• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    外源性硫化氫通過上調(diào)SIRT1延緩心肌早衰抑制尿毒癥大鼠心肌纖維化

    2022-12-21 08:21:38劉達(dá)肖婷梁彪宋熊王森趙俊雄楊軍
    天津醫(yī)藥 2022年12期
    關(guān)鍵詞:糖苷酶尿毒癥纖維化

    劉達(dá),肖婷,梁彪,宋熊,王森,趙俊雄,楊軍△

    心血管并發(fā)癥已成為目前尿毒癥患者的首要死因,而尿毒癥心肌?。║CM)是各類原因所致的腎功能衰竭后重要的心肌損害表現(xiàn),心肌纖維化是其常見的病理改變,不僅可影響心臟順應(yīng)性及左心室舒張功能,嚴(yán)重時(shí)還可引發(fā)惡性心律失常,導(dǎo)致心源性猝死[1]。尿毒癥誘發(fā)心肌纖維化的機(jī)制目前尚不清楚,同時(shí)缺乏具有針對(duì)性的防治措施。近年有研究顯示,尿毒癥環(huán)境下的心肌過早衰老參與了心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制,且可能與尿毒癥毒素誘發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)[2-3]。同時(shí),有研究發(fā)現(xiàn)沉默信息調(diào)節(jié)因子-1(SIRT1)在心血管系統(tǒng)中的潛在保護(hù)效應(yīng)可能與其延緩心肌細(xì)胞衰老有關(guān)[4]。Chen等[5]證實(shí)上調(diào)SIRT1可抑制炎性因子分泌,改善D-半乳糖誘導(dǎo)的心臟早衰。但SIRT1能否介導(dǎo)尿毒癥心肌纖維化的發(fā)生目前尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn),氣體信號(hào)分子硫化氫(H2S)可抑制核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性體活化,調(diào)控炎癥反應(yīng)[6],并可抑制細(xì)胞應(yīng)激性早衰,改善糖尿病所致的心肌纖維化[7],但其能否在尿毒癥導(dǎo)致的心肌纖維化過程中起到保護(hù)作用尚有待探討。本研究通過建立UCM大鼠模型,觀察H2S能否抑制尿毒癥大鼠心肌纖維化,并探討其機(jī)制是否與上調(diào)SIRT1信號(hào)通路進(jìn)而抑制心肌早衰有關(guān)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物48只SPF級(jí),體質(zhì)量為300~350 g的SD雄性成年大鼠(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK湘2015-0002)于溫度適宜、濕度恒定、通氣良好、晝夜12 h交替的南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心喂養(yǎng),自由飲食飲水,干預(yù)過程遵守南華大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)要求。

    1.2 主要試劑及儀器硫氫化鈉(NaHS)、石蠟、中性樹膠購于美國Sigma公司,β-半乳糖苷酶染色試劑盒購于中國上海碧云天公司;NLRP3、白細(xì)胞介素(IL)-1β兔一抗購于美國Cell Signaing Technology公司;SIRT1、P21、P19、P53、GAPDH兔一抗及羊抗兔二抗購于武漢Proteintech公司;恒溫風(fēng)干箱購于北京六一公司,切片機(jī)購于浙江金華實(shí)驗(yàn)儀器廠,化學(xué)發(fā)光成像儀購于上海伯樂公司。血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)檢測(cè)盒購于上海信裕生物科技公司;BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物公司;酶標(biāo)儀購于美國賽默飛科技公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)建模及分組干預(yù)大鼠熟悉環(huán)境5 d后根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(UCM組)、H2S治療組(UCM+H2S組)和H2S對(duì)照組(H2S組),每組12只。UCM組及UCM+H2S組大鼠麻醉后備皮消毒,結(jié)扎切除左腎上下1/3,僅保留左腎中間1/3的血流與功能,止血并縫合手術(shù)切口,7 d后二次手術(shù)將右腎切除,建立5/6腎切除的尿毒癥大鼠模型[8];而Sham組及H2S組大鼠僅行雙腎游離。術(shù)后28 d存活大鼠采血測(cè)BUN和Scr,當(dāng)血BUN和Scr較Sham組升高2~3倍時(shí)認(rèn)為尿毒癥大鼠造模成功[8]。UCM+H2S組和H2S組每日以NaHS溶液50 μmol/kg腹腔注射[9],共給藥8周,Sham組和UCM組注射同劑量生理鹽水。

    1.4 心臟超聲檢測(cè)及樣本收集干預(yù)結(jié)束后麻醉并行心臟超聲檢測(cè)大鼠左心室短軸縮短率(LVFS),隨后處死并收取心臟標(biāo)本。用4%多聚甲醛封存少許心肌組織用做Masson染色。剩余心臟組織立即置于-80℃條件下凍存,用于β-半乳糖苷酶染色及后期的蛋白免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。

    1.5 Masson染色法評(píng)估心肌纖維化情況取封存的心肌標(biāo)本經(jīng)過脫水、石蠟包埋法切制薄片,脫蠟后進(jìn)行核染液染色。再經(jīng)過沖洗、復(fù)染、脫水晾干、封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察,最后使用Image J進(jìn)行圖像分析,測(cè)得藍(lán)染面積/視野中總組織面積為膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。

    1.6 免疫組化法檢測(cè)心?、笮湍z原表達(dá)取石蠟包埋備用的組織切片,經(jīng)脫蠟水化、修復(fù)抗原、暴露抗原決定簇后,封閉非特異性蛋白。再加Ⅲ型膠原一抗4℃孵育過夜。次日漂洗后孵育二抗,充分漂洗、顯色、脫水以及封片后,光鏡下閱片,陽性反應(yīng)時(shí)組織呈棕色,陽性表達(dá)率為視野內(nèi)棕染面積占總視野面積的比值,Image J軟件進(jìn)行定量分析。

    1.7 β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)衰老心肌細(xì)胞取冰凍的包埋心肌組織,切成約6 μm薄片,室溫入蒸餾水5 min×2次;滴加50 μL β-半乳糖苷酶染色固定液于切片,置于濕盒中,室溫孵育15 min,PBS沖洗5 min×3次;吸去PBS,加適宜量的染色試劑。放于濕盒中,置無二氧化碳環(huán)境中37℃孵育過夜;PBS沖洗5 min×3次;最終緩沖甘油封片后于顯微鏡下觀察,陽性反應(yīng)時(shí)組織細(xì)胞呈藍(lán)色,陽性表達(dá)率為視野內(nèi)藍(lán)染面積占總視野面積的比值,Image J軟件進(jìn)行定量分析。

    1.8 蛋白免疫印跡法測(cè)心肌中SIRT1、NLRP3、IL-1β、P21、P19、P53蛋白表達(dá)稱取凍存的心肌標(biāo)本0.2 g,加入裂解液及蛋白酶抑制劑混合后低溫研磨并離心,取上清液,而后采用BCA法定量并配平,最后95℃煮10 min完成蛋白提取。制上層5%濃縮膠、下層10%分離膠電泳分離蛋白后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜;然后5%脫脂奶粉封閉2 h,SIRT1、NLRP3、IL-1β、P21、P19、P53一抗稀釋液(1∶500)4℃冰箱孵育過夜;TBST洗膜后用二抗稀釋液(1∶8 000)室溫孵育1 h,再次漂洗后顯影。以Image J軟件處理圖像,計(jì)算條帶與GAPDH的灰度值比值。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠存活情況及造模結(jié)果術(shù)后28 d,40只大鼠存活。UCM組BUN和Scr較Sham組升高2倍以上,提示尿毒癥大鼠造模成功。UCM組與UCM+H2S組,Sham組與H2S組BUN和Scr差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表1。藥物干預(yù)8周后,Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組分別存活12、7、8、11只大鼠,隨機(jī)數(shù)字表法每組抽取7只大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    Tab.1 Comparison of serum BUN and Scr between the four groups表1各組大鼠血清BUN、Scr比較 (±s)

    Tab.1 Comparison of serum BUN and Scr between the four groups表1各組大鼠血清BUN、Scr比較 (±s)

    *P<0.05;a與Sham組比較,P<0.05。

    組別Sham組UCM組UCM+H2S組H2S組F n 12 8 9 11 BUN(mmol/L)11.11±2.43 25.09±7.04a 23.13±6.23a 10.67±1.94 27.000*Scr(μmol/L)31.75±6.02 109.50±12.45a 106.20±11.69a 32.14±5.61 158.100*

    2.2 各組大鼠心臟超聲LVFS比較Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組LVFS分 別 為0.48±0.04、0.41±0.02、0.47±0.04和0.49±0.02,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=7,F(xiàn)=6.272,P<0.05)。與Sham組比較,UCM組LVFS明顯下降(P<0.05);與UCM組比較,UCM+H2S組LVFS升高(P<0.05),見圖1。

    2.3 各組大鼠心肌Masson染色情況Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組大鼠心肌CVF(%)分別為20.05±1.77、41.86±3.29、30.50±2.59和21.27±2.40,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=7,F(xiàn)=46.390,P<0.05)。與Sham組比較,UCM組大鼠心肌CVF升高(P<0.05),藍(lán)染組織增多;而UCM+H2S組較UCM組大鼠心肌CVF降低(P<0.05),藍(lán)染組織減少;Sham組與H2S組大鼠心肌組織則均較少被藍(lán)染,見圖2。

    Fig.1 Ultrasound image of rat heart function in each group圖1各組大鼠心功能超聲圖像

    2.4 各組大鼠心?、笮湍z原蛋白表達(dá)Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組大鼠心?、笮湍z原陽性表達(dá)率(%)分別為12.35±1.87,26.47±4.05,18.01±2.11,13.13±2.51,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=7,F(xiàn)=16.490,P<0.05)。與Sham組比較,UCM組Ⅲ型膠原陽性表達(dá)率升高(P<0.05),棕染部分增多;而UCM+H2S組較UCM組Ⅲ型膠原陽性表達(dá)率降低(P<0.05),棕染部分則變少;Sham組與H2S組大鼠心肌組織均未被明顯棕染,見圖3。

    2.5 各組大鼠心肌β-半乳糖苷酶染色情況Sham組、UCM組、UCM+H2S組、H2S組心肌的β-半乳糖苷酶染色陽性率(%)分別為0.67±0.38,27.09±3.44、6.66±2.76和0.44±0.13,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=7,F(xiàn)=96.710,P<0.05)。與Sham組相比,UCM組大鼠β-半乳糖苷酶染色陽性率升高(P<0.05),藍(lán)染部分增加;而UCM+H2S組較UCM組β-半乳糖苷酶染色陽性率降低(P<0.05),藍(lán)染部分則變少;Sham組與H2S組大鼠心肌組織均未被明顯藍(lán)染,見圖4。

    2.6 各組心肌組織中SIRT1、NLRP3、IL-1β、P21、P19、P53蛋白表達(dá)情況與Sham組相比,UCM組大鼠NLRP3、IL-1β、P19、P21及P53表達(dá)增多,SIRT1蛋白表達(dá)減少(P<0.05);而UCM+H2S組大鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β、P19、P21及P53蛋白表達(dá)量較UCM組減少,SIRT1蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。與Sham組比較,H2S組大鼠心肌組織中SIRT1、NLRP3、IL-1β、P19、P21、P53表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖5、表3。

    3 討論

    尿毒癥是各種因素導(dǎo)致腎臟失去正常功能后,機(jī)體代謝及生化紊亂的臨床綜合征,其可累及機(jī)體多個(gè)系統(tǒng),以心血管系統(tǒng)損害最為突出[10]。近年來,腎臟替代治療的普及雖使尿毒癥患者的存活時(shí)間延長[11],但尿毒癥所致的心肌損害問題也日漸突出。與高血壓、甲狀腺功能亢進(jìn)等其他因素導(dǎo)致的心肌病變類似,心肌纖維化是UCM發(fā)生發(fā)展中的重要病理過程,其通??蓳p害心臟舒張功能并導(dǎo)致心肌重構(gòu)、誘發(fā)心力衰竭,最終嚴(yán)重影響尿毒癥患者的生活質(zhì)量及生存時(shí)間。

    Fig.2 Masson staining of collagen fibers in myocardial tissue of rats in each group(×400)圖2各組大鼠心肌組織膠原纖維Masson染色(×400)

    Fig.3 Expression of typeⅢcollagen in myocardial tissue of rats in each group(immunohistochemical staining,×400)圖3各組大鼠心肌組織Ⅲ型膠原表達(dá)情況(免疫組化染色,×400)

    Fig.4 The aging level of myocardial tissue of rats in each group(β-galactosidase staining,×400)圖4各組大鼠左室心肌組織衰老情況(β-半乳糖苷酶染色,×400)

    Fig.5 The protein expression levels of SIRT1,P21,P19,P53,NLRP3 and IL-1β in myocardial tissue of rats in each group圖5各組大鼠心肌組織中SIRT1、P21、P19、P53及NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)

    Tab.3 Comparison of SIRT1,P21,P19,P53,NLRP3 and IL-1β protein expression levels in myocardial tissue of rats between the four groups表3各組大鼠心肌SIRT1、P21、P19、P53及NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較 (n=7,±s)

    Tab.3 Comparison of SIRT1,P21,P19,P53,NLRP3 and IL-1β protein expression levels in myocardial tissue of rats between the four groups表3各組大鼠心肌SIRT1、P21、P19、P53及NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)水平比較 (n=7,±s)

    *P<0.05;a與Sham組比較,b與UCM組比較,P<0.05。

    組別Sham組UCM組UCM+H2S組H2S組F SIRT1 0.87±0.07 0.69±0.05a 0.83±0.04b 0.83±0.01 6.381*P21 0.69±0.02 0.93±0.04a 0.68±0.02b 0.69±0.02 51.420*P19 1.18±0.08 1.46±0.03a 1.25±0.03b 1.29±0.04 14.150*組別Sham組UCM組UCM+H2S組H2S組F P53 0.57±0.01 0.79±0.02a 0.60±0.01b 0.59±0.01 96.370*NLRP3 0.68±0.03 0.89±0.04a 0.84±0.02b 0.69±0.04 23.890*IL-1β 0.79±0.07 1.16±0.10a 0.92±0.08b 0.81±0.06 11.980*

    尿毒癥誘發(fā)心肌纖維化的機(jī)制目前并不清楚,但持續(xù)的輕度炎癥和組織器官過早衰老是尿毒癥的特征之一。有研究顯示慢性腎功能衰竭時(shí)心肌細(xì)胞應(yīng)激性衰老可誘發(fā)心肌纖維化[3],且其可能與尿毒癥毒素誘發(fā)的慢性炎癥反應(yīng)有關(guān)[2]。此外,本課題組近年研究也發(fā)現(xiàn)了心肌細(xì)胞早衰參與糖尿病心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制[7]。衰老相關(guān)蛋白P21、P19及P53是目前被用于評(píng)估心肌衰老的重要指標(biāo)[4,12]。本研究發(fā)現(xiàn),UCM組大鼠存在明顯心肌纖維化,同時(shí)炎癥相關(guān)蛋白NLRP3、IL-1β及衰老相關(guān)蛋白P21、P19及P53在UCM組心肌組織中表達(dá)較Sham組顯著增加,通過β-半乳糖苷酶染色法也發(fā)現(xiàn)UCM組的心肌衰老較Sham組大鼠更為顯著,以上結(jié)果提示炎癥反應(yīng)及其誘發(fā)的心肌細(xì)胞過早衰老可能參與了尿毒癥所致的心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制。

    沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirtuins)家族蛋白為一組具有高度保守催化結(jié)構(gòu)域的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性去乙?;?,在細(xì)胞衰老、生長發(fā)育以及各種疾病過程中均起著關(guān)鍵調(diào)控作用,同時(shí)也是公認(rèn)的長壽因子。目前發(fā)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物體內(nèi)Sirtuins的7個(gè)家族成員,其中在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)的有SIRT1與SIRT2,而主要表達(dá)于線粒體的有SIRT3、SIRT4和SIRT5,SIRT6和SIRT7則主要表達(dá)于細(xì)胞核[13]。其中SIRT1被認(rèn)為在衰老、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激抵抗和炎癥過程中發(fā)揮多種功能[14-15]。SIRT1可通過抑制P53的表達(dá)活化以及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β 1)/Smads信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)改善肝纖維化[16]。Sun等[17]發(fā)現(xiàn)SIRT1可通過抑制NLRP3炎癥小體活化,減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)。此外,有研究發(fā)現(xiàn)抑制NLRP3炎癥小體表達(dá)可防止心臟衰老[18]。本研究顯示,在UCM組心肌組織中SIRT1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),提示SIRT1可能參與了尿毒癥大鼠心肌細(xì)胞炎性早衰的調(diào)控機(jī)制。

    H2S是一種新型氣體信號(hào)分子,具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)保護(hù)作用[19]。在心血管系統(tǒng)中其主要有舒張血管平滑肌細(xì)胞、促進(jìn)血管新生以及抑制細(xì)胞凋亡等保護(hù)作用。同時(shí)也有研究顯示,在各種纖維化疾病的動(dòng)物模型中血清H2S水平下降,而適當(dāng)補(bǔ)充外源性H2S具有抑制腎、肺、肝、心等組織器官的纖維化的作用[20]。近年也有研究證實(shí)H2S能通過減少心肌間質(zhì)膠原纖維的沉積及Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)改善高同型半胱氨酸誘發(fā)的大鼠心肌纖維化[21]。本研究發(fā)現(xiàn),相對(duì)于UCM組,UCM+H2S組大鼠心肌Masson染色顯示心肌間質(zhì)膠原纖維沉積減少,且免疫組化染色結(jié)果也顯示大鼠心肌中Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)下降,提示尿毒癥大鼠心肌纖維化得到改善。此外,UCM+H2S組較UCM組大鼠LVFS升高,心功能改善,同時(shí)心肌中SIRT1蛋白表達(dá)上調(diào),NLRP3炎性小體及炎性因子IL-1β、衰老蛋白P19、P21及P53蛋白表達(dá)減少,β-半乳糖苷酶染色陽性率下降,心肌衰老得到緩解。以上提示氣體信號(hào)分子H2S可抑制尿毒癥環(huán)境下的心肌纖維化,其機(jī)制可能與其上調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)并延緩心肌細(xì)胞過早衰老有關(guān)。而H2S組和Sham組各指標(biāo)比較無顯著差異,表明補(bǔ)充該劑量的外源性H2S并不會(huì)對(duì)正常大鼠造成顯著影響,治療劑量下的H2S是相對(duì)安全的。但大劑量的外源性H2S極有可能會(huì)對(duì)大鼠造成損害甚至死亡[22],故嚴(yán)格把握干預(yù)試劑的劑量十分重要。

    綜上所述,本研究證實(shí)氣體信號(hào)分子H2S對(duì)尿毒癥心肌病大鼠心肌纖維化的拮抗作用,這可能與SIRT1負(fù)性調(diào)控尿毒癥環(huán)境下心肌炎癥反應(yīng)、緩解心肌衰老有關(guān)。本研究有望為今后UCM的防治提供新的治療靶點(diǎn)及理論依據(jù)。

    猜你喜歡
    糖苷酶尿毒癥纖維化
    肝纖維化無創(chuàng)診斷研究進(jìn)展
    傳染病信息(2022年3期)2022-07-15 08:24:28
    肝纖維化的中醫(yī)藥治療
    肝博士(2021年1期)2021-03-29 02:32:16
    知母中4種成分及對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:58
    人物
    健康人生(2017年12期)2017-12-21 02:25:52
    木蝴蝶提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:19:32
    中西醫(yī)結(jié)合治療尿毒癥早期腎性貧血20例療效觀察
    腎纖維化的研究進(jìn)展
    血液透析聯(lián)合血液灌流對(duì)尿毒癥自主神經(jīng)病變的影響
    尿毒癥患者血液透析前后血清蛋白電泳圖譜分析
    六種花提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性研究
    精品久久久久久久毛片微露脸| 一区福利在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产在线精品亚洲第一网站| 成年免费大片在线观看| 999精品在线视频| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 高清在线国产一区| 狂野欧美激情性xxxx| 91麻豆av在线| 正在播放国产对白刺激| 日本成人三级电影网站| 国产成人系列免费观看| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 淫妇啪啪啪对白视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 无遮挡黄片免费观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产欧美日韩一区二区精品| 中文字幕最新亚洲高清| 一区二区三区激情视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 91国产中文字幕| 婷婷丁香在线五月| 高潮久久久久久久久久久不卡| 看免费av毛片| 欧美一级a爱片免费观看看 | 99riav亚洲国产免费| 成年人黄色毛片网站| av福利片在线| av免费在线观看网站| 黄色毛片三级朝国网站| 香蕉久久夜色| 久热爱精品视频在线9| 不卡一级毛片| 波多野结衣高清无吗| av欧美777| 久久天堂一区二区三区四区| 午夜福利一区二区在线看| 久久精品国产清高在天天线| 丰满的人妻完整版| 黄色视频不卡| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 波多野结衣高清无吗| 亚洲成人久久性| 久热爱精品视频在线9| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 观看免费一级毛片| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产午夜福利久久久久久| 黄片小视频在线播放| www.熟女人妻精品国产| 欧美成人午夜精品| 99热只有精品国产| tocl精华| 一级毛片女人18水好多| 不卡一级毛片| 黄色视频,在线免费观看| 午夜老司机福利片| 香蕉久久夜色| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩av在线大香蕉| 日韩欧美国产在线观看| 婷婷亚洲欧美| 一进一出好大好爽视频| 久久午夜亚洲精品久久| 久久 成人 亚洲| 国产爱豆传媒在线观看 | 听说在线观看完整版免费高清| 免费在线观看黄色视频的| 久久 成人 亚洲| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲九九香蕉| 国产精品 欧美亚洲| 国产黄片美女视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 两性夫妻黄色片| 两个人看的免费小视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美日韩乱码在线| 成人手机av| 免费在线观看黄色视频的| 女人被狂操c到高潮| 欧美乱码精品一区二区三区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 一进一出好大好爽视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日韩av在线大香蕉| 国内精品久久久久久久电影| 国产精品久久电影中文字幕| 看黄色毛片网站| 好男人电影高清在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 麻豆成人午夜福利视频| 9191精品国产免费久久| av在线播放免费不卡| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 又紧又爽又黄一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 可以在线观看的亚洲视频| 日日夜夜操网爽| 亚洲专区中文字幕在线| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 99热这里只有精品一区 | 老司机午夜福利在线观看视频| 又黄又粗又硬又大视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 99在线视频只有这里精品首页| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美+亚洲+日韩+国产| 免费高清在线观看日韩| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲中文av在线| 一本久久中文字幕| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲专区字幕在线| 亚洲最大成人中文| 一级黄色大片毛片| 波多野结衣高清无吗| 丰满的人妻完整版| 精品免费久久久久久久清纯| 国产单亲对白刺激| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 免费av毛片视频| 最近在线观看免费完整版| 成人欧美大片| 免费看a级黄色片| 狠狠狠狠99中文字幕| svipshipincom国产片| 久久精品91蜜桃| 欧美激情极品国产一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 激情在线观看视频在线高清| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 啦啦啦韩国在线观看视频| 大型黄色视频在线免费观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 丁香欧美五月| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 在线国产一区二区在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 高清毛片免费观看视频网站| 久久青草综合色| 好男人电影高清在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美成人午夜精品| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲成国产人片在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 99在线人妻在线中文字幕| 无人区码免费观看不卡| 免费无遮挡裸体视频| 免费电影在线观看免费观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 看片在线看免费视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 男人的好看免费观看在线视频 | 自线自在国产av| 国产精品精品国产色婷婷| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲一区二区三区色噜噜| 成人亚洲精品一区在线观看| 人妻久久中文字幕网| 国产精品免费视频内射| 免费在线观看完整版高清| 国产麻豆成人av免费视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 日韩欧美三级三区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久久久久久久久黄片| 免费看日本二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 美女高潮到喷水免费观看| 国产97色在线日韩免费| 欧美三级亚洲精品| 日本a在线网址| 正在播放国产对白刺激| 色在线成人网| tocl精华| 老司机在亚洲福利影院| 精品一区二区三区四区五区乱码| 日本成人三级电影网站| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲免费av在线视频| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲精品美女久久av网站| 桃色一区二区三区在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 日本 欧美在线| 日日夜夜操网爽| 亚洲国产精品999在线| 在线观看午夜福利视频| 国产亚洲精品一区二区www| 国产欧美日韩一区二区三| 一进一出抽搐动态| 国产乱人伦免费视频| 香蕉av资源在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美不卡视频在线免费观看 | 欧美乱妇无乱码| 久久精品国产综合久久久| 国产一卡二卡三卡精品| 婷婷丁香在线五月| 日韩欧美国产一区二区入口| 十八禁人妻一区二区| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 在线观看免费午夜福利视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产一区二区在线av高清观看| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美三级亚洲精品| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 精品电影一区二区在线| 国产精品 国内视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产成人av教育| av免费在线观看网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美日本亚洲视频在线播放| 高清毛片免费观看视频网站| 无限看片的www在线观看| 久久中文看片网| 国产区一区二久久| 国产高清视频在线播放一区| 免费看十八禁软件| 一本大道久久a久久精品| 亚洲av美国av| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲真实伦在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲国产中文字幕在线视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美黑人巨大hd| 日日爽夜夜爽网站| 1024香蕉在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲一区二区三区色噜噜| 18禁美女被吸乳视频| 我的亚洲天堂| 久热这里只有精品99| bbb黄色大片| 少妇 在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 国产片内射在线| 日韩欧美国产一区二区入口| a在线观看视频网站| 国产亚洲精品一区二区www| 99精品欧美一区二区三区四区| 色av中文字幕| 午夜免费成人在线视频| 久久久国产成人免费| 亚洲av五月六月丁香网| 91av网站免费观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲熟女毛片儿| 免费av毛片视频| 国产三级黄色录像| 亚洲国产精品成人综合色| 精品久久久久久成人av| 亚洲自偷自拍图片 自拍| av欧美777| 亚洲五月天丁香| 亚洲人成网站高清观看| 日韩欧美 国产精品| 亚洲无线在线观看| 免费在线观看成人毛片| 国产伦在线观看视频一区| www日本黄色视频网| 啪啪无遮挡十八禁网站| 91大片在线观看| 精品电影一区二区在线| 嫩草影院精品99| 精品久久蜜臀av无| 亚洲熟女毛片儿| 国产精品一区二区三区四区久久 | 91在线观看av| 在线永久观看黄色视频| 国产成人啪精品午夜网站| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久九九热精品免费| 欧美国产精品va在线观看不卡| av有码第一页| 精品第一国产精品| 丰满的人妻完整版| 正在播放国产对白刺激| 一区二区日韩欧美中文字幕| 校园春色视频在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产欧美日韩一区二区精品| 妹子高潮喷水视频| 午夜福利视频1000在线观看| 日本成人三级电影网站| 在线观看午夜福利视频| 一二三四在线观看免费中文在| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久国产亚洲av麻豆专区| 在线观看www视频免费| 中文字幕久久专区| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产爱豆传媒在线观看 | 婷婷精品国产亚洲av在线| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日本成人三级电影网站| 午夜视频精品福利| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产欧美日韩精品亚洲av| 狠狠狠狠99中文字幕| 麻豆成人午夜福利视频| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 午夜久久久在线观看| 国产精品国产高清国产av| 久久中文看片网| 亚洲免费av在线视频| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 9191精品国产免费久久| 久久狼人影院| 高清毛片免费观看视频网站| 中文字幕久久专区| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲男人天堂网一区| 两性夫妻黄色片| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 午夜两性在线视频| 岛国视频午夜一区免费看| 国产亚洲精品久久久久5区| a级毛片在线看网站| 操出白浆在线播放| 久久久久国产一级毛片高清牌| xxx96com| 9191精品国产免费久久| 又紧又爽又黄一区二区| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 国产精品久久电影中文字幕| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久精品91蜜桃| 黄色女人牲交| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精品福利观看| 黄色视频不卡| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 老汉色∧v一级毛片| 国产黄色小视频在线观看| 黄片播放在线免费| 波多野结衣av一区二区av| 99riav亚洲国产免费| e午夜精品久久久久久久| 手机成人av网站| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲国产精品合色在线| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品永久免费网站| 女同久久另类99精品国产91| 欧美激情极品国产一区二区三区| 成人亚洲精品av一区二区| 老司机靠b影院| 精品免费久久久久久久清纯| 人人澡人人妻人| 亚洲欧美日韩无卡精品| 高清毛片免费观看视频网站| 色播在线永久视频| 欧美午夜高清在线| 两人在一起打扑克的视频| 婷婷精品国产亚洲av| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美中文综合在线视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品一区二区三区av网在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 不卡一级毛片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美一级毛片孕妇| 成人av一区二区三区在线看| 日日干狠狠操夜夜爽| 99精品在免费线老司机午夜| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久9热在线精品视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 一二三四社区在线视频社区8| 精品日产1卡2卡| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久精品成人免费网站| 美国免费a级毛片| 国产黄a三级三级三级人| 九色国产91popny在线| 久久亚洲精品不卡| 国产亚洲欧美98| 丝袜在线中文字幕| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲色图av天堂| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日韩大码丰满熟妇| 一区二区三区激情视频| 一级作爱视频免费观看| 亚洲精品在线观看二区| 免费看日本二区| 精华霜和精华液先用哪个| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产一区在线观看成人免费| 色尼玛亚洲综合影院| 国产av一区二区精品久久| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲av成人av| 午夜日韩欧美国产| 精品久久久久久久毛片微露脸| 搡老熟女国产l中国老女人| 日本免费a在线| 亚洲av五月六月丁香网| 大香蕉久久成人网| 妹子高潮喷水视频| 午夜激情福利司机影院| 日本免费一区二区三区高清不卡| 99久久精品国产亚洲精品| 久久人人精品亚洲av| 老司机午夜福利在线观看视频| av在线播放免费不卡| 亚洲第一电影网av| 十八禁网站免费在线| 精品高清国产在线一区| 国产精品av久久久久免费| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久久国产成人免费| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲激情在线av| 久久青草综合色| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产激情久久老熟女| 精品国产一区二区三区四区第35| av中文乱码字幕在线| 欧美成狂野欧美在线观看| 人人妻人人看人人澡| 久久久水蜜桃国产精品网| xxxwww97欧美| 久久亚洲真实| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲美女黄片视频| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 欧美激情 高清一区二区三区| 国产成人av教育| 日本成人三级电影网站| 一级片免费观看大全| 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美日韩乱码在线| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 精品无人区乱码1区二区| 精品电影一区二区在线| 99久久国产精品久久久| 嫩草影视91久久| 成年免费大片在线观看| 成人三级黄色视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲片人在线观看| 级片在线观看| 亚洲av美国av| 精品日产1卡2卡| av欧美777| 国产精品 欧美亚洲| 免费av毛片视频| 日本三级黄在线观看| av在线播放免费不卡| 亚洲精品国产一区二区精华液| 午夜福利欧美成人| 亚洲一区高清亚洲精品| 最好的美女福利视频网| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久狼人影院| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 精品欧美一区二区三区在线| 国产高清视频在线播放一区| x7x7x7水蜜桃| 此物有八面人人有两片| 99久久国产精品久久久| 日韩免费av在线播放| 可以在线观看的亚洲视频| 波多野结衣av一区二区av| 中出人妻视频一区二区| 日本 av在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 欧美午夜高清在线| 伦理电影免费视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲第一青青草原| 淫妇啪啪啪对白视频| 99在线人妻在线中文字幕| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久伊人香网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 我的亚洲天堂| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲午夜理论影院| 国产精品精品国产色婷婷| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品98久久久久久宅男小说| 俺也久久电影网| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 婷婷精品国产亚洲av| 又大又爽又粗| 欧美日韩黄片免| 在线观看日韩欧美| 99国产极品粉嫩在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美日本亚洲视频在线播放| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲精品一区av在线观看| 在线观看日韩欧美| 成人国产一区最新在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 淫秽高清视频在线观看| 最近在线观看免费完整版| www.精华液| 麻豆一二三区av精品| 日本五十路高清| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美黑人巨大hd| 国产激情久久老熟女| 精品国产亚洲在线| 国产精品二区激情视频| 欧美日韩精品网址| 露出奶头的视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 在线观看一区二区三区| 后天国语完整版免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲av美国av| 成人18禁在线播放| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲精品色激情综合| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 日本熟妇午夜| 久久精品人妻少妇| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 高清在线国产一区| 久久人人精品亚洲av| 欧美午夜高清在线| 久久九九热精品免费| 99精品在免费线老司机午夜| 宅男免费午夜| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲国产欧美一区二区综合| 精品午夜福利视频在线观看一区| 18禁观看日本| 大型av网站在线播放| 日本熟妇午夜| 黄色视频不卡| 成人精品一区二区免费| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲成a人片在线一区二区| 日韩国内少妇激情av| 国产91精品成人一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲精品国产区一区二| 高潮久久久久久久久久久不卡| 岛国视频午夜一区免费看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 免费在线观看日本一区| 午夜福利18| 可以在线观看的亚洲视频|