乳腺癌新輔助化療前后sTIL和PD-L1(SP142)的變化及其臨床意義

羅 帥，李 瑤，鐘戀君，鐘燕燕，王 凱，譚 娜，王進京

乳腺癌是全球女性發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性健康[1]。新輔助化療是治療乳腺癌的重要手段，旨在使腫瘤降期、增加手術(shù)及保乳機會，也可獲取藥物敏感性信息進而指導(dǎo)后續(xù)治療。同時，新輔助化療前后生物學(xué)標(biāo)志物可以發(fā)生改變，且與治療及預(yù)后相關(guān)[2]。本文探討新輔助化療前后腫瘤間質(zhì)浸潤淋巴細(xì)胞(stromal tumor infiltrating lymphocytes, sTIL)浸潤水平和PD-L1表達的變化，分析其與臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，為新輔助化療療效評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015～2019年遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科乳腺癌患者80例。納入標(biāo)準(zhǔn)：女性、術(shù)前穿刺活檢確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、新輔助化療4～6周期、新輔助化療后行乳腺癌改良根治術(shù)、臨床病理資料及隨訪信息；患者治療前后的存檔蠟塊及切片完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：新輔助化療后達病理完全緩解(pathologic complete response, pCR)，確診時有其它原發(fā)腫瘤或免疫系統(tǒng)疾病者。

1.2 方法選取具有代表性蠟塊組織[3]，如穿刺標(biāo)本：浸潤性癌成分最多且長度≥5 mm，根治術(shù)后標(biāo)本：殘余腫瘤組織最多；行常規(guī)HE染色及免疫組化EnVision兩步法染色。抗人PD-L1單克隆抗體(SP142，稀釋度1 ∶100；上海羅氏公司)，ER、PR、HER-2、Ki-67及EnVision試劑盒購自福州邁新公司，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。切片均由兩名病理醫(yī)師，采用雙盲法判讀。

1.3 判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1sTIL判讀標(biāo)準(zhǔn) 參考2014年國際腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)工作組對乳腺癌TIL評估建議[4]，sTIL評分=(腫瘤間質(zhì)內(nèi)單個核炎性細(xì)胞面積/腫瘤間質(zhì)面積)×100%；而對于新輔助化療后sTIL判讀按以上標(biāo)準(zhǔn)和Dieci等[5]評估建議進行；低倍鏡下(100×)界定HE染色切片上的浸潤性癌區(qū)域，隨機選取區(qū)域內(nèi)7個高倍視野(400×)，排除sTIL最高和最低值，計算sTIL評分的平均值。按sTIL百分比分成低sTIL浸潤組(<10%)、中sTIL浸潤組(10%～50%)、高sTIL浸潤組(>50%)。

1.3.2PD-L1(SP142)判讀標(biāo)準(zhǔn) 以扁桃體組織作為陽性對照，觀察腫瘤細(xì)胞中免疫細(xì)胞(immune cells, IC)的PD-L1染色情況，任何浸潤性癌及周邊的腫瘤相關(guān)間質(zhì)中IC表達所占區(qū)域：≥1%定義為陽性[6]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.00軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用χ2檢驗及Fisher確切概率法進行兩分類變量相關(guān)性分析；無瘤生存期(disease-free surviva, DFS)定義為從新輔助化療后行手術(shù)切除到疾病復(fù)發(fā)或死亡時間，總生存期(overall surviva, OS)定義為從手術(shù)切除到死亡時間，采用Kaplan-Meier法比較各組的DFS及OS，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征本組80例乳腺癌新輔助化療前粗針穿刺及配對新輔助化療后手術(shù)標(biāo)本，患者均為女性，年齡29～72歲，平均47歲。組織學(xué)分級I級10例(12.5%)，Ⅱ級64例(80.0%)，Ⅲ級6例(7.5%)。ER陽性54例(67.5%)，PR陽性36例(45.0%)，HER-2陽性26例(32.5%)。脈管侵犯15例(18.8%)；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例(56.3%)(表1)。

2.2 新輔助化療前后sTIL浸潤水平變化與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系新輔助化療前穿刺組織中sTIL水平：低sTIL組(67.5%)、中sTIL組(22.5%)、高sTIL組(10.0%)(圖1～3)。新輔助化療后根治術(shù)標(biāo)本中sTIL水平：低sTIL組(45.0%)、中sTIL組(28.7%)、高sTIL組(26.3%)，其中有8例sTIL浸潤等級降低，43例不變，29例升高。sTIL與患者年齡(P=0.025)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.026)有相關(guān)性；與腫瘤最大徑、組織學(xué)分級、ER表達、PR表達、HER-2狀態(tài)、Ki-67、脈管侵犯、分子分型及MP分級均無相關(guān)性(表1)。

2.3 新輔助化療前、后PD-L1表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系乳腺癌中PD-L1表達模式：乳腺癌間質(zhì)免疫細(xì)胞胞膜的完整或環(huán)狀棕黃色染色(圖4)，以扁桃體組織作為陽性對照(圖5)。新輔助化療前、后PD-L1陽性率分別為18.8%、32.5%。新輔助化療后，10例PD-L1由陽性轉(zhuǎn)為陰性，49例PD-L1前后不變，21例PD-L1陰性轉(zhuǎn)陽性；PD-L1與患者年齡、腫瘤最大徑、組織學(xué)分級等臨床病理參數(shù)均無相關(guān)性(表1)。

2.4 生存分析以患者行手術(shù)日期為隨訪起點，對80例新輔助化療進行隨訪，失訪5例，剩余75例患者中位隨訪時間35個月(14～77個月)，3例復(fù)發(fā)，6例死亡。結(jié)果顯示：sTIL不同變化組間的DFS及OS無明顯差異(P=0.686，P=0.776，圖6、7)；PD-L1不同變化組間的DFS及OS也無明顯差異(P=0.575，P=0.713，圖8、9)。

3 討論

新輔助化療作為乳腺癌系統(tǒng)性治療的重要組成部分，在臨床治療中有獨特的優(yōu)勢，新輔助化療宏觀上能引起腫瘤體積變化，微觀上可引起微環(huán)境中生物學(xué)標(biāo)志物的變化[7]。目前，對新輔助化療后微環(huán)境中腫瘤免疫分子標(biāo)志物變化及具體機制研究尚不清楚，尤其是PD-L1(SP142)表達與臨床病理特征及預(yù)后相關(guān)性報道較少。

①②③④⑤圖1 sTIL呈低浸潤水平分布于乳腺癌間質(zhì)中 圖2 sTIL呈中等浸潤水平分布于乳腺癌間質(zhì)中 圖3 sTIL呈高浸潤水平分布于乳腺癌間質(zhì)中 圖4 PD-L1在乳腺癌間質(zhì)的IC中表達,EnVision兩步法 圖5 PD-L1在扁桃體中表達(陽性對照),EnVision兩步法

表1 新輔助化療前后sTIL、PD-L1變化與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

目前，sTIL作為乳腺癌腫瘤微環(huán)境中研究較廣泛的免疫組化標(biāo)志物，高水平sTIL與更好的新輔助化療療效及預(yù)后相關(guān)，尤其是在三陰型和HER-2過表達型乳腺癌中[8]。新輔助化療后sTIL水平可改變，本組中新輔助化療前后高sTIL浸潤組分別為：10%、26.3%，有29例sTIL浸潤等級升高，有8例降低，總體比例呈升高趨勢，與文獻報道[9-10]一致。本實驗結(jié)果顯示sTIL與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，年齡較大(≥50歲)患者組新輔助化療后sTIL升高比例高于年齡較小組(<50歲)，可能原因是年齡偏低組的自身免疫系統(tǒng)更穩(wěn)定，微環(huán)境的調(diào)節(jié)能力更強，不易受新輔助化療影響而導(dǎo)致sTIL的改變。淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組新輔助化療后sTIL升高的比例明顯高于伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，可能的原因是伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組微環(huán)境中sTIL免疫反應(yīng)功能較弱，導(dǎo)致腫瘤侵襲性變強易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

除了sTIL外，PD-L1也是乳腺癌腫瘤微環(huán)境中重要的免疫組化標(biāo)志物，其預(yù)后價值仍存在爭議。Impassion 130數(shù)據(jù)表明[11]，腫瘤浸潤免疫細(xì)胞PD-L1陽性(IC>1%)的晚期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移三陰型乳腺癌患者可以在阿替利珠單抗+白蛋白紫杉醇治療中獲益；但Impassion 131 Ⅲ期臨床試驗[12]卻顯示無法獲益。目前，關(guān)于PD-L1(SP142)在乳腺癌新輔助化療的研究較少。本組新輔助化療前后PD-L1陽性率分別為18.8%、32.5%，新輔助化療后有21例由陰性轉(zhuǎn)陽性，10例由陽性轉(zhuǎn)陰性。在新輔助化療后由陰性轉(zhuǎn)陽性的21例病例中，有13例前后乳腺癌間質(zhì)中的PD-L1陽性IC分布不均，剩余8例新輔助化療前后的IC分布基本一致；在新輔助化療后由陽性轉(zhuǎn)陰性的10例中，有2例新輔助化療前后的PD-L1免疫細(xì)胞分布不均，新輔助化療后免疫細(xì)胞減少。本組PD-L1與患者年齡、腫瘤最大徑、組織學(xué)分級等臨床病理參數(shù)及sTIL免疫組化指標(biāo)均無相關(guān)性，是首次對新輔助化療前后PD-L1(SP142)相關(guān)性分析。

圖6 sTIL不同變化組與患者DFS的關(guān)系

圖7 sTIL不同變化組與患者OS的關(guān)系

圖8 PD-L1不同變化組與DFS的關(guān)系

圖9 PD-L1不同變化組與OS的關(guān)系

目前，關(guān)于新輔助化療后sTIL、PD-L1(SP142)變化的預(yù)后意義研究較少，sTIL的預(yù)后意義也存在爭議。Liu等[13]發(fā)現(xiàn)新輔助化療后sTIL增加與預(yù)后不良相關(guān)，而Miyashita等[14]的發(fā)現(xiàn)與之相反。本組中sTIL不同組間未出現(xiàn)明顯生存優(yōu)勢的差異，但從生存曲線可看出sTIL改變組的生存優(yōu)勢均優(yōu)于sTIL不變組，與Lee等[15]研究一致；PD-L1不同組間也未出現(xiàn)明顯生存優(yōu)勢的差異，但PD-L1陰性轉(zhuǎn)陽性組的DFS及OS均低于PD-L1陽性轉(zhuǎn)陰性組和不變組。由此可見，PD-L1的表達傾向于不良預(yù)后。鑒于本實驗樣本量有限，sTIL和PD-L1的預(yù)后意義還需擴大樣本量進一步明確。

總之，新輔助化療后乳腺癌腫瘤免疫相關(guān)指標(biāo)sTIL和PD-L1可發(fā)生變化，客觀評價新輔助化療后腫瘤免疫相關(guān)指標(biāo)變化，對臨床預(yù)后評估及個體化治療具有積極意義。