基于響應(yīng)面的蛹蟲草菌質(zhì)固體發(fā)酵工藝條件優(yōu)化*

熊 薇，黃美霞，魏林婕，吳水生

（福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350122）

蛹蟲草（Cordyceps militaris Link）又名北冬蟲夏草、北蟲草，屬真菌界（Fungi）子囊菌門（Ascomycota） 子囊菌綱（Ascomycetes） 肉座菌目（Hypocreales） 麥角菌科 （Clavicipitaceae） 蟲草屬 （Cordyceps）模式種[1]。蛹蟲草具有與冬蟲夏草相似的活性成分，包括蟲草多糖、蟲草酸、蟲草素、氨基酸、超氧化物歧化酶SOD（superoxide dismutase） 等，而且相比于冬蟲夏草，蛹蟲草價格更親民，因此被用作冬蟲夏草的替代品進(jìn)行開發(fā)利用[2]。近年來，關(guān)于蛹蟲草子實體產(chǎn)量優(yōu)化和活性成分含量優(yōu)化方面的研究已獲得一些成果，但這些研究的重點都聚焦于子實體[3]。菌質(zhì)是指包含菌絲和培養(yǎng)基質(zhì)的復(fù)合固體發(fā)酵產(chǎn)物。有報道指出，固體發(fā)酵的蛹蟲草殘基中也含有蟲草多糖、蟲草素、SOD、多肽等有效成分[4]。因此試驗直接以菌質(zhì)為研究對象，對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期縮短發(fā)酵周期，提高有效成分含量，有效節(jié)約成本。

蟲草素最早于1951年由德國科學(xué)家Cunningham等[5]從蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分離得到，又稱3’-脫氧核苷 (3-deoxyadenosine)，具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗焦慮、降血糖、降血脂等藥理作用[6]。蟲草素在蛹蟲草中的含量甚至高于冬蟲夏草[7]，因此試驗以蟲草素含量為評價指標(biāo)，對菌質(zhì)發(fā)酵時間和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為后期發(fā)酵菌質(zhì)的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草菌株MF43，由福建農(nóng)林大學(xué)傅俊生課題組惠贈。

小麥和土豆均為市購；蟲草素（批號N1017AS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），大連美侖生物技術(shù)有限公司；腺苷（批號N24D11W135689，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、蔗糖（批號A25GS146834，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、麥芽糖（批號A02GS143905，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、黃豆粉（批號S24F12H139852，粉質(zhì)粗細(xì)為80目～120目）、可溶性淀粉（批號A16GS145576）、維生素B1（批號D16N11S131243，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），上海源葉生物科技有限公司；酵母粉（批號2846115-02）、蛋白胨（批號2896804），OXOID公司；發(fā)酵用蠶蛹粉（水溶性，批號430H031），北京索萊寶科技有限公司；無水葡萄糖（批號20141008）、磷酸二氫鉀（批號20200915）、無水硫酸鎂（批號20140122），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇（批號I1140207111，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤100%），默克股份兩合公司。

1.2 儀器

TDL-40B離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；全自動超聲波清洗機，湖北鼎泰恒勝科技設(shè)備有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HPX-300BSH-III恒溫恒濕箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；MGC-300H人工氣候箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ClassⅡType A2型生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；ZHWY-2112B全溫型大容量恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 菌懸液制備

從PDA斜面培養(yǎng)基中挑出0.5 cm×0.5 cm大小的母種菌塊，接種到PDA平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)皿備用。取0.5 cm×0.5 cm大小的菌塊接種到PD培養(yǎng)基中，在23℃、140 r·min-1條件下培養(yǎng)4 d～7 d，制成液體菌種。取5 mL液體菌種，加入30 mL無菌水混勻，制成菌懸液。

1.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)制備

稱取15 g小麥置于240 mL培養(yǎng)罐中（以下試驗均采用該規(guī)格培養(yǎng)罐），用蒸餾水浸泡1 h后濾去水分。按1.0∶1.2的比例加入營養(yǎng)液（每升營養(yǎng)液的配方為：葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、KH2PO41 g、MgSO40.5 g、VB 10.5 g），用聚丙烯透氣蓋封口，121℃滅菌30 min。在培養(yǎng)罐中接入3 mL菌懸液；在溫度為18℃、相對濕度為60%、黑暗條件下培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)移到光照培養(yǎng)箱中，在溫度為20℃、相對濕度為80%～90%、光照時間為10 h～12 h條件下培養(yǎng)至第15天取出干燥。

1.5 蟲草素含量測定

1.5.1 樣品制備

取發(fā)酵15 d的菌質(zhì)，60℃烘干，粉碎。準(zhǔn)確稱取粉末1.0 g，加20 mL超純水進(jìn)行超聲提取。提取時間為45 min，提取溫度為45℃。抽濾后，取濾液1 mL加入甲醇定容至5 mL，靜置，過0.22微孔濾膜后得到待測液。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備

精密稱取蟲草素1 mg置于10 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解并定容，制成標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。

1.5.3 高效液相色譜（HPLC）方法學(xué)建立

色譜條件：色譜柱型號為Welch Ultimate XBC18柱（4.6×150 mm，粒徑為5 μm）；流動相為V（甲醇） ∶V （水） =16∶84，流速為 1 mL·min-1，檢測波長為260 nm，進(jìn)樣量為5 μL，溫度為30℃。取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，稀釋蟲草素質(zhì)量濃度分別為2 μg·mL-1、4 μg·mL-1、6 μg·mL-1、8 μg·mL-1、10 μg·mL-1、12 μg·mL-1、14 μg·mL-1、16 μg·mL-1、18 μg·mL-1、20 μg·mL-1，按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積。以蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.4 HPLC方法學(xué)驗證

1） 精密度試驗：取對照品 4 μg·mL-1、8 μg·mL-1和16 μg·mL-13個質(zhì)量濃度溶液，按上述色譜條件每個質(zhì)量濃度溶液連續(xù)測定3次，記錄峰面積。

2）重復(fù)性試驗：供試品溶液各取6份，按上述色譜條件每份連續(xù)測定3次，計算含量。

3） 穩(wěn)定性試驗：同一批樣品取3份，制備溶液，分別于0、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h進(jìn)樣，測定蟲草素峰面積。

1.6 單因素試驗篩選

1.6.1 碳源單因素試驗

以1.4中的營養(yǎng)液為基礎(chǔ)，其他成分不變，分別用蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉替換葡萄糖作為碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以蟲草素含量為檢測標(biāo)準(zhǔn)，篩選最適碳源。

1.6.2 氮源單因素試驗

以1.4中的營養(yǎng)液為基礎(chǔ)，其他成分不變，分別用蠶蛹粉、酵母粉、黃豆粉替換蛋白胨作為氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以蟲草素含量為檢測標(biāo)準(zhǔn)，以確定最適氮源。

1.6.3 料液比單因素試驗

使用1.4中的發(fā)酵培養(yǎng)基和營養(yǎng)液，設(shè)置不同料液比 （1.0∶1.0、1.0∶1.1、1.0∶1.2、1.0∶1.3、1.0∶1.4）進(jìn)行培養(yǎng)，以蟲草素含量為檢測標(biāo)準(zhǔn)，選擇最適料液比。

1.6.4 小麥裝料量單因素試驗

使用1.4中的發(fā)酵培養(yǎng)基和營養(yǎng)液，將小麥裝料量設(shè)置為9 g、12 g、15 g、18 g和21 g進(jìn)行培養(yǎng)，以蟲草素含量為檢測標(biāo)準(zhǔn)，確定最合適的小麥裝料量。

1.6.5 接種量單因素試驗

使用1.4中的發(fā)酵培養(yǎng)基和營養(yǎng)液，將菌懸液接種量設(shè)置為1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL進(jìn)行培養(yǎng)，以蟲草素含量為檢測標(biāo)準(zhǔn)，以確定最合適的接種量。

1.6.6 培養(yǎng)時間單因素試驗

使用1.4中的發(fā)酵培養(yǎng)基和營養(yǎng)液，培養(yǎng)時間分別為 0、5 d、9 d、11 d、13 d、15 d、17 d、19 d、21 d、23 d、25 d、27 d、29 d、31 d、33 d、35 d、37 d、39 d、41 d、43 d、45 d、47 d、49 d時取樣，以蟲草素含量為檢測標(biāo)準(zhǔn)，以明確蟲草素含量最高的時間。

1.6.7 腺苷質(zhì)量濃度單因素試驗

使用1.4中的發(fā)酵培養(yǎng)基和營養(yǎng)液，在營養(yǎng)液中加入質(zhì)量濃度分別為 6 g·L-1、12 g·L-1、24 g·L-1、48 g·L-1、96 g·L-1的腺苷，以蟲草素含量為檢測標(biāo)準(zhǔn)，以確定最合適的腺苷質(zhì)量濃度。

1.7 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素篩選結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面法優(yōu)化。以上每個試驗重復(fù)3次。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)置碳源為可溶性淀粉、氮源為黃豆粉、小麥裝料量為15g、培養(yǎng)時間為17d為固定條件，選擇料液比、接種量、腺苷質(zhì)量濃度3個因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗因素及水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平表Tab.1 Response surface experiment factor level table

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品圖譜與樣品圖譜

以蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制得到曲線詳見圖1。

如圖1所示，供試品溶液色譜圖中蟲草素的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜圖一致，說明樣品中含有蟲草素這一成分。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（A） 與樣品（B） HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of standard (A)and sample (B)

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察

利用HPLC在1.5.3色譜條件下對不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測定，以峰面積（Y）對各質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得蟲草素標(biāo)準(zhǔn)液線性回歸方程為：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.999。

結(jié)果表明，蟲草素的質(zhì)量濃度在2 μg·mL-1～20 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 精密度試驗結(jié)果

對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行精密度試驗，測得蟲草素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（relative standard deviation） 為0.54%，表明儀器精密度良好，符合試驗要求。

2.2.3 重復(fù)性試驗結(jié)果

對樣品進(jìn)行重復(fù)性試驗，測得蛹蟲草菌質(zhì)中蟲草素峰面積的RSD為0.85%，表明方法的重復(fù)性良好，符合試驗要求。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

對樣品進(jìn)行穩(wěn)定性試驗，測得蛹蟲草菌質(zhì)中蟲草素峰面積的RSD為1.60%，表明供試品溶液中蟲草素在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 碳源篩選

使用不同碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以葡萄糖組為對照，分析不同碳源對菌質(zhì)中蟲草素含量的影響，詳見圖2。

根據(jù)圖2結(jié)果可知，不同碳源對菌質(zhì)蟲草素含量影響顯著（P<0.05）。其中碳源為可溶性淀粉時，菌質(zhì)中蟲草素含量最高，達(dá)0.98 mg·g-1。因此選擇可溶性淀粉作為后續(xù)試驗的碳源。

圖2 碳源對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.2 Effect of carbon source on the content of fungal substance

2.3.2 氮源篩選

以蛋白胨組為對照，分析不同氮源對菌質(zhì)中蟲草素含量的影響情況，詳見圖3。

圖3 氮源對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on the content of fungal substance

根據(jù)圖3結(jié)果可知，不同氮源對菌質(zhì)蟲草素含量影響顯著（P<0.05）。當(dāng)?shù)礊辄S豆粉時，菌質(zhì)中蟲草素含量最高，達(dá)1 mg·g-1；當(dāng)?shù)礊榻湍阜蹠r，菌質(zhì)中蟲草素含量最低。因此選擇黃豆粉作為后續(xù)試驗的氮源。

2.3.3 料液比篩選

以料液比為1.0∶1.2組為對照，不同料液比對菌質(zhì)中蟲草素含量的影響情況，詳見圖4。

圖4 料液比對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the content of fungal substance

根據(jù)圖4結(jié)果可知，不同料液比對菌質(zhì)蟲草素含量也具有一定影響（P<0.05），可作為響應(yīng)面考察因素。當(dāng)料液比為1.0∶1.2時，菌質(zhì)蟲草素含量最高，達(dá)0.68 mg·g-1，因此選擇料液比1.0∶1.2進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3.4 小麥裝料量篩選

以小麥裝料量為15 g組為對照，不同小麥裝料量對菌質(zhì)蟲草素含量的影響情況，詳見圖5。

圖5 小麥裝料量對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.5 Effect of wheat charge amount on the content of fungal substance

根據(jù)圖5結(jié)果可知，不同小麥裝料量對菌質(zhì)蟲草素含量有影響（P<0.05）。當(dāng)小麥裝料量為15 g時，菌質(zhì)中蟲草素含量最高，達(dá)0.68 mg·g-1；當(dāng)小麥裝料量為18 g時，菌質(zhì)蟲草素含量有所降低；當(dāng)小麥裝料量增加到21 g時含量又有所提高，然而并未超過15 g時的蟲草素含量。因此，從經(jīng)濟適用角度考慮，以小麥裝料量為15 g進(jìn)行后續(xù)試驗較為合理。

2.3.5 接種量篩選

以接入3 mL菌懸液組為對照，不同菌懸液接種量對菌質(zhì)蟲草素含量的影響情況，詳見圖6。

圖6 接種量對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.6 The effect of inoculum amount on the content of fungal substance

根據(jù)圖6結(jié)果可知，菌懸液接種量對菌質(zhì)中蟲草素含量影響顯著（P<0.05）。當(dāng)接種量為2 mL時，菌質(zhì)蟲草素含量最高，達(dá)0.89 mg·g-1；當(dāng)接種量為3 mL時，菌質(zhì)蟲草素含量降低；而后蟲草素含量隨接種量的增加而增加，但均未超過2 mL時的含量。因此，從經(jīng)濟適用角度考慮，選擇接種量為2 mL進(jìn)行后續(xù)試驗較為合理。由于接種量在1 mL～3 mL時差異顯著，因此可將此因素選作響應(yīng)面考察因素。

2.3.6 培養(yǎng)時間篩選

不同培養(yǎng)時間對菌質(zhì)中蟲草素含量的影響情況詳見圖7。

圖7 培養(yǎng)時間對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.7 The effect of culture time on the content of fungal substance

根據(jù)圖7結(jié)果可知，培養(yǎng)時間對菌質(zhì)中蟲草素含量影響顯著（P<0.05），蟲草素含量先隨培養(yǎng)時間的增加而增加，到臨界點后數(shù)值維持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。0～5 d時，是菌絲長滿培養(yǎng)基的階段，生長較緩慢，因此蟲草素積累也較緩慢；10 d左右菌絲長滿，且由黑暗培養(yǎng)轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，培養(yǎng)基中蟲草素的含量隨著培養(yǎng)時間延長快速積累；在17 d時達(dá)到峰值，而后增長緩慢。這一現(xiàn)象與Wen[8]和胡龍[9]的報道相似，說明培養(yǎng)基中蟲草素累積到一定量后，延長培養(yǎng)時間對其含量影響不大。

2.3.7 腺苷質(zhì)量濃度篩選

添加不同質(zhì)量濃度的腺苷對菌質(zhì)中蟲草素含量的影響情況詳見表8。

根據(jù)圖8結(jié)果可知，腺苷對菌質(zhì)中蟲草素含量影響顯著（P<0.05），可作為響應(yīng)面考察因素。腺苷是蟲草素的前體化合物，添加腺苷有助于蟲草素的積累。當(dāng)腺苷質(zhì)量濃度達(dá)到48 g·L-1時，菌質(zhì)中蟲草素積累最多，達(dá)到4.06 mg·g-1；與不添加腺苷的相比，蟲草素含量增加了4.97倍。

圖8 腺苷質(zhì)量濃度對菌質(zhì)蟲草素含量的影響Fig.8 Effects of adenosine mass concentration on substance content in mycoplasma

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)試驗設(shè)計方案，選取料液比、接種量、腺苷質(zhì)量濃度作為自變量，以蟲草素含量作為響應(yīng)面值設(shè)計響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Tab.2 Results of response surface experiment

根據(jù)表2響應(yīng)面試驗結(jié)果，采用Design-Expert 10.0.7對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到蛹蟲草菌質(zhì)蟲草素含量（Y） 與料液比（A）、接種量（B）、腺苷濃度（C）的二次項多元回歸方程為：

該回歸方程相關(guān)系數(shù)R2為0.983 9。

對上述方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

從表3結(jié)果可知，該回歸模型極顯著（P<0.0001），失擬項不顯著（P>0.05），說明該模型成立。相關(guān)系數(shù)R2為0.983 9，說明模型擬合程度較好。R2Adj為0.963 2，R2Pre為0.879 9，二者差值小于0.2，說明試驗誤差小，方法可靠。模型中變量A、B、C、A2、B2、C2的P值均小于0.01，各因素對蟲草素含量的影響依次為C>B>A。

表3 試驗結(jié)果方差分析Tab.3 Analysis of variance of experimental results

2.4.1 響應(yīng)面圖形分析

依據(jù)擬合的響應(yīng)曲面形狀，研究不同料液比、接種量、腺苷質(zhì)量濃度對蟲草素含量的影響。分別將料液比、接種量、腺苷質(zhì)量濃度以0水平固定在模型中，從而獲得另外2個因素的交互影響結(jié)果。二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖9～圖11。

由圖9～圖 11可知，料液比 （A） 與接種量（B）、料液比（A） 與腺苷質(zhì)量濃度（C）、接種量（B）與腺苷質(zhì)量濃度（C） 之間均對蟲草素含量變化有一定交互作用，但作用不顯著。

圖9 料液比與接種量交互作用的等高線與響應(yīng)面Fig.9 Contour line and response surface of interaction between solid-liquid ratio and inoculum amount

圖10 料液比與腺苷質(zhì)量濃度交互作用的等高線與響應(yīng)面Fig.10 Contours and response surfaces of the interaction of solid-liquid ratio and adenosines mass concentration

圖11 接種量與腺苷質(zhì)量濃度交互作用的等高線與響應(yīng)面Fig.11 Contours and response surfaces of the interaction between inoculum amount and adenosine mass concentration

2.4.2 最佳條件的預(yù)測及驗證試驗

通過Design-Expert 10.0.7軟件，預(yù)測蟲草素含量最高的發(fā)酵工藝條件為：料液比為1.000∶1.295、接種量為2.257 mL、腺苷質(zhì)量濃度為75.534 g·L-1，此時蟲草素含量為3.596 mg·g-1。結(jié)合實際操作情況，將最佳發(fā)酵工藝修正為：料液比為1.0∶1.3、接種量為2 mL、腺苷質(zhì)量濃度為76 g·L-1，在此條件下重復(fù)5次，得到蟲草素含量平均為3.718 mg·g-1，與預(yù)測值相對誤差小于5%。表明該方程與實際情況擬合良好，相應(yīng)優(yōu)化模型真實可行，與優(yōu)化前相比，蟲草素含量提高了4.47倍，具有指導(dǎo)生產(chǎn)的實用價值。

3 結(jié)論與討論

在傳統(tǒng)工序中，蟲草素的主要來源是野生蛹蟲草子實體，然而野生蛹蟲草資源有限，因此多項研究對人工栽培蛹蟲草進(jìn)行了嘗試。通過優(yōu)化栽培基質(zhì)和培養(yǎng)條件，提高子實體中蟲草素含量，該方法雖然能夠有效提高蟲草素含量，但發(fā)酵時間較長。近年來有學(xué)者對菌質(zhì)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)菌質(zhì)中也含有蟲草素。因此可以直接對菌質(zhì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以縮短培養(yǎng)周期。

試驗對發(fā)酵菌質(zhì)的碳源、氮源、料液比、接種量、小麥裝料量、培養(yǎng)時間、腺苷添加的質(zhì)量濃度進(jìn)行了單因素分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，碳源為可溶性淀粉時，蟲草素含量較高。這是由于淀粉是大分子碳源，菌絲體不易吸收，因此生長緩慢，給次級代謝產(chǎn)物蟲草素的合成提供了足夠的時間。當(dāng)?shù)礊辄S豆粉時，蟲草素含量較高。這一現(xiàn)象提示植物蛋白也可作為氮源，促進(jìn)菌絲體生長，且效果更佳。料液比、接種量、小麥裝料量的結(jié)果揭示了菌絲的生長需要水分、一定的菌種量和基本營養(yǎng)物，但并不是越多越好。因為過多的水分和培養(yǎng)料會影響基質(zhì)整體的透氣性，從而影響菌絲體生長。接種后0～5 d，菌絲處于有絲分裂階段，此時蟲草素的積累較緩慢，處于較低水平；菌絲長滿基質(zhì)后，蟲草素的積累量迅速增加，持續(xù)一段時間后處于相對穩(wěn)定的水平。為縮短培養(yǎng)周期，在蟲草素積累達(dá)到峰值時即可停止發(fā)酵。腺苷是合成蟲草素的前體化合物，適量的增加腺苷有助于蟲草素的合成。但試驗中由于添加腺苷的質(zhì)量濃度跨越較大，檢測時發(fā)現(xiàn)存在大量腺苷質(zhì)量未轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，損耗較大。因此實際應(yīng)用時需斟酌腺苷添加量。

將單因素篩選的結(jié)果用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)料液比、接種量和腺苷質(zhì)量濃度三者對蟲草素含量的影響均顯著，然而交互作用影響均不顯著。這可能是由于腺苷質(zhì)量濃度梯度過大，導(dǎo)致其對蟲草素含量的影響與另外兩個因素不在一個水平上。因此在后續(xù)試驗中，可對該因素進(jìn)行調(diào)整，確保增加蟲草素積累的同時減少腺苷的損耗。