成穩(wěn)定的SNARE 復合物［32］，介導MVB 與質膜的融合有助于脂質雙分子層融合，促進外泌體的釋放（圖1）。

Fig.1 Diagram of exosome formation and sorting and release of exosomal circRNAs圖1 外泌體的形成以及外泌體環(huán)狀RNA的分選與釋放示意圖

1.3 外泌體環(huán)狀RNA的檢測方法

許多常用的分子生物學技術已經被應用于外泌體circRNAs 的檢測，主要包括：逆轉錄PCR（RT-PCR）、實時熒光定量PCR（RT-qPCR）、微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）、Northern blotting、微陣列（microarrays）、 RNA 測 序（RNA sequencing）、NanoString Technologies nCounter 等［33］。circRNAs的檢測方法與上述外泌體circRNAs 的檢測方法相同。每一項技術的優(yōu)缺點見表1。

Table 1 Methods for the detection of exosomal circRNAs表1 外泌體circRNAs的檢測方法

2 外泌體環(huán)狀RNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的生物學功能

近年來，外泌體circRNAs 在多種疾病當中均被廣泛研究［34］。在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，外泌體circRNAs 除了能影響腫瘤細胞的增殖，還可以影響腫瘤細胞的轉移、化療耐藥，但是在其他某些系統(tǒng)中的生物學功能，如影響腫瘤血管生成，未在泌尿系統(tǒng)腫瘤中體現(xiàn)。

2.1 外泌體環(huán)狀RNA影響腫瘤細胞的增殖

外泌體circRNA-FMN2 在前列腺癌（prostatic cancer，PCa）組織中作為miR-1238 的海綿。miR-1238 通過LⅠM 同源盒基因2（LⅠM-homeobox gene 2，LHX2）mRNA 的3'UTR 與LHX2 mRNA結合，可令LHX2 沉默，降低PC3 細胞的細胞增殖。因此，外泌體circRNA-FMN2在PCa組織中通過circRNA-FMN2/miR-1238/LHX2 通路，下調miR-1238表達，從而上調LHX2表達，促進PCa細胞的增殖［35］。

在膀胱癌組織中，外泌體hsa-circRNA-0137606 和外泌體hsa-circRNA-0000285 表達均下降，膀胱癌患者血清中的外泌體hsa-circRNA-0000285 表達也下降。hsa-circRNA-0137606 作為miR-1231 的海綿，可抑制膀胱癌細胞的增殖，其基因敲除促進了體外膀胱癌細胞的增殖［36］。hsa-circRNA-0000285 也可通過調控miR-124 和miR-558，抑制膀胱癌細胞的增殖［37］。

2.2 外泌體環(huán)狀RNA影響腫瘤細胞的轉移

EMT 是一種可逆的去分化過程，是腫瘤轉移的中心機制。在EMT 過程中，上皮細胞可能通過失去細胞間的連接細胞極性，獲得間質表型，外泌體circRNAs 通過調控下游靶點，使上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達量下降，間充質標記物N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達量上調。Chen等［38］研究發(fā)現(xiàn)，膀胱尿路上皮癌（urothelial carcinoma of bladder，UCB）組織中外泌體circRNA-PRMT5 作為miR-30c 的海綿，調控SNAⅠL1/E-鈣黏蛋白信號通路，上調SNAⅠL1，并下調E-鈣黏蛋白，促進UCB細胞EMT，促進腫瘤發(fā)生和轉移。

外泌體hsa-circRNA-0137606 和外泌體hsacircRNA-0000285 也均可抑制膀胱癌細胞的轉移［36-37］。

來自前列腺患者血液樣本中的外泌體circRNA-HⅠPK3作為miR-212的海綿，其表達減少降低了前列腺癌細胞的生存能力、遷移和侵襲能力。MiR-212 靶向BMⅠ-1，下調BMⅠ-1 的表達，miR-212抑制和BMⅠ-1均抑制體內腫瘤的生長。因此，外泌體circRNA-HⅠPK3 基因敲低可通過調控miR-212/BMⅠ-1軸抑制前列腺癌進展［39］。

2.3 外泌體環(huán)狀RNA調控腫瘤化療耐藥

外泌體circRNAs 傳遞多重耐藥蛋白至受體細胞，誘導腫瘤的耐藥性形成［5］。Yan 等［40］研究發(fā)現(xiàn)， 在腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC） 中，癌組織中外泌體hsacircRNA-0035483的表達上調，其可作為hsa-miR-335的海綿，靶向結合吉西他濱，上調CCNB1的表達，激活腎透明癌細胞TK10 和UO31 細胞的自噬，抑制凋亡，增強ccRCC對吉西他濱的耐藥性。

在PCa 組織細胞中，Zhang 等［41］研究發(fā)現(xiàn)，外泌體circRNA-XⅠAP 表達上調，其作為miR-1182的海綿，下調miR-1182 在PCa 組織中的表達，miR-1182 上調下游靶點TPD52 的表達。TPD52 通過抑制肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）/ 腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）介導的自噬增加PCa的多西他賽抗性。

2.4 外泌體環(huán)狀RNA影響腫瘤細胞凋亡

外泌體circRNA-FMN2 敲除導致PC3 細胞和DU145 細胞G1 期的停滯，且增加了PC3 細胞和DU145細胞的凋亡率；過表達circRNA-FMN2可降低人前列腺癌細胞G0/G1期百分率，抑制人前列腺癌細胞凋亡［35］。因此，circRNA-FMN2 通過促進DNA 合成和促進細胞周期進程來抑制PCa 細胞的凋亡。外泌體circRNA-HⅠPK3表達水平降低不僅降低了PCa細胞的生存能力、遷移和侵襲能力，而且促進了PCa細胞凋亡［39］。

2.5 外泌體環(huán)狀RNA調控腫瘤血管生成

腫瘤的進展通常伴隨著血管的生長，血管生成可以導致腫瘤細胞的增殖，并形成腫瘤缺氧環(huán)境［42］，加快腫瘤的發(fā)展和轉移。Xie 等［43］研究發(fā)現(xiàn)，外泌體circRNA-SHKBP1 作為miR-582-3p 的海綿，增加HUR 蛋白的表達，增強了血管內皮生長因子mRNA的穩(wěn)定性，促進了胃癌的血管生成。但目前尚未發(fā)現(xiàn)外泌體circRNAs 調控泌尿系統(tǒng)腫瘤血管生成。

2.6 外泌體環(huán)狀RNA影響腫瘤微環(huán)境中CD8+T細胞的功能

CD8+T 細胞在介導抗腫瘤免疫中發(fā)揮了重要作用，尤其是當CD8+T細胞浸潤到TME中時，與多種腫瘤，如乳腺癌、黑色素瘤、結直腸癌的良好預后有關［44］。Yang 等［45］研究表明，外泌體circRNA-TRPS1（外泌體hsa-circRNA-0085361）在膀胱癌組織中低表達，通過circTRPS1/miR-141-3p/GLS1 軸調節(jié)細胞內活性氧平衡，抑制了TME中CD8+ T 細胞耗用，從而抑制了膀胱癌的惡性表型。

外泌體circRNAs 在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的生物學功能總結見表2。

Table 2 Biological functions of exosomal circRNAs in urinary tumors表2 外泌體環(huán)狀RNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的生物學功能

3 外泌體環(huán)狀RNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的作用機制

與其他很多系統(tǒng)腫瘤一樣，外泌體circRNAs在泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮作用的分子機制，主要是其作為miRNA 海綿，通過調控下游靶基因，行使其生物學功能。在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，除了作為miRNA 海綿，外泌體circRNAs 還可與蛋白質結合，發(fā)揮相應的生物學功能。此外，外泌體circRNAs 在經過m6A 修飾后，可以編碼蛋白質［10］，未經m6A修飾的circRNAs可導致體內抗原特異性T 細胞活化、抗體產生和腫瘤抑制［46］，但其在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的作用目前仍未有報道。

3.1 內源性競爭RNA （competing endogenous RNAs，ceRNA）網(wǎng)絡機制

外泌體circRNAs 可以作為miRNA 海綿，阻止miRNA 與下游靶基因的結合。miR-29a-3p 已被證實是一種抑制腫瘤的外泌體miRNA［47-48］。與癌旁正常組織比較，miR-29a-3p在組織中表達較低，而PCa 患者的外泌體circRNA-0044516 水平較健康對照組升高。外泌體circRNA-0044516作為miR-29a-3p海綿，通過黏附miR-29a-3p，使游離miR-29a-3p的表達降低，促進PCa 的進程［49］。外泌體circRNA-0081234 水平在有脊柱轉移的PCa 組織中高于無脊柱轉移的原發(fā)性PCa 組織。外泌體circRNA-0081234 作為miR-1 的海綿，上調了MAP3K1水平，促進了PCa進程。外泌體circRNA-0081234 的損耗在體內抑制腫瘤生長［50］。外泌體circRNA-HⅠPK3作為miR-212的海綿，其表達減少可以降低PCa 細胞的生存能力、遷移和侵襲能力，并且促進PCa細胞凋亡。MiR-212通過靶向BMⅠ-1，下調BMⅠ-1的表達，實現(xiàn)抑制PCa細胞的增殖、遷移和侵襲的目的。因此，外泌體circRNA-HⅠPK3基因敲低可通過調控miR-212/BMⅠ-1軸抑制前列腺癌進展［39］。

Xiao 等［51］研究發(fā)現(xiàn)，外泌體circRNA-400068在RCC 組織和細胞系中表達上調，與下游靶點miR-210-5p 結合發(fā)揮調控作用，上調下游靶點SOCS1的表達，促進RCC細胞增殖，抑制RCC細胞凋亡。外泌體circRNA-400068 通過miR-210-5p/SOCS1 軸調控RCC 的進展，circRNA-400068/miR-210-5p/SOCS1 軸可能成為RCC 治療的候選靶點［51］。

3.2 外泌體環(huán)狀RNA與蛋白質結合

外泌體circRNAs 可以與功能蛋白質結合，發(fā)揮相應的生物學功能。在膀胱癌組織中，Su 等［52］發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，外泌體circRNA-ELP3 表達上升，通過靶向結合腫瘤干細胞相關基因八聚體結合轉錄因子4 重組蛋白和性別決定區(qū)Y 框蛋白2，可有效促進膀胱癌細胞增殖，抑制癌細胞凋亡，增強對順鉑的耐藥性。

4 細胞內環(huán)狀RNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的作用機制

circRNAs作為miRNA海綿，通過ceRNA網(wǎng)絡機制在泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮生物學作用。如膀胱癌組織中的circRNA-BPTF 作為miR-31-5p 的海綿，阻止了miR-31-5p 與下游靶基因RAB27A 的3'端的相互作用，促進了膀胱癌進程［53］。

circRNAs 還可以與相應的蛋白質結合，調節(jié)基因的表達。如雄激素受體（androgen receptor，AR）結合circRNA-HⅠAT1 啟動子上的ARE，在轉錄水平上抑制宿主基因HⅠAT1，調控miR-195-5p/29a-3p/29c-3p 的表達，從而增強CDC42 mRNA 表達，促進ccRCC細胞增殖、遷移和侵襲［54］。

研究表明，未經m6A 修飾的circRNAs 可導致體內抗原特異性T 細胞活化、抗體產生和腫瘤抑制［55］。 m6A 調控因子類甲基轉移酶3/14（methyltransferase-like 3/14，METTL3/14）、質量及肥胖相關蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）、YTH 結構域家族3（YTH domain family 3，YTHDF3）和起始因子真核細胞翻譯起始因子（eukaryotic translation initiation factor，eⅠF）4G2 參與了m6A 介導的蛋白質翻譯［56］。其中，METTL3/14 為甲基轉移酶，YTHDF3 與修飾的甲基結合，eⅠF4G2 與YTHDF3 結合，穩(wěn)定結構，從而行使編碼、翻譯蛋白質的功能［46］，F(xiàn)TO 為去甲基化酶，可以抑制m6A 介導的circRNAs 翻譯。但是，泌尿系統(tǒng)腫瘤中尚未有研究報道m(xù)6A 修飾的circRNAs。

circRNAs 在腫瘤中可作為致癌基因或抑癌基因發(fā)揮重要作用，具有重要的臨床應用價值，與腫瘤的診斷、預后和分期密切相關。

5 泌尿系統(tǒng)腫瘤中外泌體環(huán)狀RNA與細胞內環(huán)狀RNA的比較

circRNAs 大多穩(wěn)定存在于大多數(shù)細胞中，調節(jié)癌癥基因的表達［57］，而外泌體是部分細胞（包括癌細胞）分泌的微小囊泡，屬于細胞外囊泡的一種，外泌體以及其分泌出的circRNAs 可以傳遞重要的生物學信息［58］。有研究者通過RNA序列分析表明，外泌體中的circRNAs 比正常細胞中的circRNAs更豐富［59］，外泌體來源的circRNAs可以分泌到血液中，介導細胞與細胞之間的通訊［60］。如前文所述，外泌體circRNAs 通過miRNA 海綿、與蛋白質結合等機制在泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮相應的生理作用，這與細胞內circRNAs 類似。由于一般的circRNAs 大多穩(wěn)定存在于細胞中，其中位于細胞核內的circRNAs 增強親本基因的轉錄，如抑制膀胱癌的circRNA-ⅠTCH，作為miR-17/miR-224 的海綿，靶向其親本基因的轉錄［61］。因此，一般的circRNAs 對細胞核內基因的調控更多，而外泌體circRNAs 對核外靶基因的調控更多。在治療方面上，藥物只到達細胞核外相較于到達細胞核內更容易，所以，這是外泌體circRNAs 作為一個治療靶點與circRNAs相比有優(yōu)勢的地方。

6 外泌體環(huán)狀RNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的臨床意義

6.1 外泌體環(huán)狀RNA作為泌尿系統(tǒng)腫瘤的生物標記物

circRNAs較線性RNA更穩(wěn)定，且在外泌體中，circRNAs 表達比線性RNA 更豐富［59］；除此之外，外泌體存在于血液、尿液和其他體液中，所以可以將外泌體circRNAs作為生物標記物。

前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）是前列腺癌早期診斷的指標之一，但其特異度較低，在部分良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）患者中也會增高［62］。陶文等［63］研究結果顯示，前列腺癌組患者尿液外泌體circRNA-0040507表達水平高于BPH組。且當尿液外泌體circRNA-0040507診斷前列腺癌的臨界值為4.12 copies/ml 時，數(shù)值為診斷前列腺癌最佳臨界值。尿液外泌體circRNA-0040507與PSA二者聯(lián)合診斷前列腺癌時，靈敏度和特異度均高于尿液外泌體circRNA-0040507的單一診斷。表明尿液外泌體circRNA-0040507 可能作為前列腺癌的生物標記物。此外，Li等［49］通過研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者血液外泌體中，外泌體circRNA-0044516的表達明顯上調，高轉移前列腺癌細胞中的外泌體circRNA-0044516 水平高于低轉移前列腺癌細胞中的外泌體circRNA-0044516水平，表明血液外泌體circRNA-0044516 可能是前列腺癌細胞診斷和轉移潛在的生物標記物。Luo 等［64］研究發(fā)現(xiàn)，在PCa發(fā)育過程中，基底細胞的消失和緊密連接的缺失可能促進circAR3從上皮細胞浸潤到氣孔，繞過內皮細胞進入血流。此外，激素和化療也會破壞基質結構，這也可能導致外泌體circRNA-AR3 釋放到循環(huán)系統(tǒng)中去。在PCa發(fā)展過程中，從PCa細胞釋放到血漿中的外泌體circRNA-AR3 增加，因此，血漿外泌體circRNA-AR3 可能是高危原發(fā)性前列腺癌的生物標記物。

研究發(fā)現(xiàn)，外泌體hsa-circRNA-0000285 在膀胱癌組織和血清中表達下調，與順鉑敏感患者相比， 順鉑耐藥患者的circRNA-0000285 水平下降了2/3；而在順鉑耐受的RT4 細胞中，hsa-circRNA-0000285 水平低于親代細胞，因此，血清外泌體hsa-circRNA-0000285 也可作為膀胱癌診斷和化療的生物標記物［37］。Yang 等［45］發(fā)現(xiàn)，膀胱癌術前及術后的血液及尿液中分離的外泌體內均鑒定到了circRNA-TRPS1 的表達，術后血液及尿液中外泌體circRNA-TRPS1 的表達顯著降低，這提示了膀胱癌患者血液及尿液外泌體中的circTRPS1具有作為生物標志物的潛力。

上述作為泌尿系統(tǒng)腫瘤中的生物標志物的外泌體circRNAs見表3。

Table 3 Exosomal circRNAs as biomarkers in urinary tumors表3 作為泌尿系統(tǒng)腫瘤生物標志物的外泌體circRNAs

6.2 外泌體環(huán)狀RNA用于泌尿系統(tǒng)腫瘤的治療靶點

外泌體本身具有納米級尺寸、壽命長以及攜帶能力強等優(yōu)點，而circRNAs 具有良好的穩(wěn)定性、在外泌體中富集的特點。因此，外泌體可作為承載抗腫瘤藥物的天然載體［65］，將抑癌的circRNAs 輸送到靶細胞進行腫瘤治療［26］。一些外泌體circRNAs 在泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用，并介導抗癌藥物的作用。當外泌體中的circRNAs 作為癌基因的時候，可以通過敲低其表達，如輸送對應的si-circRNAs或sh-circRNAs到外泌體中， 再由外泌體分泌si-circRNAs 或sh-circRNAs 到靶細胞中進行抗腫瘤治療；當外泌體中的circRNAs 作為抑癌基因的時候，可以通過過表達這些circRNAs抑制腫瘤進展。

某些外泌體circRNAs 還與泌尿系統(tǒng)腫瘤的耐藥性相關，過表達外泌體中抑制腫瘤細胞耐藥性的circRNAs，或敲低外泌體中促進腫瘤細胞耐藥性的circRNAs均可作為新興的治療靶點。

外泌體circRNA-0000285 已被證實在順鉑耐藥膀胱癌患者中癌組織和血漿的表達低于順鉑敏感膀胱癌患者［37］，因此，可以通過輸送circRNA-0000285 到血漿外泌體中，使circRNA-0000285 過表達，將順鉑耐藥膀胱癌轉變?yōu)轫樸K敏感膀胱癌，從而更有利于治療。Su等［52］發(fā)現(xiàn)，在缺氧狀態(tài)升高的情況下外泌體circRNA-ELP3 可以促進膀胱癌細胞對順鉑的耐藥。沉默外泌體circRNA-ELP3 則顯著降低了膀胱癌細胞的耐藥性，且能將膀胱癌的耐藥性降低到與正常氧條件下測量到的膀胱癌細胞耐藥性一樣的水平。因此，沉默外泌體circRNAELP3可作為治療耐順鉑膀胱癌的一個治療靶點。

Yan等［40］發(fā)現(xiàn)，外泌體circRNA-0035483在腎癌細胞TK10中過表達，通過自噬增強了對吉西他濱和順鉑類藥物的耐藥性，而外泌體circRNA-0035483 基因敲除則增強了TK10 腎癌細胞在體內對吉西他濱的敏感性，成為一個新的治療腎癌的靶點。

前列腺癌耐多西他賽患者的癌組織中外泌體circRNA-XⅠAP 表達顯著上調，Zhang 等［41］敲低了前列腺癌DU145 和PC3 細胞中的外泌體circRNAXⅠAP 后，兩種原本耐多西他賽的癌細胞對多西他賽重新敏感，因而敲低外泌體circRNA-XⅠAP 可以作為耐多西他賽前列腺癌的一個治療靶點。

6.3 外泌體環(huán)狀RNA與泌尿系統(tǒng)腫瘤的TNM分期相關，可用于監(jiān)測腫瘤進展

外泌體circRNAs 在檢材，如癌組織或者血清中表達的高低，可以反映出相關腫瘤的TNM分期，所以外泌體circRNAs 可以在臨床上用來監(jiān)測腫瘤的發(fā)展。

Chi 等［37］發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者的癌組織和血清中外泌體circRNA-0000285與癌旁組織和健康對照組相比顯著降低，通過單因素分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體circRNA-0000285 水平與腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移和TNM 分期顯著相關。當腫瘤≥3 cm，分化程度低，淋巴結轉移（N2-4），有遠處轉移且TNM 分期為Ⅲ、Ⅳ期時，血清外泌體circRNA-0000285 水平普遍較低。Chen 等［38］報道，外泌體circRNA-PRMT5 可以輸出到細胞外微環(huán)境，包括血清和尿液，血清和尿外泌體中高表達的外泌體circRNA-PRMT5與UCB的淋巴結轉移和晚期進展呈正相關，因此外泌體circRNA-PRMT5可用來預測UCB 患者的淋巴結轉移，監(jiān)測腫瘤進展。Su等［52］研究表明，膀胱癌患者的癌組織外泌體circRNA-ELP3水平升高與膀胱癌進展顯著相關，膀胱癌腫瘤分期高于T2 或有淋巴結轉移的患者，癌組織外泌體circRNA-ELP3 表達上調；但高分級和低分級膀胱癌的癌組織外泌體circRNA-ELP3 表達水平之間沒有顯著差異。

Luo 等［64］通過研究表明，前列腺癌組織中的外泌體circRNA-AR3 水平與腫瘤Gleason 評分呈負相關，而血漿中的circRNA-AR3 水平與高Gleason評分和陽性淋巴結轉移呈正相關。

6.4 外泌體環(huán)狀RNA用于監(jiān)測泌尿系統(tǒng)腫瘤患者預后

由于上述臨床意義的存在，檢材中外泌體circRNAs 表達水平的高低也可以用來表示泌尿系統(tǒng)患者預后的好壞。

UCB 患者的血清和尿液外泌體circRNAPRMT5 過表達，且過表達與患者低生存率呈正相關，有望成為UCB患者預后的評估指標［38］。當血清和尿液外泌體circRNA-PRMT5表達水平下降時，表明預后良好。

在前列腺癌患者癌組織中，外泌體circRNAAR3 在良性前列腺和激素初始型前列腺癌中高表達，但在患者接受新輔助激素治療時表達下調，當腫瘤進展到去勢抵抗期時表達進一步降低［64］。內分泌治療是進展期前列腺癌的主要治療方法之一。然而，大部分患者在1～3年內分泌治療后將逐漸進展為去勢抵抗性前列腺癌［66］，因此當患者接受內分泌治療1～3年內，檢測到癌組織中外泌體circRNA-AR3表達下降時，要警惕前列腺癌轉化為去勢抵抗性前列腺癌，提示預后較差。

以上功能、機制和臨床意義顯示，外泌體環(huán)狀RNA 可以影響腫瘤的進程，有助于臨床研究、診斷、提供治療靶點以及預后監(jiān)測。

7 外泌體環(huán)狀RNA及尿液外泌體在泌尿系統(tǒng)腫瘤診療中的應用優(yōu)勢

7.1 尿液外泌體的優(yōu)勢

尿液外泌體在泌尿系統(tǒng)腫瘤的無創(chuàng)診斷和監(jiān)測中具有得天獨厚的優(yōu)勢。首先，尿液易于獲取，具有方便、無創(chuàng)、可重復性等優(yōu)點。其次，采用尿液外泌體診斷泌尿系統(tǒng)腫瘤的準確性和敏感性較高。尿液細胞學檢查是尿路上皮癌（包括膀胱癌、腎盂癌、輸尿管癌、尿道癌）的主要非侵入性診斷方法之一，但其敏感性較低（7%～17%），對低級別尿路上皮癌的診斷準確性較低［67］。Xu 等［68］對來自16 篇文章的22 項泌尿系統(tǒng)腫瘤（腎癌、膀胱癌、前列腺癌）研究建立了一項Meta分析，包括3 224例患者和1 360 名健康對照。結果顯示，尿液外泌體的診斷泌尿系統(tǒng)腫瘤的準確性較高，AUC為0.92，敏感性為83%，均優(yōu)于尿液細胞學檢查。

尿液中難以捕獲脫落的腫瘤細胞，但是外泌體從腫瘤細胞不斷釋放到尿液中，所以尿液中更易檢測到腫瘤細胞分泌的外泌體。外泌體可以攜帶相應腫瘤來源的細胞抗原，因此診斷特異性較高［69］，外泌體中的核酸內容物可直接反映泌尿系統(tǒng)腫瘤細胞的特征。穩(wěn)定性方面，尿液外泌體長期儲存或在-80℃條件下均可以保持完整［69］，這表明尿液外泌體穩(wěn)定性較高，可以用來檢測其內容物。

雖然尿液外泌體可作為泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷的生物標志物，但基本都是關于腎癌、膀胱癌和前列腺癌的研究，對于輸尿管癌、腎盂癌、附睪癌和睪丸癌等低發(fā)病率泌尿系統(tǒng)腫瘤，目前仍沒有相關報道。

7.2 外泌體環(huán)狀RNA的優(yōu)勢

首先，由于細胞外囊泡可由多種細胞分泌，所以外泌體的大小及其內容物的異質性反映了原始細胞的狀態(tài)和類型，因此外泌體內容物可作為各種疾病診斷或預后觀察的生物標志物［70］。其次，外泌體circRNAs可以被分泌到包括血液、尿液、腹水、唾液、膽汁、腦脊液等多種體液中［18］，比單純的血液標本來源更廣。從相應體液中提取外泌體，檢測其分泌的腫瘤特異性circRNAs 可作為一種確定泌尿系統(tǒng)癌癥發(fā)展和轉移的手段。而且外泌體circRNAs 本身在作為腫瘤生物標記物、腫瘤進程和治療、預后的研究中越來越受到關注，成為一個新興熱點。再者，相比一些線性RNA 如miRNAs，circRNAs 更容易被分選到外泌體中［12］。此外，來自相應癌細胞分泌的外泌體中含有高度特異性的circRNAs，由于有外泌體的保護，所以外泌體內的特異性circRNAs 可以防止其核酸分子被血液中的核糖核酸酶（RNase）降解［71］，由此可見，外泌體中circRNAs 的檢測可能優(yōu)于血液循環(huán)系統(tǒng)中游離circRNAs的檢測。不僅如此，相較取材于癌組織，體液標本的獲取所致的創(chuàng)口更小，易大量獲得，出血更少，甚至無創(chuàng)，例如尿液。如果能從尿液外泌體中提取到所需檢測的特異性的circRNAs，則可以無創(chuàng)就能確定對應泌尿系統(tǒng)腫瘤的進展，減少對患者的傷害。

泌尿系統(tǒng)腫瘤直接分泌的外泌體可以釋放到尿液中，所以尿液外泌體對泌尿系統(tǒng)腫瘤的診斷和判斷預后有更多的敏感性和特異性［72］。

8 總結與展望

本文首先介紹了外泌體circRNAs 的分選、釋放、檢測方法。其次，介紹了其在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的生物學功能和作用機制。并將泌尿系統(tǒng)腫瘤中的外泌體circRNAs 與circRNAs 進行了比較。最后闡明了外泌體circRNAs 可用于泌尿系統(tǒng)腫瘤的臨床意義以及外泌體circRNAs 的優(yōu)勢所在，幫助讀者更好地了解外泌體circRNAs 與現(xiàn)流行的腫瘤檢測方法的異同。

外泌體circRNAs 是目前研究的熱點，但仍有很多問題沒有解決。例如，circRNAs 分選入外泌體的具體機制并沒有完全研究清楚。在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，雖然外泌體circRNAs 的生物學功能方面已經有了一些研究，但是還有一些生物學功能和作用機制沒有研究全面。例如，外泌體circRNAs 影響腫瘤血管生成這一生物學功能在其他一些系統(tǒng)，如消化系統(tǒng)中已有研究，但在泌尿系統(tǒng)中的研究仍未有成果。在分子機制方面，外泌體circRNAs 可經m6A 修飾從而導致某些腫瘤的侵襲和轉移，例如結直腸癌［46］。但是經m6A修飾的外泌體circRNAs與泌尿系統(tǒng)腫瘤的關系，目前還沒有研究報道。同時，大部分研究都僅停留于circRNAs 經過m6A 修飾后，對腫瘤發(fā)展、轉移的影響，并未具體闡明外泌體與circRNAs的關系。

在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中，癌細胞與相鄰健康細胞之間的相互干擾至關重要，而惡性細胞產生的外泌體circRNAs 在這一過程中起著非常重要的作用［73-74］。外泌體circRNAs 可以作為泌尿系統(tǒng)腫瘤的生物標記物，對早期的診斷、腫瘤的TNM分期、預后有著重要意義。

目前外泌體circRNAs 的臨床應用仍存在很多問題。外泌體提取與純化的技術有限，效率不高且缺乏統(tǒng)一標準，甚至缺少有效區(qū)分外泌體和微囊泡的特異性標記物和技術［5］。一些外泌體circRNAs是作為正常RNA 剪接異常的指標還是基因過表達擴增的腫瘤指標還有待進一步研究。此外，現(xiàn)在仍無法大規(guī)模生產特定供體細胞的外泌體用于靶向藥物載體。對于未來的研究方向：首先，需要circRNAs 分選進入外泌體的具體機制，這可以為治療相關腫瘤提供上游治療靶點；其次，優(yōu)化外泌體的獲取和檢測方法，能提取更多的外泌體；第三，外泌體分泌circRNAs 可以介導細胞間通訊，影響細胞的生物學行為，所以可以從細胞間通訊角度入手，闡明與人類癌癥相關的外泌體circRNAs分子機制，為泌尿系統(tǒng)腫瘤的診療提供新的線索和方法；最后，將外泌體作為靶向藥物的載體，控制外泌體向靶細胞分泌治療性circRNAs 也可能成為新的癌癥靶向治療的方法，值得進一步研究。