V因子Leiden突變及蛋白S、蛋白C與腦靜脈竇血栓抗凝有效性相關(guān)性分析

盧飛虎，于 雪

(1.蚌埠市第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科腫瘤)

腦靜脈竇血栓(cerebral venous sinus thrombosis，CVST)發(fā)病率相對較低，占腦血管病的0.5 %～1 %[1]，以青年人好發(fā)，尤其是育齡期女性[2]。CVST原發(fā)因素多由遺傳引起，包括V因子Leiden突變、抗凝蛋白缺乏及蛋白S、蛋白C低下等[3]，目前有關(guān)V因子Leiden突變引發(fā)血液高凝狀態(tài)的機制尚不明確。有研究顯示V因子Leiden突變可能導(dǎo)致蛋白C無法對其水解，使其凝血活性無法被滅活，導(dǎo)致血液處于高凝狀態(tài)[4-5]；蛋白C、蛋白S是凝血級聯(lián)反應(yīng)過程中重要的抑制物，在血液抗凝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，其表達低下或者缺陷導(dǎo)致血栓形成風(fēng)險增高。目前對抗凝藥物效果評估和檢測相對客觀準(zhǔn)確的方法主要有凝血功能指標(biāo)、血栓彈力圖(thromboelastogram，TEG)[6-7]。目前臨床對于CVST的治療缺乏對相關(guān)指標(biāo)的監(jiān)測[8]，對于靜脈血栓的抗凝治療很難能做好綜合評價抗凝藥物療效，缺乏對相關(guān)凝血指標(biāo)的監(jiān)測，很難通過客觀的臨床實驗室檢查指標(biāo)來評估和預(yù)判血凝的變化趨勢，不能給予CVST患者提供個體化的抗凝治療方案。本研究通過對V因子Leiden突變及蛋白S、蛋白C低下與腦靜脈竇血栓抗凝有效性的相關(guān)分析，臨床上根據(jù)CVST患者發(fā)病因素對抗凝治療的有效性做出評估和預(yù)判，意在為臨床CVST患者提供合適有效的抗凝治療方案。

1 對象與方法

1.1對象 選取2017年5月至2022年2月蚌埠市第三人民醫(yī)院收治的腦靜脈竇血栓的103例患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：通過醫(yī)學(xué)影像學(xué)檢查如(頭顱CT或CTV及頭MRI或MRV)臨床確診為腦靜脈竇血栓，且給予規(guī)范抗凝治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)病時間>1周；嚴(yán)重的肝腎功能異常；孕婦及哺乳期婦女；有血液系統(tǒng)疾病伴有血小板降低；近3個月內(nèi)接受外科手術(shù)或是心肺復(fù)蘇；有活動性出血、惡性腫瘤等其他嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病。根據(jù)DNA檢測及酶聯(lián)免疫吸附沉淀檢測判定患者是否存在V因子Leiden突變及蛋白S、蛋白C水平低下，分別以單純V因子突變?yōu)橛^察A組33例，單純蛋白S、蛋白C低下為觀察B組34例，無V因子Leiden突變及蛋白S、蛋白C低下為對照組36例，三組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組患者一般資料對比情況

1.2方法 研究對象均需要基因組DNA提取試劑盒(杭州凱萊酶生物科技有限公司)提取患者DNA，使用變性瓊脂糖凝膠電泳方法對提取的DNA定量和稀釋，通過PCR擴增儀對V因子相關(guān)的基因片段擴增，然后進行熒光檢測，對擴增DNA產(chǎn)物完成DNA序列測定判斷有無Leiden突變；用酶聯(lián)免疫吸附沉淀對蛋白S、蛋白C進行測定判斷(蛋白S<19.0 μg/mL、蛋白C<3.0 μg/mL為低下)；對于確診CVST患者在發(fā)病1周內(nèi)予以皮下注射低分子肝素，在皮下注射低分子肝素抗凝治療1周時選用口服利伐沙班藥物(南京正大天晴制藥公司，規(guī)格10 mg/片)來替代皮下注射低分肝素，一次給藥劑量10 mg/片，1次/d，藥物在每日早餐后口服；在入院時及抗凝治療第3、7、15 d分別進行血栓彈力圖參數(shù)凝血反應(yīng)時間(reaction time, R)、血凝塊形成速率(clot kinetics，K)、最大血凝塊強度(maximal amplitude，MA)監(jiān)測及凝血功能指標(biāo)國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio，INR)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)監(jiān)測。

1.3觀察指標(biāo) 記錄各組患者在入院時及在抗凝治療第3、7、15 d時彈力血栓圖R值、K值、MA值及相應(yīng)的凝血功能指標(biāo)INR、APTT。

2 結(jié)果

2.1三組入院時R值、K值、MA值及INR、APTT水平 三組患者在入院時抗凝治療前行彈力血栓圖參數(shù)R值、K值、MA值及INR、APTT水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表 2。

表2 三組入院時R值、K值、MA值及INR、APTT結(jié)果

2.2三組抗凝治療3 d時R值、K值、MA值及INR、APTT水平 三組患者在抗凝治療3 d時彈力血栓圖R值、K值、MA值及INR、APTT水平比較，觀察A組在R值、K值、INR和對照組及觀察B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；觀察B組僅在R值、K值與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表 3。

表3 三組抗凝治療3 d時R值、K值、MA值及INR、APTT結(jié)果

2.3三組抗凝治療7 d時R值、K值、MA值及INR、APTT水平 三組患者在抗凝治療7 d時血栓彈力圖R值、K值、MA值及INR、APTT水平比較，觀察A組在R值、K值、MA、INR及APTT水平上和對照組及觀察B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；觀察B組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表 4。

表4 三組在抗凝治療7 d時R值、K值、MA值及INR、APTT結(jié)果

2.4三組抗凝治療15 d時R值、K值、MA值及INR、APTT水平 三組患者在抗凝治療15 d彈力血栓圖R值、K值、MA值及INR、APTT水平比較，觀察A組在R值、K值、INR和對照組及觀察B組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，觀察B組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 三組抗凝治療15 d時R值、K值、MA值及INR、APTT結(jié)果

3 討論

機體在正常條件下，促凝系統(tǒng)、纖維溶解系統(tǒng)及血管內(nèi)皮細胞的分泌等共同參與維持體積內(nèi)凝血和抗凝達到動態(tài)平衡，此平衡被機體內(nèi)在或外在因素打破時，機體會啟動自身凝血或抗凝機制并給予相應(yīng)的調(diào)節(jié)；當(dāng)發(fā)生血栓時，在給予外界干預(yù)的同時機體也會通過自身調(diào)節(jié)機制來實現(xiàn)血栓的溶解[9]。國內(nèi)外指南均指出在CVST患者發(fā)病1～2周給予皮下注射低分子肝素抗凝治療[10-11]，在CVST患者發(fā)病后1～2周后由口服抗凝藥逐漸替代低分子肝素，將CVST患者的抗凝治療仍作為臨床基礎(chǔ)治療[12]。利伐沙班藥物主要與相關(guān)的底物來競爭Ⅹa因子自身的相關(guān)活性中心來阻礙底物與活性中心的結(jié)合，并阻礙凝血酶的進一步生成，為國內(nèi)目前最常應(yīng)用的新型抗凝藥物。Patel等[13]研究并討論了新型抗凝藥物在治療靜脈血栓形成中的臨床應(yīng)用，其相對傳統(tǒng)華法林抗凝更有優(yōu)勢；在常規(guī)抗凝治療中不需要頻繁調(diào)整口服藥物劑量，而且其出血風(fēng)險相對華法林更低[14]。

V因子Leiden突變?yōu)榈? 691位，V因子的10位外顯子由原來的鳥嘌呤錯譯為腺嘌呤，使谷氨酸取代原位的精氨酸。V因子突變在正常人的發(fā)病率為2 %～10 %，在有血栓的病人發(fā)病率高達20 %～50 %，目前對于V因子Leiden突變引發(fā)血液高凝狀態(tài)的的機制尚不明確。有研究顯示V因子Leiden突變后，導(dǎo)致該部位的促凝活性不能被活化蛋白C抵抗性(APC)水解失活，使血液處于高凝狀態(tài)[3]，隨著不斷對V因子Leiden突變與血栓發(fā)生機制的深入研究，研究者發(fā)現(xiàn)了APC與V因子Leiden突變存在著關(guān)聯(lián)，APC是目前被認(rèn)為最高的一種血栓風(fēng)險因素，但對APC在血栓形成的病理生理機制尚未清楚，但可以肯定APC在靜脈血栓的發(fā)生和形成中起重要作用。蛋白S、蛋白C在人體抗凝平衡調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，其表達低下或者缺陷可能與患者機體內(nèi)抗凝蛋白先天缺陷[15-16]相關(guān)，兩種蛋白均為VitK依賴止血蛋白，均由肝臟合成[17]。有研究表明蛋白S發(fā)揮作用時是將蛋白C進一步活化[18]，蛋白C是凝血級聯(lián)反應(yīng)過程中重要抑制物，同時蛋白C在血管內(nèi)皮細胞穩(wěn)定、促進纖維溶解及抗凝平衡上發(fā)揮重要作用[19-20]。利伐沙班主要對Xa因子發(fā)生作用，影響凝血酶原復(fù)合物(Xa+V+Ca2++PF3)的形成，當(dāng)V因子Leiden突變后可能在參與底物競爭Ⅹa因子相關(guān)活性中心中更有優(yōu)勢，導(dǎo)致Xa+V+Ca2++PF3合成增加，從而使利伐沙班藥物抗凝的效果較差；有報告稱V因子Leiden突變可引起蛋白C抗凝路徑受抑制，增高靜脈血栓發(fā)生風(fēng)險，但目前缺乏中心實驗對相關(guān)機制研究[21]。對于CVST的發(fā)病因素有基因缺陷者的研究僅分析了V因子Leiden突變及蛋白C、蛋白S，仍不能排除其他基因突變導(dǎo)致患者出現(xiàn)抗凝異常的發(fā)生，隨著將來對APC的不斷認(rèn)識，還可能會發(fā)現(xiàn)更多的基因片段的參與或者APC與這些凝血因子之間復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)。本研究顯示觀察A組在抗凝治療第3、7、15 d時，血栓彈力圖R值、K值及凝血功能指標(biāo)INR、APTT水平低于對照組，血栓彈力圖MA值水平高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，對于存在V因子Leiden突變的患者行抗凝治療效果較差；觀察B組僅在抗凝治療第3 d R值、K值水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，對于CVST早期抗凝治療有效對CVST進一步增加有重要意義，可以減少CVST相關(guān)并發(fā)癥及不良預(yù)后事件的發(fā)生；顯示出觀察B組在抗凝治療3 d的效果稍要差于對照組，優(yōu)于觀察組A；但在抗凝治療7、15 d時，在血栓彈力圖參數(shù)及凝血功能INR、APTT水平上，觀察組B與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，對于蛋白S、蛋白C低下的患者行抗凝治療效果較好，對于無V因子Leiden突變及蛋白S、蛋白C低下的患者抗凝治療效果最好。對于檢查明確存在基因缺陷的患者發(fā)生CVST時，可能需要更長時間的抗凝治療來彌補抗凝治療效果不理想等問題的不足，但對該類患者屬于CVST的易發(fā)人群，需不需要通過更長時間的抗凝來預(yù)防血栓的發(fā)生，這可能與無基因缺陷的患者所采取的抗凝策略有所不同，一方面為抗凝治療時間的選擇，另一方面為抗凝藥物的選擇，這些問題均將可以為CVST患者提供個體化的抗凝方案尋找出路。

綜上所述，V因子Leiden突變及蛋白S、蛋白C低下與腦靜脈竇血栓抗凝效果存在相關(guān)性，希望通過此研究對CVST患者根據(jù)患者發(fā)病因素在抗凝的效果上做出評估和預(yù)判，但該研究為小樣本研究，缺乏多中心研究數(shù)據(jù)對結(jié)果進行證實，相信未來可以具體到更多在基因表達層面上為CVST患者提供合適抗凝治療方案，同時也希望更多的新型抗凝藥物能夠使更多CVST患者獲益。