不同地理種群棉蚜三種關(guān)鍵性酶活差異及其與抗性相關(guān)性

王小麗，韓 睿，張全成，趙鵬程，王俊剛

（1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003；2.新疆天禾嘉信農(nóng)業(yè)科技有限公司，烏魯木齊 830000）

0 引言

【研究意義】新疆是我國棉花重要產(chǎn)區(qū)，而棉蚜Aphis gossypii（Glover）是棉花的重要害蟲之一。棉蚜為蚜科蚜屬，蚜蟲防治藥劑的重復(fù)和不規(guī)范使用，會(huì)使蚜蟲產(chǎn)生抗藥性[1-3]。而羧酸酯酶（CarE）、乙酰膽堿酯酶（AchE）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等酶活性增加是昆蟲抗藥性產(chǎn)生的一類重要機(jī)制，與棉蚜抗藥性之間存在一定關(guān)系[4-10]，測量不同地理種群棉蚜的3種酶活及分析酶活力對吡蟲啉抗性產(chǎn)生的作用，對棉蚜的防治和相關(guān)研究有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與昆蟲的抗藥性存在一定關(guān)系，在大墊尖翅蝗對丁烯氟蟲腈的抗性研究中，發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是抗性產(chǎn)生的因素之一[4]，李永強(qiáng)等[5]研究表明，棉鈴蟲體內(nèi)的8個(gè)羧酸酯酶對2種擬除蟲菊酯類和2種有機(jī)磷類殺蟲劑有一定的解毒代謝活性，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶還參與了煙粉虱對吡蟲啉的抗性形成[6]，而乙酰膽堿酯酶的敏感性下降與二化螟對三唑磷抗性產(chǎn)生有關(guān)[7]，胡珍娣[8]在繼代汰選過程中發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶對氯蟲苯甲酰胺有一定的解毒活性。3種酶與蚜蟲的抗藥性存在關(guān)系，在室內(nèi)的麥二叉蚜抗性選育過程中，乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶與麥二叉蚜對吡蟲啉的敏感性存在一定關(guān)系[9]，郭天鳳等[10]研究表明，抗吡蟲啉和抗啶蟲脒棉蚜兩種抗性品系中，羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性均高于敏感品系，而羧酸酯酶在棉蚜對吡蟲啉和啶蟲脒抗性中起到了重要作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】新疆棉花種植面積大，區(qū)域廣[11]，不同地區(qū)用藥量和打藥方式存在差異，導(dǎo)致不同地理種群棉蚜抗藥性不同[12]。需研究不同地理種群棉蚜和敏感種群棉蚜體內(nèi)3種酶活性，了解棉蚜的抗藥機(jī)制，探索不同地理種群棉蚜3種酶活性與吡蟲啉抗性的關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究新疆5個(gè)地區(qū)不同地理種群棉蚜體內(nèi)3種酶活性的，了解新疆不同地區(qū)棉蚜與敏感種群棉蚜的2種關(guān)鍵解毒酶和1種神經(jīng)傳導(dǎo)關(guān)鍵性酶比活力，以及對吡蟲啉的抗藥性，為相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試棉蚜：2017年7～8月，采自庫爾勒地區(qū)、五家渠101團(tuán)老九連、奎屯130團(tuán)團(tuán)部周邊、石河子147團(tuán)和哈密農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站試驗(yàn)田。相對敏感種群棉蚜采集于石河子大學(xué)試驗(yàn)場，在實(shí)驗(yàn)室繼代培飼養(yǎng)20代以上（SS）。

試劑及儀器：1-氯-2，4-二硝基苯、還原型谷胱甘肽、固藍(lán)B 鹽、二硫代雙硝基苯甲酸、十二烷基硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、α-醋酸萘酯、考馬斯亮藍(lán)、毒扁豆堿、牛血清蛋白、磷酸緩沖液、吐溫-80、丙酮，均產(chǎn)自上海源葉生物科技有限公司。UV-1800日本島津紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋，北京長安科學(xué)儀器廠；玻璃勻漿器，上海壘固儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)，LQP-B-4型制冰機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 毒力測定

生物測定采用葉片浸漬法，加以改動(dòng)。將殺蟲劑用少量的丙酮使其溶解，用0.05%吐溫-80溶液將溶解的殺蟲劑稀釋成5個(gè)濃度。選擇新鮮棉葉，在配好的溶液中浸泡10 s，取出后自然晾干，放入含有瓊脂的培養(yǎng)皿內(nèi)。每個(gè)處理選擇個(gè)體大小均勻一致的20 頭無翅蚜進(jìn)行試驗(yàn)，以0.05%的吐溫-80溶液為對照，重復(fù)3次。試驗(yàn)條件為溫度（26±1）℃、光周期16 L：8 D、相對濕度55%～70%。24 h 后檢查棉蚜死亡情況，以毛筆輕輕觸動(dòng)足和觸角無反應(yīng)為死亡判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 生化測定

1.2.2.1 羧酸酯酶活力

（1）酶源制備

玻璃勻漿器中加入5 mL（0.04 mol/L pH7.0）的磷酸緩沖液，將150 頭無翅成蚜在冰浴條件下完全勻漿，置于4℃，8 000 r/min下離心20 min，取稀釋50倍后的上清液作為酶源，重復(fù)3次。

（2）活力測定

參照Van Aspern[13]的方法，加以改動(dòng)。試管中加入5 mL（3×10-4mol/L）α-醋酸萘酯，1 mL 酶源，30℃水浴下30 min 后加入1 mL 顯色劑，底物常溫下靜置20 min，在600 nm下測量OD值，每組重復(fù)3 次。將酶含量（mL）作為自變量，OD 值為因變量，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線算出1 mL 酶液所生成的α-萘酚的量，最后結(jié)合蛋白質(zhì)含量（mg/g）計(jì)算出羧酸酯酶的比活力。

1.2.2.2 乙酰膽堿酯酶活力

（1）酶源制備

玻璃勻漿器中加入3 mL（0.1 mol/L pH7.4）的磷酸緩沖液，將200 頭無翅成蚜在冰浴條件下完全勻漿，置于4℃，8 000 r/min下離心20 min，取上清液作為酶源，重復(fù)3次。

（2）活力測定

參照高希武等[14]的方法，加以改動(dòng)。在試管中加入2.2 mL（0.1 mol/L pH7.4）的磷酸緩沖液、0.4mL酶源、0.1mLAsch-DTNB（1：2）混合液，將試管中試劑混勻，在27℃水浴振蕩條件下反應(yīng)15 min，再加入0.5 mL（1×10-3mol/L）毒扁堿，將試劑在412 nm 下測定OD 值，每組重復(fù)3 次。以酶含量（mL）為自變量，OD值為因變量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算乙酰膽堿酯酶的比活力。

1.2.2.3 谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶活力

（1）酶源配制

玻璃勻漿器中加入2 mL（66 mol/L pH7.0）的磷酸緩沖液，將150 頭無翅成蚜在冰浴條件下完全勻漿，置于4℃，9 000 r/min下離心15 min，取上清液作為酶源，重復(fù)3次。

（2）活力

參照Habig等[15]方法，加以改動(dòng)。試管中加入2.4 mL（66 mol/L pH7.0）的磷酸緩沖液、0.3 mL（50 mol/L）谷胱甘肽、0.1 mL（0.03 mol/L）CDNB，將試管中試劑混勻，在27℃水浴振蕩條件下反應(yīng)15 min，再加入0.2 mL 酶液，在室溫下340 nm 處比色，測定5 min內(nèi)OD變化值，每組重復(fù)3次。

1.2.3 酶原蛋白含量

（1）酶源制備

玻璃勻漿器中加入5 mL（0.04 mol/LpH7.0）的磷酸緩沖液，將120 頭無翅成蚜在冰浴條件下完全勻漿，置于4℃，8 000 r/min下離心15 min，取上清液稀釋50倍后作為酶源，重復(fù)3次。

（2）酶源蛋白質(zhì)含量測定

參考Bradford[16]的方法，試管中加入0.1mL酶液，對照試管中加入0.1 mL（0.04 mol/L pH7.0）的磷酸緩沖液，再分別加入5 mL 考馬斯G-250 試劑，在25℃水浴下放置2 min，在595 nm 處測OD值。每組重復(fù)3次，取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析，并用Excel繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地理種群棉蚜羧酸酯酶比活力

研究表明，棉蚜SS種群羧酸酯酶比活力為0.236（U/mgpro-min），除哈密地區(qū)棉蚜種群羧酸酯酶比活力為0.284（U/mgpro-min）外，其余地區(qū)棉蚜種群羧酸酯酶比活力均遠(yuǎn)高于SS種群，差異顯著（P＜0.05）。庫爾勒、五家渠、石河子、奎屯和哈密地區(qū)棉蚜種群對SS種群羧酸酯酶比活力比值為6.5、4.2、3.4、2.7和1.2倍，不同地理種群之間棉蚜羧酸酯酶比活力差異顯著（P＜0.05）。表1

表1 不同地理種群棉蚜的羧酸酯酶比活力Table 1 CarE activities in wingless adults of different geographic populations of Aphis gossypii

2.2 不同地理種群棉蚜乙酰膽堿酯酶的比活力

研究表明，棉蚜SS種群乙酰膽堿酯酶比活力為2.997（U/mgpro-min），各地區(qū)棉蚜種群乙酰膽堿酯酶比活力均遠(yuǎn)高于SS種群，且差異顯著（P＜0.05），其庫爾勒地區(qū)棉蚜種群和SS 棉蚜種群乙酰膽堿酯酶比活力存在極顯著差異（P＜0.01）。庫爾勒、五家渠、石河子、奎屯和哈密地區(qū)棉蚜種群對SS種群乙酰膽堿酯酶比活力比值為4.2、2.7、2.3、2.5和2.1倍，且不同地理種群之間棉蚜乙酰膽堿酯酶比活力也存在顯著差異（P＜0.05）。表2

表2 不同地理種群棉蚜的乙酰膽堿酯酶比活力Table 2 AchE activities in wingless adults of different geographic populations of Aphis gossypii

2.3 不同地理種群棉蚜谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力

研究表明，SS 棉蚜種群谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力為3.986（U/mgpro-min），各地區(qū)棉蚜種群谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力均遠(yuǎn)高于SS種群，且差異顯著（P＜0.05）。不同地理種群之間棉蚜谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力也存在顯著差異（P＜0.05）。庫爾勒、五家渠、石河子、奎屯和哈密地區(qū)棉蚜種群對SS棉蚜種群谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力比值為2.3、1.5、1.3、2.5和2.1倍。

表3 不同地理種群棉蚜的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶比活力Table 3 GST activities in wingless adults of different geographic populations of Aphis gossypii

2.4 不同地理種群棉蚜3種酶活性與吡蟲啉抗藥性的相關(guān)性

研究表明，通過對各個(gè)地區(qū)棉蚜種群吡蟲啉抗性及3種酶活性之間的聯(lián)系分析，棉蚜體內(nèi)的2種關(guān)鍵解毒酶和1種神經(jīng)傳導(dǎo)關(guān)鍵性酶和吡蟲啉抗性之間存在一定相關(guān)性。各棉蚜種群羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶活性隨著吡蟲啉抗性增減而增減，羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶極有可能參與了棉蚜對吡蟲啉的抗性形成過程。圖1

圖1 不同地理種群棉蚜對吡蟲啉抗性與3種酶活性的相關(guān)性Fig.1 Relationship between imidaclopridresistance to Aphis gossypii and three enzyme activities in different geographical populations

3 討論

研究表明，棉蚜對殺蟲劑產(chǎn)生中等高抗水平時(shí)，往往是靶標(biāo)基因變異導(dǎo)致靶標(biāo)敏感性下降；棉蚜對殺蟲劑產(chǎn)生低水平抗性時(shí)一般是棉蚜體內(nèi)解毒酶活性的上升導(dǎo)致的[17]。試驗(yàn)以趙鵬程[18]研究為基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)新疆不同地理種群棉蚜對吡蟲啉的抗性還處于抵抗水平，試驗(yàn)選用了吡蟲啉的抗性水平，分析吡蟲啉的抗性形成機(jī)制是否與解毒酶活性有關(guān)，羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶活性變化與吡蟲啉抗性變化呈正相關(guān)。

羧酸酯酶可以水解酯類化合物的酯鍵或與親酯類化合物結(jié)合[19]。而研究中羧酸酯酶對吡蟲啉殺蟲劑也起到了非常好的作用。各地區(qū)羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶均低于敏感品系，但羧酸酯酶活性的變化比乙酰膽堿酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶顯著，羧酸酯酶在棉蚜對新煙堿類殺蟲劑敏感性下降有關(guān)。羧酸酯酶同樣能介導(dǎo)昆蟲對新煙堿類殺蟲劑的抗性[20-23]。楊柳等[20]測定了湖南寧鄉(xiāng)地理種群煙蚜和敏感種群煙蚜的解毒酶活性，結(jié)果表明寧鄉(xiāng)煙蚜種群乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶分別是敏感種群1.68 倍、2.58 倍、2.39 倍，均顯著高于敏感種群，且羧酸酯酶在煙蚜對滅多威及辛硫磷敏感性降低起到重要作用。史曉斌等[21]測定吡蟲啉抗性品系和敏感品系羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶，發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶活性變化較快，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶增加較慢，羧酸酯酶在棉蚜對吡蟲啉產(chǎn)生抗性中起到重要作用。王曉冰[22]對綠盲蝽進(jìn)行了抗呋蟲胺品系的汰選，在汰選過程中發(fā)現(xiàn)羧酸酯酶活性有明顯的提升，認(rèn)為羧酸酯酶參與了綠盲蝽代謝呋蟲胺過程。楊煥清等[23]研究發(fā)現(xiàn)棉蚜對吡蟲啉抗性的形成與羧酸酯酶活力增加有關(guān)。

不同地區(qū)棉蚜種群之間抗性水平不一致，其解毒酶活性也存在差異[24-30]。研究表明，庫爾勒棉蚜種群羧酸酯酶比活力和乙酰膽堿酯酶比活力是敏感棉蚜的6.5 倍和4.2 倍，均高于其他地區(qū)棉蚜種群；其中哈密地區(qū)棉蚜種群解毒代謝酶活力低于其他地區(qū)，可能與采集測定的時(shí)間，棉蚜發(fā)生早晚，蚜蟲還沒有大面積接觸殺蟲劑等有關(guān)。

4 結(jié)論

各地理種群棉蚜3種酶活性均顯著高于敏感種群（P＜0.05），且彼此之間存在差異性，羧酸酯酶在棉蚜感受到吡蟲啉殺蟲劑脅迫時(shí)極有可能起到重要作用。棉蚜體內(nèi)羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿酯酶抗性之間存在一定相關(guān)性，棉蚜抗性強(qiáng)的地區(qū)其解毒代謝作用強(qiáng)烈，3種酶也隨之表現(xiàn)出較高的活性，其中各地區(qū)棉蚜種群羧酸酯酶活性變化最大。