應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)探討四神煎對膝骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的“異病同治”機制

鐘賢興， 安鎮(zhèn)南， 高豐禾， 吳春飛， 范帥， 梁祖建

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東廣州 510240）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）都是骨傷科、風(fēng)濕免疫科常見的關(guān)節(jié)疾病。2種疾病的發(fā)病特征均具有病因復(fù)雜、病癥多樣化、病程遷延等特點，臨床表現(xiàn)多為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形、活動受限，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是累及整個關(guān)節(jié)的慢性退行性疾病，而KOA在臨床最常見，主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛與活動受限[2]。RA是以關(guān)節(jié)滑膜炎、炎性骨破壞為主要特征的慢性炎癥性自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為全身多發(fā)骨關(guān)節(jié)病變、關(guān)節(jié)畸形、晨僵等[3]?，F(xiàn)階段，KOA和RA的治療仍缺乏特效藥物及方法，臨床療效仍不理想。隨著中醫(yī)藥研究的不斷發(fā)展，中醫(yī)藥在治療KOA、RA方面顯現(xiàn)出多靶點干預(yù)與安全有效的獨特優(yōu)勢，具有深厚的臨床實踐基礎(chǔ)。

四神煎出自清代鮑相璈《驗方新編》“病在筋則伸不能屈，在骨則移動多艱，久則日粗日腫，大腿日細，痛而無膿，顏色不變，成敗癥矣，立方四神煎?！狈街校褐赜命S芪為君，匡扶正氣以蠲痹除滯；牛膝強健筋骨，通利關(guān)節(jié)，尤善治膝關(guān)節(jié)屈伸不利；金銀花清熱解毒，消瘀化熱，治療關(guān)節(jié)腫痛；遠志可祛痰消腫；石斛可養(yǎng)陰生津。該方用藥雖僅5味，但組方嚴謹，既補已損之氣陰，又驅(qū)除經(jīng)絡(luò)之郁邪，補而不滯，清而不寒；藥簡而量大，功專而效宏。近代著名中醫(yī)家岳美中先生盛贊此方為治療膝痹的專病專方，其言“鶴膝風(fēng)，膝關(guān)節(jié)紅腫疼痛步履維艱，投以《驗方新編》四神煎恒效”“歷年來余與同人用此方治此病，每隨治隨效，難以枚舉”。隨著四神煎應(yīng)用范圍的擴大，臨床報道可見醫(yī)家用其治療RA、膝關(guān)節(jié)滑膜炎、強直性脊柱炎、糖尿病周圍神經(jīng)病變[4]，療效顯著，凸顯了中醫(yī)藥異病同治的獨特優(yōu)勢。但中藥成分復(fù)雜，關(guān)于四神煎的物質(zhì)基礎(chǔ)及其治療KOA及RA的作用機制仍未闡明。故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“整體觀”的研究方法，構(gòu)建“疾病-通路-靶點-藥物”的多級網(wǎng)絡(luò)，從多角度分析并闡述四神煎組方中藥的主要活性成分和KOA、RA的關(guān)聯(lián)性，以期進一步拓展四神煎異病同治的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床推廣應(yīng)用和深入研究提供理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1藥物有效活性成分及靶點的篩選應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn/）檢索黃芪、牛膝、遠志、石斛、金銀花的化學(xué)成分，根據(jù)檢索結(jié)果，按ADME原則[口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，藥物半衰期（half-life，HL）≥4]進行篩選，獲得其活性成分，并預(yù)測其對應(yīng)靶點。將篩選所得所有靶蛋白名稱導(dǎo)入UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org），設(shè)置物種為人類（Homo sapiens），對得到的靶蛋白進行比對和基因名校正，轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)的基因名，并刪除無對應(yīng)基因名的靶蛋白。對未檢索到的中藥“石斛”“遠志”，分別從BATM-TCM數(shù)據(jù)庫、HERB數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn/）檢索相關(guān)化學(xué)成分，并通過文獻檢索對所有藥物的有效活性成分進行完善，然后通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取化合物的2D結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入SwissADME得到其SMILES。同樣根據(jù)ADME原則進行篩選，對篩選出的化合物通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測，獲取其對應(yīng)靶點。

1.2藥效成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建四神煎-有效活性成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.7.2軟件中的“Networkanalyze”功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，篩選得出核心活性成分及潛在靶基因。

1.3疾病靶點獲取通過Genecards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/#）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫分別檢索“Knee Osteoarthritis”“Rheumatoid Arthritis”，得到KOA、RA相關(guān)疾病靶點，并將3個數(shù)據(jù)庫所得靶點分別合并、去重，再利用Uniprot數(shù)據(jù)庫匹配已驗證的人類靶點基因名。

1.4活性成分與疾病的共同靶點篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建明確KOA、RA相關(guān)靶點與藥物潛在靶點之間的相互作用，應(yīng)用R語言（https://www.r-project.org/）軟件及Perl語言程序?qū)⒓膊“悬c與藥物靶點進行交集，并輸入Venny 2.1軟件（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖。應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）分別構(gòu)建共同靶點互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI），將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，將Settings設(shè)為“high confidence：0.9”，并隱藏?zé)o關(guān)系的靶點，其他參數(shù)保持默認設(shè)置，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用Count.R插件獲得共同蛋白靶點出現(xiàn)的頻次。進一步通過Cytoscape 3.7.2軟件（https://cytoscape.org/）得到潛在靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)模型，對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析以篩選關(guān)鍵靶點。

1.5疾病-方藥-成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建疾病-方藥-成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)，以探究藥物的潛在藥理學(xué)作用機制。網(wǎng)絡(luò)圖中“node”代表方藥、疾病、活性成分和靶點，“edge”代表活性疾病-方藥-成分-靶點之間的相互關(guān)系。

1.6基因本體論（GO）生物功能分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集應(yīng)用R語言（https://www.r-project.org/）軟件中clusterProfilerGO.R包及Perl語言對活性成分與KOA、RA的共同靶點分別進行GO分析。GO分析主要用于描述基因產(chǎn)物的功能，其中包括細胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物學(xué)過程（biological process，BP）。并應(yīng)用clusterProfilerKEGG.R包進行KEGG通路富集分析，同時，利用pathview包繪制相應(yīng)的信號通路圖。根據(jù)富集因子值分析核心通路富集程度，探究四神煎治療KOA、RA可能的生物功能及信號通路機制。

1.7分子對接驗證為探究前期網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的按照度值排列前4位的有效活性成分槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F與KOA、RA相關(guān)核心蛋白MAPK14、EGFR、MAPK8之間的互作關(guān)系，對二者進行分子對接驗證。從PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載有效活性成分的結(jié)構(gòu)式，利用Chem 3D軟件制作相應(yīng)的3D結(jié)構(gòu)，并輸出為mol*2格式，再從PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）下載核心蛋白結(jié)構(gòu)域的pdb格式，利用PyMOL軟件對蛋白質(zhì)進行去水、去磷酸根等操作。利用AutoDockTools 1.5.6軟件將藥物活性成分及核心蛋白基因文件pdb格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式并尋找活性口袋，最后運行Vina腳本進行分子結(jié)合能計算以及分子對接結(jié)果展示。同時運行Discovery Studio（DS）2019尋找對接位點并計算柔性結(jié)合的LibDockScore，將輸出的分子對接結(jié)果導(dǎo)入PyMOL軟件進行分子對接構(gòu)象展示。若結(jié)合能小于0說明配體與受體可自發(fā)結(jié)合，當(dāng)Vina結(jié)合能≤-5.0 kcal·mol-1以及LibDockScore＞100，說明兩者形成穩(wěn)定對接。對配體-受體復(fù)合物進行分子對接結(jié)果3D展示，以評價生物信息分析預(yù)測的可靠性。

2 結(jié)果

2.1藥物有效成分和對應(yīng)靶點及其互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、BATM-TCM數(shù)據(jù)庫、HERB數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn/）以及文獻檢索，經(jīng)ADME原則篩選后獲得四神煎有效成分67種，其中共有成分4種。黃芪、金銀花、牛膝、石斛、遠志有效成分分別為16、17、18、11、11種，黃芪、金銀花、牛膝共有成分2種，金銀花、牛膝共有成分2種。結(jié)合SwissTargetPrediction，得到藥物靶點230個。采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建四神煎-有效活性成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)，共獲得303個節(jié)點（其中靶點156個，活性成分67個），1 000條邊，結(jié)果見圖1。

圖1 四神煎-有效活性成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Sishen Jian-active component-target interaction network

2.2疾病靶點篩選通過檢索GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫分別得到KOA、RA的相關(guān)靶點2 116、5 088個，分別去重后，共獲得KOA疾病靶點2 110個，RA疾病靶點5 058個。

2.3共同靶點篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建得到的230個四神煎藥物活性成分靶點與2 110個KOA相關(guān)疾病靶點、5 058個RA疾病相關(guān)靶點分別導(dǎo)入在線韋恩圖制作網(wǎng)站InteractiVenn，相匹配映射得到中藥治療KOA的潛在作用靶點115個，治療RA的潛在作用靶點147個。將治療KOA、RA的潛在靶基因?qū)隨TRING在線分析網(wǎng)站（https://string-db.org/），設(shè)置隱藏未連接的靶點，設(shè)定最低互作評分中的“highest confidence>0.900”，并導(dǎo)出PPI結(jié)果數(shù)據(jù)。進一步通過Cytoscape 3.7.2軟件分別得到治療KOA、RA潛在靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)模型，運用其中的cytoHubba插件篩選Hub基因，使用Degree算法，得出排名前20位的潛在核心靶基因，通過CytoNCA插件分析網(wǎng)絡(luò)并限定Degree、BC、CC、NC、LAC值均大于等于中位數(shù)，得到PPI核心網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖2。

圖2 四神煎治療膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的PPI核心網(wǎng)絡(luò)Figure 2 PPI core network of Sishen Jian in treating KOA and RA

2.4疾病-方藥-成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建采用Cytoscape 3.7.2軟件在構(gòu)建KOA/RA-四神煎-成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)，共獲得214個節(jié)點（其中靶點156個，活性成分55個），909條邊，結(jié)果見圖3。

圖3 膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）/類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）-四神煎-成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Interaction network of KOA/RA-Sishen Jian-component-target

2.5藥物治療KOA、RA的生物功能（GO）分析及核心通路篩選運用R語言中的Bioconductor包、clusterProfiler包分別對中藥治療KOA的115個潛在作用靶點、治療RA的147個潛在作用靶點進行GO和KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示：治療KOA的115個潛在靶基因GO分析可見其主要富集于DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、內(nèi)肽酶活性等；治療RA的147個潛在作用靶點GO分析可見其主要富集于DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣白連接酶結(jié)合等。見圖4。而KOA的潛在作用靶點KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)其主要集中于脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、化學(xué)致癌作用-受體激活、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等信號通路、TNF信號通路，RA的潛在作用靶點KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)其主要集中于脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、化學(xué)致癌作用-受體激活、PI3K-Akt信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、MAPK信號通路，見圖5。

圖4 GO功能分析氣泡圖Figure 4 Bubble diagram of GO function analysis

注：A.膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）；B.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）

2.6分子對接結(jié)果表1結(jié)果顯示：槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F與蛋白MAPK14、EGFR、MAPK8形成穩(wěn)定對接，其結(jié)合能均低于-5.0 kcal·mol-1（其中石斛苷F與蛋白MAPK14結(jié)合能大于-5.0 kcal·mol-1）。有效活性成分槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F分別與核心蛋白MAPK14、EGFR、MAPK8的受體-配體進行柔性對接，結(jié)果顯示，DS軟件均能找到對接位點且MAPK14與槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F，EGFR與石斛苷F，MAPK8與槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F形成的對接模型LibDockScore均大于100，其余均小于100。綜合分析發(fā)現(xiàn)，核心蛋白MAPK14與山柰酚，EGFR與石斛苷F，MAPK8與槲皮素形成最穩(wěn)定的對接模型。由于蛋白MAPK14、EGFR、MAPK8與不同活性成分在不同氨基酸位點形成不同的氫鍵及疏水鍵聯(lián)系，因此彼此，形成不一樣的對接體。最后，利用Vina輸出的化合物結(jié)果導(dǎo)入Pymol中以及利用Discovery Studio 2019軟件，與蛋白配體進行三維分子對接展示，見圖6。

圖6 分子對接3D模型Figure 6 3D model of molecular docking

表1 分子對接Vina、Discovery Studio 2019結(jié)果Table 1 Molecular docking results of Vina and discovery studio 2019

3 討論

“異病同治”源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，確立于《傷寒雜病論》，至今仍指導(dǎo)著中醫(yī)臨床診斷及治療。根據(jù)KOA、RA的臨床表現(xiàn)，當(dāng)歸屬于中醫(yī)學(xué)之“骨痹”“尪痹”的范疇，其主要病因病機為素體虧虛，復(fù)加外感風(fēng)、寒、濕、熱之邪而致經(jīng)脈阻塞、氣血不暢，氣血痰濕壅滯于關(guān)節(jié)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹疼痛[5]。相關(guān)研究表明，OA與RA可能存在共同發(fā)病的機制，且受共同的因子調(diào)節(jié)（如TC蛋白、線粒體等）[6-8]。另外，最近研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可能通過調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律進而緩解關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)[9]?；诖?，KOA與RA的中醫(yī)證候和西醫(yī)發(fā)病機制均有共通點，采用相同方藥進行治療有其理論依據(jù)與現(xiàn)實意義，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接對其進行分析和驗證。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，篩選出67種四神煎藥物活性成分，共預(yù)測獲得四神煎治療KOA的潛在作用靶點115個，治療RA的潛在作用靶點147個，經(jīng)共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)拓撲分析方法篩選出關(guān)鍵靶點和核心網(wǎng)絡(luò)，最終獲得四神煎治療KOA的關(guān)鍵靶點有：MAPK8、MAPK14、EGFR、CCND1、IL6、VEGFA、IGF2；治療RA的關(guān)鍵靶點有：RELA、EGFR、MAPK8、CCND1、IL6、FOS、MAPK14、CTNNB1。其 中MAPK8、MAPK14、EGFR、CCND1、IL6是四神煎治療2種疾病共有的關(guān)鍵靶點。MAPK8和MAPK14屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，MAPK主要涉及癌癥和炎癥類疾病。目前，關(guān)于MAPK和RA的研究較為充分，MAPK不僅能調(diào)節(jié)促炎細胞因子在關(guān)節(jié)組織中的產(chǎn)生，而且在IL-1、IL-17和TNF-α受體下游的信號級聯(lián)中發(fā)揮重要作用[10]。JNK MAPKs還能通過基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）介導(dǎo)的軟骨破壞導(dǎo)致RA的發(fā)生[11]，p38MAPK可調(diào)節(jié)IL-17信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以及促炎細胞因子和介質(zhì)的釋放[12]。EGFR同樣在RA的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，研究顯示，EGFR信號的激活是RA中滑膜成纖維細胞增殖的原因。EGFR及其配體還可以在RA發(fā)病機制期間誘導(dǎo)滑膜成纖維細胞的細胞因子產(chǎn)生[13]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，RA與血清EGFR蛋白的水平升高有關(guān)[14]。CCND1屬于細胞周期蛋白家族，CCND1是Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白，Wnt通路在RA的發(fā)病機制中起著重要作用，該信號通路的激活可導(dǎo)致滑膜細胞增殖，促進滑膜增生，導(dǎo)致骨損傷，破壞關(guān)節(jié)功能[15]。同時，Wnt通路還可以通過調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的平衡來調(diào)節(jié)骨形成[16]。IL-6參與的炎癥途徑也是RA發(fā)生和進展的部分原因，IL-6在破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收中起著至關(guān)重要的作用，這些過程有助于IgM和IgG類風(fēng)濕因子以及瓜氨酸肽抗體的產(chǎn)生，瓜氨酸肽抗體在RA中特征性增加[17]。靶向IL-6治療RA已被證明是有效的，多種IL-6靶向藥物已應(yīng)用于臨床或處于研發(fā)階段[18]。綜上可知，這些關(guān)鍵靶點與KOA和RA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

GO富集分析結(jié)果顯示，四神煎對KOA的作用靶點主要通過調(diào)節(jié)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、內(nèi)肽酶活性等過程，對RA的作用靶點主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等過程。

KEGG通路分析結(jié)果顯示，四神煎治療KOA的潛在作用靶點主要富集于TNF信號通路。該通路是參與全身炎癥反應(yīng)的重要通路之一，TNF信號通路的關(guān)鍵分子TNF-α在關(guān)節(jié)細胞的代謝調(diào)節(jié)中是主要參與者[19]。文獻研究結(jié)果顯示，TNF-α與KOA、RA疾病的進展密切相關(guān)，TNF-α對于KOA、RA具有重要的疾病預(yù)測價值[20-22]。四神煎治療RA的潛在作用靶點主要富集于PI3K/AKT信號通路。文獻顯示，PI3K/AKT通路在軟骨細胞增殖、凋亡和基質(zhì)重塑中起重要作用，與KOA的發(fā)生有密切聯(lián)系[23]。PI3K/AKT信號通路不僅參與滑膜成纖維細胞的異常增殖和滑膜炎癥，還影響破骨細胞的分化和生成。破骨細胞通過PI3K/AKT信號通路遷移、破壞骨骼和關(guān)節(jié)軟骨，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，加重RA的發(fā)展[24-25]。

本研究根據(jù)“疾病-方藥-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)分析得到前4個核心活性成分槲皮素、山柰酚、石斛苷G以及石斛苷F與核心靶點MAPK14、EGFR、MAPK8進行結(jié)合能力預(yù)測。分子對接結(jié)果顯示，核心蛋白MAPK14與山柰酚，EGFR與石斛苷F，MAPK8與槲皮素形成最穩(wěn)定的對接模型。槲皮素是一種天然抗氧化劑，具有淬滅自由基保護細胞免受損害的作用[26]。研究顯示，槲皮素具有抗關(guān)節(jié)炎的作用，其機制可能涉及抑制氧化應(yīng)激、細胞因子和COX-2的產(chǎn)生、蛋白多糖的降解以及多個相關(guān)信號通路的激活[27]。山柰酚是一種黃酮類化合物，具有抗癌、抗炎、抗氧化等作用，其可通過下調(diào)miR-146a激活PI3K/AKT信號通路，抑制促炎因子的釋放，發(fā)揮抗骨關(guān)節(jié)炎的作用[28]。石斛苷G和石斛苷F屬于萜類成分，就目前研究來看，尚缺乏這2種成分抗關(guān)節(jié)炎的藥理學(xué)機制研究，本研究也為將來石斛苷G和石斛苷F抗關(guān)節(jié)炎的機制研究提供了參考。

綜上所述，四神煎中存在槲皮素、山柰酚、石斛苷G、石斛苷F等活性成分，這些成分可作用于MAPK8、MAPK14、EGFR、CCND1、IL6等靶點對KOA和RA進行干預(yù)，其主要機制可能涉及TNF信號通路、PI3K/AKT通路等。同時，關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點能形成較為穩(wěn)定的對接模型，這為四神煎的臨床應(yīng)用及后續(xù)實驗研究提供了參考依據(jù)。另外，本研究尚存在一些局限性：首先，本研究是建立在“成分-靶標(biāo)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的分析，僅限于對四神煎整體機制的預(yù)測，仍無法確定不同配比、人體代謝前后組分中藥含量、成分種類差異等；其次，由于篩選條件限制，研究中分析的是四神煎的主要成分及靶點，或許不能全面覆蓋具有實質(zhì)作用的成分；最后，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)雖能獲得大量靶點與機制，但國內(nèi)相關(guān)動物實驗研究較少，仍需結(jié)合實驗進一步驗證。