吖啶橙-金納米熒光法測(cè)金屬硫蛋白

陳思涵，周鵬，陳云生，王永生，王漢青

(1.南華大學(xué) 資源環(huán)境與安全工程學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001；3.建筑環(huán)境氣載污染物治理與放射性防護(hù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 衡陽(yáng) 421001)

金屬硫蛋白廣泛存在于動(dòng)物肝臟、腎臟、胰腺和小腸等臟器中，具有消除體內(nèi)自由基、延緩機(jī)體衰老、參與微量元素儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝以及對(duì)重金屬解毒的作用[1]。金屬硫蛋白作為內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)劑，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、修復(fù)細(xì)胞和防止癌癥發(fā)生有著重要作用[2]。近年來(lái)，金屬硫蛋白作為主要生物標(biāo)志物已成為研究熱點(diǎn)[3-4]。因此，研究建立一種方便、高效、易普及的金屬硫蛋白檢測(cè)新方法十分必要。本文基于吖啶橙熒光染料與金納米及金屬硫蛋白相互作用[5-6]，熒光強(qiáng)度變化在一定條件、范圍內(nèi)呈線性相關(guān)的原理，建立了吖啶橙金納米熒光法測(cè)定金屬硫蛋白的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水(電阻18.25 Ω)；金屬硫蛋白、金納米、檸檬酸鈉、鹽酸、吖啶橙、氯金酸、檸檬酸三鈉均為分析純。

F-4500型熒光分光光度計(jì)；UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；PB-20(PB-S)型精密酸度計(jì)；78-1型磁力加熱攪拌器；PrimoR高速低溫離心機(jī)；SHHW21-60型電熱恒溫水浴箱；AB204-S電子分析天平；0.22 μm 針頭式過(guò)濾器。

1.2 溶液配制

1.2.1 金屬硫蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液配制 稱取3.0 mg金屬硫蛋白，用雙蒸水溶解后，移至50 mL容量瓶，定容至刻度，得1.00×10-5mol/L金屬硫蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液。用時(shí)稀釋至1.00×10-6mol/L。

1.2.2 CANa3-HCl緩沖液配制 準(zhǔn)確稱取2.941 0 g檸檬酸鈉，加入雙蒸水，在燒杯中充分溶解后，移至1 000 mL容量瓶,定容至刻度，得0.1 mol/L檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液標(biāo)準(zhǔn)液，再用同濃度鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0，備用。

1.2.3 吖啶橙標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制 稱取0.302 g吖啶橙于燒杯中，加入雙蒸水，充分溶解后，移至 100 mL 容量瓶，定容至刻度，得1.00×10-4mol/L熒光染料-吖啶橙標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用時(shí)稀釋至所需濃度1.00×10-5mol/L。

1.2.4 CANa3溶液配制 稱取1.001 3 g檸檬酸三鈉，用雙蒸水溶解后，移至100 mL容量瓶，定容至刻度，得到38.8 ×10-3mol/L的檸檬酸三鈉標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。

1.3 金納米的處理

取一個(gè)100 mL磨口錐形瓶，用王水浸泡洗凈。依次加入3.3 mL 1%氯金酸和76.7 mL滅菌水，充分混勻，密封后，放置磁力加熱攪拌器中，加熱至沸騰，加入38.8 ×10-3mol/L檸檬酸三鈉12.8 mL，持續(xù)加熱至溶液呈酒紅色，15 min后停止加熱，攪拌冷卻至室溫，用0.22 μm針頭式過(guò)濾器過(guò)濾后備用[7-8]。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 空白實(shí)驗(yàn) 于2 mL EP管中，加入20 μL檸檬酸鈉緩沖液，30 μL吖啶橙標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，40 μL金納米，加滅菌水定容至400 μL，振蕩混勻，常溫反應(yīng)15 min后，進(jìn)行熒光分光光度計(jì)掃描，在最大發(fā)射波長(zhǎng)526 nm處，得熒光強(qiáng)度值為F0，記為空白管。

1.4.2 樣品分析 按空白實(shí)驗(yàn)方法，在加雙蒸水定容前，分別加入不同量1.00×10-6mol/L金屬硫蛋白應(yīng)用液，再加雙蒸水定容至400 μL，振蕩混勻，放置反應(yīng)15 min。測(cè)量試驗(yàn)管的熒光強(qiáng)度(F)?？傻忙=F-F0。儀器調(diào)試相關(guān)參數(shù)，激發(fā)狹峰寬度 5 nm，發(fā)射狹峰寬度10 nm，光電倍增管負(fù)電壓是700 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)機(jī)制探討

熒光傳感體系光譜見(jiàn)圖1。

圖1 傳感系統(tǒng)的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of the sensing system

由圖1可知，當(dāng)體系只加入熒光染料-吖啶橙和緩沖液時(shí)(曲線a)，體系有較大熒光值，表明熒光染料-吖啶橙在緩沖液中能發(fā)出較強(qiáng)熒光。當(dāng)體系分別加入CANa3-HCl緩沖液、吖啶橙和金納米時(shí)(曲線c)，體系有較弱的熒光值，說(shuō)明吖啶橙通過(guò)靜電作用結(jié)合與帶負(fù)電的金納米表面結(jié)合，兩種物質(zhì)距離拉近，發(fā)生了表面熒光能量轉(zhuǎn)移，致體系熒光猝滅。當(dāng)體系分別加入CANa3-HCl緩沖溶液、吖啶橙、金納米和金屬硫蛋白時(shí)(曲線b)，體系有較強(qiáng)的熒光值，表明金屬硫蛋白與金納米有更強(qiáng)的共價(jià)作用，破壞了原有體系，金屬硫蛋白可與吖啶橙染料競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合在金納米表面，使得吖啶橙遠(yuǎn)離金納米粒子，使體系恢復(fù)熒光。

2.2 實(shí)驗(yàn)條件選擇

2.2.1 緩沖體系的優(yōu)化 在CANa3-HCl緩沖液、Tris-HCl緩沖液及BR緩沖液三類(lèi)常用緩沖液進(jìn)行選擇，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 緩沖液的選擇Fig.2 The choice of buffer system

由圖2可知，CANa3-HCl緩沖液體系中ΔF值最大，故選擇CANa3-HCl作為緩沖液。

2.2.2 緩沖液pH的影響 緩沖液pH對(duì)實(shí)驗(yàn)體系影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH的影響Fig.3 Effect of pH on the system

由圖3可知，pH在2.5～4.0時(shí)，ΔF值逐漸增大，當(dāng)pH=4.0時(shí)，ΔF值最大。pH在4.0～8.0時(shí)，ΔF值則持續(xù)遞減。故選擇pH=4的CANa3-HCl緩沖液作為實(shí)驗(yàn)條件。

2.2.3 緩沖溶液加入量的優(yōu)化 CANa3-HCl緩沖液加入量對(duì)體系的影響見(jiàn)圖4。

圖4 緩沖液加入量的影響Fig.4 Effect of buffer volume on the ΔF of the system

由圖4可知，當(dāng)緩沖液用量不足45 μL時(shí)，ΔF值逐步增加，緩沖液用量為45 μL時(shí)，體系ΔF值有最大值。當(dāng)緩沖液用量超過(guò)45 μL時(shí)，ΔF值則持續(xù)降低。故緩沖液的最佳加入量為45 μL。

2.2.4 金納米用量的優(yōu)化 金納米用量對(duì)體系的影響見(jiàn)圖5。

圖5 金納米用量的影響Fig.5 Effect of AuNPs volume on the system

由圖5可知，當(dāng)金納米加入量不足時(shí)，熒光染料猝滅效果不好，導(dǎo)致反應(yīng)體系本底值高，加入金屬硫蛋白后，雖然能使熒光恢復(fù)，但ΔF值偏低。當(dāng)金納米用量為50 μL時(shí)，ΔF值最大。故本實(shí)驗(yàn)選擇 50 μL 的金納米為最佳用量。

2.2.5 吖啶橙用量的優(yōu)化 吖啶橙用量對(duì)體系的影響見(jiàn)圖6。

圖6 吖啶橙用量對(duì)實(shí)驗(yàn)體系的影響Fig.6 Effect of AO volume on the system

由圖6可知，隨著吖啶橙用量的增加，熒光強(qiáng)度隨之加強(qiáng)，ΔF值增大，當(dāng)用量為40 μL時(shí)，ΔF值最大，隨后繼續(xù)增加用量，ΔF值持續(xù)降低。故吖啶橙實(shí)驗(yàn)用量為40 μL。

2.2.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響 反應(yīng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)體系影響見(jiàn)圖7。

圖7 反應(yīng)時(shí)間的影響Fig.7 Effect of reaction time on the system

由圖7可知，隨著反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)，ΔF值逐漸增大，反應(yīng)15 min時(shí)，有最大ΔF值，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，ΔF值持續(xù)下降，故實(shí)驗(yàn)選擇15 min為反應(yīng)時(shí)間。

2.2.7 反應(yīng)溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響 反應(yīng)溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)體系影響見(jiàn)圖8。

圖8 反應(yīng)溫度的影響Fig.8 Effect of temperature on the system

由圖8可知，在不到60 ℃時(shí)，ΔF值隨著溫度的升高而增大，60 ℃時(shí)ΔF值達(dá)到最大，超過(guò)60 ℃，則ΔF值逐步下降。故選擇60 ℃為實(shí)驗(yàn)反應(yīng)溫度。

2.3 干擾物的影響

為驗(yàn)證本方法特異性，取金屬硫蛋白濃度為 1.0×10-7mol/L，其他試劑用量均在優(yōu)化后條件下，檢驗(yàn)多種共存干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，控制相對(duì)誤差在±5%以內(nèi)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 干擾物的影響Table 1 Effect of interferents substance

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及精密度

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在最佳條件下，分別于不同EP管中加入不同體積的金屬硫蛋白標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液測(cè)定熒光值(F)，以未加金屬硫蛋白的為空白管測(cè)定其熒光值(F0)，用ΔF=F-F0定量測(cè)定金屬硫蛋白。結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 金屬硫蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.9 Calibration curve for determination of MTs

由圖9可知，金屬硫蛋白濃度在9.3×10-9～1.5×10-7mol/L時(shí)，體系ΔF值與金屬硫蛋白濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，r=0.996 5，回歸方程為ΔF=3.798+337.3C(×10-7mol/L)。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 分別對(duì)0.1倍和0.9倍兩種金屬硫蛋白濃度為1.5×10-7mol/L標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行6次平行測(cè)定，測(cè)得本實(shí)驗(yàn)方法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.39% 和1.29%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.4.3 檢出限測(cè)定 根據(jù)公式CL=3Sb/k(Sb表示空白液的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)，平行測(cè)定11管空白管熒光值，得到本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)金屬硫蛋白的檢出限為2.79×10-9mol/L。

2.5 樣品分析及加標(biāo)回收率

用清洗干凈的聚乙烯瓶收集一次性尿樣，樣品1、樣品2均來(lái)自于南華大學(xué)的學(xué)生。依據(jù)金屬硫蛋白理化特性和參考有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行尿樣處理[7]：①取一定體積尿樣，加入相同體積濃度為 0.01 mol/L pH=8.5 的Tris-HCl緩沖液中，混勻，低溫離心(4 ℃，4 000 r/min，20 min，條件下同)；②取上清液，80 ℃水浴加熱10 min，冷卻至4 ℃，再離心；③取上清液，加入到3倍體積的預(yù)先制冷至-20 ℃無(wú)水乙醇中，置-20 ℃保存，12 h后再離心；④取沉淀，溶于一定體積的pH=8.5的 Tris-HCl緩沖液中，離心；⑤重復(fù)步驟③，不等待，立即離心；⑥取沉淀，于通風(fēng)處去除乙醇，溶于一定體積的雙蒸水，離心，取上清液100 μL，按1.4.2節(jié)進(jìn)行測(cè)定。再取已測(cè)定過(guò)其濃度的尿樣1和尿樣2，各加20 μL的1.0×10-6mol/L 金屬硫蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4.2節(jié)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平行測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 人體尿樣中金屬硫蛋白的檢測(cè)及回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 2 Determination for MTs of human urine samples and recovery rate test(n=6)

由表2可知，加標(biāo)回收率在97.09%～99.63%之間，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度高。

3 結(jié)論

在酸性條件下，金屬硫蛋白能與金納米有更強(qiáng)結(jié)合能力吸附在一起，使原來(lái)吸附在金納米表面被猝滅的熒光染料-吖啶橙熒光恢復(fù)。建立了熒光傳感器測(cè)定金屬硫蛋白的新方法，優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件：pH=4的CANa3-HCl緩沖液45 μL，金納米加入量50 μL，吖啶橙加入量40 μL，在60 ℃下反應(yīng) 15 min。方法檢測(cè)范圍較寬，在9.3×10-9～1.5×10-7mol/L線性關(guān)系好，r=0.996 5；檢測(cè)限低，達(dá)2.79×10-9mol/L；精密度良好，準(zhǔn)確度高，抗干擾較好，已用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，為環(huán)境樣品中金屬硫蛋白的測(cè)定提供了一種新的實(shí)踐。