1株野生靈芝的分離鑒定及生物學(xué)特性分析*

劉冬梅，孫雪言，嚴碧云，陳澤群，刁文彤，梁呈元**

（1.江蘇省中國科學(xué)院 植物研究所，江蘇 南京 210014；2.武漢工程大學(xué)，湖北 武漢 430205；3.武昌工學(xué)院，湖北 武漢 430065）

靈芝（Ganoderma lucidum）俗稱“赤芝”，為多孔菌科（Polyporaceae） 靈芝屬（Ganoderma） 真菌。靈芝作為我國重要的傳統(tǒng)中藥，始載于最早的藥物學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有扶正固本、延年益壽之功效，被歸為上品；如今被《中華人民共和國藥典》收載，是法定的中藥藥材[1]。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝富含三萜、多糖等多種活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保護神經(jīng)、改善肝功能、抗氧化、抗病毒等廣泛藥理作用，臨床上常用于輔助治療慢性支氣管炎、消化不良、神經(jīng)衰弱、高血壓、高血糖、肝炎和癌癥等[2-4]。近年來，隨著人們保健意識的增強，靈芝產(chǎn)品的開發(fā)越來越受到重視。目前，我國靈芝主栽品種大多引自國外，易出現(xiàn)菌種活性退化、子實體品質(zhì)難以控制等問題[5]。因此在保護生態(tài)環(huán)境的前提下，充分發(fā)掘野生資源、豐富靈芝菌種資源仍是一項重要的工作。

通過對1株采集自南京紫金山的野生菌株子實體進行組織分離、菌絲純化，得到菌株ZJ-1，并以形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列分析相結(jié)合的方法進行品種鑒定。同時開展菌株ZJ-1的生物學(xué)特性、馴化栽培及孢子觀察等試驗，以期為紫金山野生資源開發(fā)提供參考，為開展靈芝子實體發(fā)育、孢子形成等機制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

野生菌株的子實體，采自江蘇省南京市紫金山的一片落葉地。挑選尚未木質(zhì)化、無破損的子實體，用袋子裝好帶回實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)料

PDB培養(yǎng)基：取去皮馬鈴薯200 g，均勻切片后于鍋中煮沸20 min，濾網(wǎng)過濾除渣，加入葡萄糖20 g，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：1 L的PDB中加入瓊脂15 g。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂15 g，加水定容至1 L，121℃高壓滅菌20 min。

栽培培養(yǎng)料（配比以質(zhì)量分數(shù)表示）：木屑20%、棉籽殼58%、麩皮20%、蔗糖1%、石膏1%，含水量為60%左右，121℃高壓滅菌180 min。

1.1.3 主要儀器及試劑

主要儀器：GI54DS高壓蒸汽滅菌鍋，致微儀器有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇凈安泰設(shè)備有限公司；DNP-9082恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；ETC821 PCR擴增儀，南京喬貝琳生物科技有限公司；JY300C電泳儀、JY04S-3E凝膠成像系統(tǒng)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；QUANTA 200掃描電子顯微鏡，美國FEI公司。

主要試劑：CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）和引物合成，上海生工生物工程有限公司；高保真酶、TA克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；感受態(tài)細胞DH5α、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，南京擎科生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離與純化

用水沖洗菌株幼嫩子實體表面的泥土，去掉菌柄后用75%乙醇進行表面消毒，用無菌解剖刀自菌柄處切開少許，然后將子實體掰開。在菌蓋及菌蓋與菌柄交界處切取米粒大小的組織放在PDA平板培養(yǎng)基上，用封口膜封口后于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察菌絲生長情況，將未污染的菌絲轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，4℃保藏。

1.2.2 菌種的鑒定

1） 形態(tài)學(xué)特征

用無菌打孔器在生長著新鮮菌絲的PDA平板培養(yǎng)基上打孔，接種于新的PDA平板培養(yǎng)基中央，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1周，觀察菌絲的生長情況。將滅菌后的蓋玻片斜插入含有菌絲的PDA平板培養(yǎng)基中，待菌絲生長至蓋玻片上后觀察菌絲的顯微結(jié)構(gòu)。

2）ITS序列擴增與測序

采用CTAB法提取靈芝菌絲的基因組DNA[6]。以提取的DNA為模板，使用真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行PCR擴增。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將片段大小正確的PCR產(chǎn)物純化后連接T載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。挑取單克隆，經(jīng)PCR檢測后送到上海生工生物工程有限公司測序。

3）系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

所得ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源比對，以硬毛革孔菌（Coriolopsis caperata） 為外群[7]，用MEGA 5.0軟件采用鄰接法NJ（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap參數(shù)設(shè)定為1 000。

1.2.3 菌絲培養(yǎng)特性研究

1） 溫度對菌絲生長的影響

在直徑為5.5 cm的PDA平板培養(yǎng)基上用打孔器接種直徑為7 mm的菌絲塊，分別于20℃、25℃、28℃、32℃和37℃避光培養(yǎng)，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。當(dāng)有一組菌絲長滿平板時，采用“十”字交叉法測量全部供試菌落直徑，并記錄菌絲生長情況[8]。

2）pH對菌絲生長的影響

用0.1 mol·L-1的HCl和NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。接種、培養(yǎng)及測量方法同上。

3）碳源對菌絲生長的影響

以不加葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照（CK），配制分別以葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘油作為碳源的培養(yǎng)基。接種、培養(yǎng)及測量方法同上。

4）氮源對菌絲生長的影響

以不加蛋白胨的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照（CK），配制分別以蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、氯化銨、尿素和麩皮作為氮源的培養(yǎng)基。接種、培養(yǎng)及測量方法同上。

1.2.4 出菇試驗

為了檢測菌種純度及驗證分離的菌絲是否具有出菇能力，選用袋料栽培的方法進行出菇試驗。每個菌袋裝濕料約800 g，在培養(yǎng)料中間插入一個長度為16 cm的打孔棒，封口后于121℃條件下高壓滅菌3 h，冷卻至室溫后于無菌超凈臺取出打孔棒，將準備好的母種填滿孔洞，完成接種。將菌袋置于28℃避光培養(yǎng)。

1.2.5 菌管的顯微觀察

待子實體成熟后，縱切其菌管部位，用炭膜將切片粘在掃描電鏡的樣品臺上，噴上一薄層導(dǎo)電金，用掃描電鏡觀察。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2013軟件進行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用平均值±標準差表示。通過SPSS 16軟件進行統(tǒng)計分析，檢測其差異顯著性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生子實體形態(tài)特征

在南京市紫金山的一片落葉地采集到的野生子實體的形態(tài)見圖1。

圖1 野生菌株子實體形態(tài)Fig.1 The fruiting bodies morphology of wild strains

如圖1所示，幼小子實體邊緣呈黃白色，較嫩；成熟子實體較小，菌蓋呈腎型，表面紅褐色，有似漆樣光澤；有菌柄，菌柄側(cè)生且較短。通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，采集到的野生子實體符合典型靈芝的形態(tài)特征。

2.2 分離純化后菌絲的形態(tài)特征

對野生菌株進行組織分離培養(yǎng)，組織塊在PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d～3 d，菌蓋及菌蓋與菌柄交界處的組織塊均有少量白色棉絮狀菌絲長出，將其命名為ZJ-1。菌株ZJ-1的菌絲生長1周時的觀察結(jié)果見圖2A。挑取組織塊邊緣的菌絲接種到直徑為9.0 cm的PDA平板培養(yǎng)基上，大約7 d可長滿，得到純化后的菌株ZJ-1，其菌絲生長情況及菌落形態(tài)見圖2B，菌絲形態(tài)觀察見圖2C。

圖2 組織分離培養(yǎng)（A） 以及純化菌株ZJ-1的菌落（B）、菌絲（C） 形態(tài)觀察Fig.2 Tissue isolation culture(A),colony(B)and mycelia(C)morphology observation of purified strain ZJ-1

如圖2所示，純化菌株ZJ-1的菌落呈規(guī)則圓形，邊緣整齊，無分泌物；菌絲潔白純凈，濃密，顏色一致。微觀形態(tài)顯示，菌株ZJ-1的菌絲細長，粗細均勻，有分枝，且具有鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)（圖2C箭頭指示位置）。

2.3 菌株ZJ-1的ITS序列分析

經(jīng)PCR擴增和測序分析，獲得長度為636 bp的ITS序列，將ITS序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號MW362341。根據(jù)BLAST比對結(jié)果并結(jié)合文獻報道，以硬毛革孔孔菌Coriolopsis caperata為外群，選擇靈芝屬不同真菌的ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]，詳見圖3。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由圖3可知，菌株ZJ-1在系統(tǒng)發(fā)育樹上與Ganoderma lucidum聚為一支，支持率為100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株ZJ-1鑒定為靈芝Ganoderma lucidum。

2.4 菌絲培養(yǎng)特性研究

2.4.1 溫度對菌絲生長的影響

5個不同溫度條件下靈芝菌株ZJ-1的菌絲生長情況見表1。

表1 溫度對靈芝菌株ZJ-1菌絲生長的影響Tab.1 Effect of temperature on mycelial growth of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

由表1可知，靈芝菌株ZJ-1在20℃～37℃的培養(yǎng)條件下均可生長；溫度為20℃、25℃和37℃時生長較慢，但生長速度差異不顯著；溫度為28℃、32℃時生長速度最快，菌絲最濃密，生長速度差異也不顯著。綜合菌絲的生長速度和長勢，確定靈芝菌株ZJ-1菌絲生長最適溫度為28℃～32℃。

2.4.2 pH對菌絲生長的影響

6個不同pH條件下靈芝菌株ZJ-1的菌絲生長情況見表2。

由表2可知，靈芝菌株ZJ-1在pH為4.0～9.0的培養(yǎng)基中均能生長，且pH為4.0～7.0時菌絲長勢均較好。其中，培養(yǎng)基pH為4.0和5.0時，菌絲生長最好；pH為6.0和7.0時，菌絲生長速度略有減慢；當(dāng)pH高于7.0時，菌絲生長速度明顯變慢。綜合菌絲的生長速度和長勢，確定靈芝菌株ZJ-1菌絲生長的最適pH為4.0～5.0。

表2 pH對靈芝菌株ZJ-1菌絲生長的影響Tab.2 Effect of pH on mycelial growth of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

2.4.3 碳源對菌絲生長的影響

8種不同碳源培養(yǎng)基中靈芝菌株ZJ-1的菌絲生長情況見表3。

表3 碳源對靈芝菌株ZJ-1菌絲生長的影響Tab.3 Effect of carbon source on mycelial growth of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

由表3可知，靈芝菌株ZJ-1在添加不同碳源的培養(yǎng)基中均可生長，但菌絲對碳源的利用能力不同。以可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖為碳源時菌絲生長最快；其次為果糖和葡萄糖；最慢的為乳糖。對照組中菌絲也能生長，但菌絲長勢較弱。以乳糖為碳源時，菌絲生長速度與無碳源對照組相比差異不顯著，但菌絲比對照組更潔白、致密，說明碳源是菌絲生長的重要營養(yǎng)成分。綜合菌絲的生長速度和長勢，確定靈芝菌株ZJ-1的菌絲生長最適碳源為可溶性淀粉。

2.4.4 氮源對菌絲生長的影響

不同氮源培養(yǎng)基中靈芝菌株ZJ-1的菌絲生長情況見表4。

表4 氮源對靈芝菌株ZJ-1菌絲生長的影響Tab.4 Effect of nitrogen source on mycelial growth of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

由表4可知，靈芝菌株ZJ-1在以酵母粉、麩皮為氮源的培養(yǎng)基上生長速度最快，但以麩皮為氮源時，菌絲長勢弱；其次為牛肉膏和蛋白胨；以氯化銨和尿素為氮源時，菌絲幾乎不生長或略有生長；無氮源對照組（CK）菌絲不生長。綜合菌絲的生長速度和長勢，確定靈芝菌株ZJ-1的最適氮源為酵母粉。

2.5 出菇試驗結(jié)果

對靈芝菌株ZJ-1進行出菇試驗，子實體發(fā)育過程中的形態(tài)變化及特點詳見圖4。

如圖4所示，靈芝菌株ZJ-1在栽培培養(yǎng)料中生長較快，28℃時菌絲長滿菌袋約需20 d。菌絲滿袋后，在菌袋上部開口，移入具有散射光的菇房中。袋口的菌絲開始扭結(jié)，大約7 d形成原基。條件適宜時，原基進一步分化形成子實體，待靈芝子實體成熟時，便從子實體腹面的菌管（圖4D箭頭指示位置）處噴射孢子。

圖4 靈芝菌株ZJ-1的子實體形態(tài)變化及特點Fig.4 Morphological changes and characteristics of fruit bodies of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

2.6 掃描電鏡顯微觀察

利用掃描電鏡觀察成熟靈芝子實體的菌管結(jié)構(gòu)及孢子，詳見圖5。

圖5 靈芝菌株ZJ-1的顯微觀察Fig.5 Microscopic observation of Ganoderma lucidum strain ZJ-1

由圖5A可看出，靈芝菌管內(nèi)具有規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其上布滿孢子。由圖5B可看出，靈芝孢子個體非常小，約為7.0 μm×4.2 μm；在電子顯微鏡下將其放大5 000倍時，可見其個體呈卵形，外壁平滑，表面布滿小孔，頂端平截。

3 討論

生產(chǎn)實踐經(jīng)驗證明，大多引自國外的靈芝主栽品種易出現(xiàn)菌種活性退化、子實體品質(zhì)難以控制等問題[5]。在生態(tài)環(huán)境保護的前提下，鑒定和馴化了南京市紫金山野生靈芝菌株，可為開發(fā)當(dāng)?shù)仂`芝種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

野生大型真菌的鑒定方法主要有經(jīng)典分類鑒定方法和分子水平鑒定方法。經(jīng)典分類鑒定方法主要為觀察菌絲和子實體的形態(tài)，是最基本且不可替代的方法，但由于野生子實體分布廣泛，容易受到外界環(huán)境的影響而出現(xiàn)形態(tài)不穩(wěn)定的情況，因此還需借助分子水平鑒定方法進行確認[9]。本次試驗中除了觀察菌絲和子實體的形態(tài)，還結(jié)合ITS序列分析法鑒定菌株ZJ-1的分類地位，通過BLAST比對及系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株ZJ-1鑒定為靈芝Ganoderma lucidum。

王慶武等[10]發(fā)現(xiàn)泰山靈芝4914的適宜生長溫度為25℃～30℃，適宜pH為6.0～7.0，最適碳源為蔗糖，最適氮源為酵母膏。馬博等[7]發(fā)現(xiàn)有柄靈芝（Ganoderma gibbosum） BSU01的最適生長溫度為30℃，最適pH為5.5，最適碳源為果糖或葡萄糖，最適氮源為酵母提取物。努爾阿麗耶·阿卜力米提等[11]報道的新疆靈芝菌株XJ-001最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母粉。蔣帥等[12]報道的韋伯靈芝（Ganoderma weberianum） 適宜生長溫度為28℃～32℃，適宜pH為6.0，最適碳源為糊精，最適氮源為酵母粉。而此次試驗結(jié)果表明，靈芝菌株ZJ-1的最適溫度為28℃～32℃，與韋伯靈芝一致；適宜pH為4.0～5.0，與上述4種菌株相比偏酸性；最適碳源為可溶性淀粉，不同于上述菌株；最適氮源為酵母粉，與泰山靈芝4914、有柄靈芝BSU01和新疆靈芝XJ-001均一致。靈芝菌株ZJ-1的生物學(xué)特性與其他報道的研究結(jié)果既有一致性，又存在差異，可能是供試菌株來源不同及基礎(chǔ)培養(yǎng)基的成分不同所致。與野生子實體相比，馴化栽培后的子實體菌蓋厚實，并且能產(chǎn)生大量孢子。經(jīng)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌管表面布滿孢子；孢子個體呈卵形，外壁平滑，表面布滿小孔，頂端平截。靈芝孢子因具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用，近年來其相關(guān)產(chǎn)品亦備受消費者青睞，可加以開發(fā)[13]。

上述研究結(jié)果可為紫金山野生靈芝資源開發(fā)提供參考，為開展靈芝子實體發(fā)育、孢子形成的機制研究奠定基礎(chǔ)。