馬鈴薯瘡痂病病原菌的分離鑒定及其生長特性分析

宋素琴，高海峰，呂 卓，3，唐琦勇，顧美英，張志東，楚 敏，朱 靜，王 瑋

（1.新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室，烏魯木齊 830091；2.新疆農業(yè)科學院植物保護研究所/農業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；3.新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院，烏魯木齊 830052）

0 引言

【研究意義】新疆喀什地區(qū)澤普縣屬大陸性暖溫帶干旱氣候，年平均氣溫11.7 ℃，年均降雨量50 mm，日照充足，土壤肥沃，無霜期長適合種植馬鈴薯。馬鈴薯瘡痂?。╬otato common scab，簡稱PCS）是由放線菌目鏈霉菌屬的瘡痂病鏈霉菌（Streptomyces scabies）引起的土傳細菌性病害[1]，當前馬鈴薯土傳病害馬鈴薯瘡痂病影響馬鈴薯的產量及品質。【前人研究進展】已報道瘡痂病病原菌有S.cesscabies、S.acidiscabies、S.aureofaciens等50 多種[2]。杜鵑[2]研究報道了新疆伊犁地區(qū)馬鈴薯瘡痂病，發(fā)現病原菌為S.acidiscabies和S.scabies，且S.acidiscabies的致病力明顯強于S.scabies。2002年華北地區(qū)微型薯的瘡痂病發(fā)病率達30%～60%；2010年浙江省義烏市馬鈴薯商品薯田瘡痂病發(fā)病率超過50%；2013年內蒙古自治區(qū)11個縣（旗、市）的商品薯生產中均有馬鈴薯瘡痂病發(fā)生，病薯率達38%，18個種薯生產單位中15個有瘡痂病發(fā)生，最嚴重病薯率達100%；2012年新疆阿勒泰市區(qū)馬鈴薯瘡痂病發(fā)病率超過30%，而栽培脫毒微型薯的地區(qū)瘡痂病發(fā)病較為嚴重，發(fā)病率可達30% ～50%，嚴重達到80%以上[3-4]?！颈狙芯壳腥朦c】馬鈴薯瘡痂病嚴重影響新疆馬鈴薯的產量和品質，對馬鈴薯產業(yè)尤其是脫毒種薯生產造成巨大損失。近年來，新疆澤普縣瘡痂病發(fā)病較嚴重但未見相關報道。需分離鑒定馬鈴薯瘡痂病病原菌，并分析共生長特性。【擬解決的關鍵問題】采集新疆喀什澤普縣阿依庫勒鄉(xiāng)4村的感病馬鈴薯，分離鑒定確定病原菌的種類并研究病原菌的形態(tài)及生長特性，為該病害的綜合防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病薯

病薯于2019年6月從新疆喀什地區(qū)澤普縣阿依庫勒鄉(xiāng)4村采集，品種為荷蘭十五，重茬連續(xù)4年種植。致病力測定所用材料均采購于烏魯木齊某超市，馬鈴薯所用品種為費烏瑞它。

1.1.2 土壤樣品

土壤樣品采集于新疆喀什地區(qū)澤普縣阿依庫勒鄉(xiāng)4 村馬鈴薯瘡痂病薯薯田，采集時除去發(fā)病地塊表層5 cm土壤，取5 ～15 cm耕作層土壤。

1.1.3 試劑與儀器

培養(yǎng)基：PDA，YME（麥芽浸粉10 g/L、酵母浸粉4 g/L、葡萄糖4 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.2），胰胨酵母浸出物培養(yǎng)基（胰蛋白胨1.0 g/L、酵母浸粉1.0 g/L、NaCl8.5 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.2）

儀器：培養(yǎng)皿（90 mm）、試管（15 mm×150 mm）、小刀、酒精燈、滅菌竹簽、涂布器等，均購自新疆鼎國昌盛有限公司。

設備：HVE-50 自動高壓滅菌鍋，日本HIRAYAMA公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；SPX-250BF 生化培養(yǎng)箱，上海?，攲嶒炘O備有限公司；SC-316 4℃立式保藏柜，海爾HAIER 公司；NEP025-1 回收試劑盒，鼎國昌盛有限公司；DL9700 PCR 儀，東林昌盛有限公司；CH20BIMF200 光學顯微鏡，日本Olympus有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與純化

參考方中達[5]組織分離法。

1.2.2 致病力測定

1.2.2.1 薯肉

根據柯赫氏法則采用傷口接種測定致病性，包括針刺接種法[2]和打孔接種法[6]，接種后的馬鈴薯置于室溫，30 d后觀察發(fā)病情況。

1.2.2.2 薯皮

薯塊表面用75%酒精消毒后，涂抹菌懸液，設置3個重復，30 d后觀察對馬鈴薯薯皮的影響。

1.2.2.3 離體葉片

取健康馬鈴薯葉片，經75%酒精消毒后，置于放有無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，再在葉片表面滴加200μL菌株菌懸液并涂抹均勻，無菌濾紙保濕，設置3個重復，置于室溫下15 d后觀察。

1.2.2.4 盆栽實驗

采用灌根的方式，選取健康的馬鈴薯塊莖催芽，用無菌水沖洗干凈，在滅菌的花盆土壤中植入有芽馬鈴薯2 塊，芽尖向上，后將5 mL 菌液加入到芽尖土壤處，以等量無菌水做對照，播種前澆水1 000 mL，每組6 次重復。馬鈴薯出苗后每盆定植1 株，植株在室內光照室12 h 時日光燈下生長，每周澆1 次水并觀察，生長120 d 后采收馬鈴薯塊莖。

1.2.3 生物學特性測定

參考杜鵑等[2]方法，采用結晶紫染色法，顯微鏡下觀察菌株孢子鏈和孢子的形態(tài)特征。生理生化測定指標[6]：菌株的碳源利用、氮源利用、敏感性和對淀粉的利用等，以及溫度、pH 等對菌株生長特性的影響。

1.2.4 分子鑒定

16SrDNA 序 列 引 物 為PA（TTTGATCCTGGCTCAG）和 PH（AAGGAGGTGATCCAGCCGCA），按常規(guī)設置PCR 反應體系，PCR 產物經純化、回收后，送鼎國昌盛有限公司測序。將獲得的序列在NCBI 上進行Blast 比對，選取同源性較高和形態(tài)相近菌株序列進行發(fā)育樹構建。表1

表1 常規(guī)PCR反應體系的擴增Table 1 16s rDNA sequence Amplification of conventional PCR reaction system

2 結果與分析

2.1 菌株的形態(tài)特征

研究表明，在病薯上分離出編號為ZPCJ-1的菌株，為放線菌，在PDA 培養(yǎng)基表面凸起，產白色孢子，菌體絲狀分枝極細，尖端常呈螺旋狀并凸起，孢子圓筒形連接成鏈或附著在菌絲周圍。圖1

圖1 菌株ZPCJ-1的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of ZPCJ-1

2.2 菌株ZPCJ-1的致病力

研究表明，接菌處理與對照基本一致，30 d后在薯皮涂抹菌液處網紋狀病斑加深，嚴重時有內凹的瘡口，去皮后發(fā)現薯肉并無變化。

15 d后菌株在離體葉片表面滋生大量白色孢子，但葉片未出現腐爛。

接菌的盆栽相比于對照，收獲馬鈴薯塊莖表皮出現許多網紋狀病斑。圖2

圖2 菌株ZPCJ-1的致病性Fig.2 Determination of pathogenicity of pathogenic bacteria ZPCJ-1

2.3 菌株ZPCJ-1的生物學特性

研究表明，菌株ZPCJ-1 孢子光滑呈白色、自由彎曲狀，在胰胨酵母浸出物培養(yǎng)基能夠產生黑色素，在PDA培養(yǎng)基產生可溶性色素，可利用8種單一碳源：葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖、鼠李糖、肌醇，可以利用甲硫氨酸和組氨酸為單一氮源，對鏈霉素、青霉素、苯酚、結晶紫敏感，可利用淀粉，能在pH4.0 的培養(yǎng)基中生長。表2

表2 菌株ZPCJ-1的生物學特性Table 2 Biological characteristics of ZPCJ-1

2.3.1 溫度對菌株ZPCJ-1菌落生長影響

研究表明，溫度對菌株ZPCJ-1菌落生長影響顯著（P＜0.05）。在25 ～30℃，菌落直徑呈上升趨勢，30 ～40℃菌落直徑呈下降趨勢，其中最適生長溫度為30℃，12 d 菌落直徑達到16.17 mm。菌株ZPCJ-1在25 ～40℃均可以生長，最適生長溫度為30℃。圖3

圖3 不同溫度下菌株ZPCJ-1生長變化Fig.3 Effect of temperature on ZPCJ-1 growth of strain

2.3.2 光照對菌株ZPCJ-1菌落生長的影響

研究表明，黑暗有利于菌株ZPCJ-1 的生長，12 d 菌落直徑達到14.00 mm。全光照不利于菌株ZPCJ-1 的生長，12 d 菌株的菌落直徑為6.00 mm。黑暗適宜該菌株生長。圖4

圖4 不同光照下菌株ZPCJ-1生長變化Fig.4 Effect of light condition on ZPCJ-1growth of strain

2.3.3 pH對菌株ZPCJ-1菌落生長影響

研究表明，菌株ZPCJ-1在YME、pH為4 ～10的范圍內均能生長。pH 為3 時菌落未生長；但pH 為4 時病菌生長；較佳pH 值為7，菌落直徑達16.17 mm；pH為11以及12時，菌株不生長。圖5

圖5 不同pH下菌株ZPCJ-1生長變化Fig.5 Effect of pH on ZPCJ-1 growth of strain

2.3.4 不同碳源與氮源對菌株ZPCJ-1 菌落生長的影響

研究表明，在YME 培養(yǎng)基上，以葡萄糖作為碳源，有利于菌株的生長，12 d 其菌落直徑達到15.50 mm，其依次為蔗糖、果糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖、CK、鼠李糖、肌醇，其菌落直徑依次為12.17、10.50、7.70、6.50、5.33、5.17、3.83 和3.50 mm。

以甲硫氨酸為氮源適宜菌株生長，菌落直徑達到11.33 mm。圖6

圖6 不同碳氮源下菌株ZPCJ-1生長變化Fig.6 Effect of carbon and nitrogen sources on ZPCJ-1 growth of strain

2.4 菌株ZPCJ-1的分子鑒定

研究表明，擴增出約1 500 bp的16S rDNA片段。菌株ZPCJ-1與Streptomyces acidiscabiesATCC 49003（D63865）的同源性為100%，結合致病性測定結果與生物學特性確定菌株ZPCJ-1 為瘡痂鏈霉菌（Streptomyces acidiscabies）。圖7

圖7 用于ZPCJ-1鑒定的PCR擴增電泳圖譜及系統(tǒng)發(fā)育樹構建Fig.7 PCR amplification electrophoresis map and construction of phylogenetic tree for identification of ZPCJ-1

3 討論

瘡痂鏈霉菌（S.acidiscabies），田間癥狀為塊莖表面出現近圓形至不定形木栓化瘡痂狀淡褐色病斑或斑塊，手摸質感粗糙，呈凸起裂口狀病斑[8，9]。這類病原菌在中國、日本、韓國均有報道[10]，我國山東[11]、黑龍江[12]、山西[13]、甘肅[14]等地均發(fā)現該病菌。已報道的瘡痂病病原菌還有S.scabies、S.acidiscabies、S.aureof aciens、S.europaeiscabiei等50種[2，24，25]，我國主要有S.scabies、S.turgidiscabies和S.acidiscabies3種[15]；杜鵑在我國新疆伊犁地區(qū)分離到S.acidiscabies和S.scabies，其中優(yōu)勢種為S.acidiscabies[2]。我國馬鈴薯種植區(qū)的瘡痂病病原菌同樣具有遺傳多樣性，不同產區(qū)病原菌種類、數量及致病程度存在明顯差異[5，16,17]。馬鈴薯瘡痂病菌還可以侵染蘿卜、甜菜等其它作物，菌株對青霉素、苯酚、鏈霉素等均敏感，與已報道的S.acidiscabies菌株的特性一致[12]。

研究結果表明，適合菌株ZPCJ-1的適宜溫度為25 ～34℃，最適生長溫度為30℃；黑暗更有利于菌株生長；當pH 為4 時，菌株可以生長，最適pH為7；適宜生長的碳源和氮源分別是葡萄糖和甲硫氨酸。不同于崔凌霄[22]、李馳[3]、陳志垚[18]等的研究結果，與菌株的種類、生長環(huán)境、地理區(qū)域等有關

我國瘡痂病病原菌種類及其組成有明顯的多樣性特征。明確特定地區(qū)病原菌的構成對了解及防治瘡痂病十分重要[23]。

土傳病害防治難度大，培育抗性品種是病害防治最經濟有效的方法[24]。輪作倒茬、合理施肥，尤其降低磷肥用量，可改善土壤微生物群落結構，減少瘡痂等土傳病害發(fā)生，利于馬鈴薯產業(yè)可持續(xù)發(fā)展[25，26]。

4 結論

在新疆澤普縣的感病馬鈴薯中分離鑒定馬鈴薯瘡痂病的病原菌為瘡痂鏈霉菌（Streptomyces acidiscabies），產白色光滑呈自由彎曲狀的孢子，能產生黑色素和可溶性色素，可利用葡萄糖等8種碳源和甲硫氨酸（Met）和組氨酸（His）2種氮源，接種健康馬鈴薯塊莖上能產生網紋狀甚至凹陷裂口狀病斑。最適生長溫度為30℃，pH 為7，最適碳氮源為葡萄糖和甲硫氨酸，全黑暗利于菌株的生長。