柔肝通絡(luò)湯上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子及其受體表達(dá)對(duì)缺血性腦卒中大鼠腦皮質(zhì)血管再生、神經(jīng)元損傷的影響

楊秋怡， 王琪， 馬博

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

缺血性腦卒中（ischemic stroke）是常見的腦血管疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，現(xiàn)階段不同年齡段人群中的發(fā)病率越來越高，但治療腦卒中疾病的藥物開發(fā)卻稍顯緩慢[1]，因此，尋找和探索有效的腦卒中防治藥物和方法具有重要的研究意義。缺血性腦卒中歸屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”范疇。本課題組前期應(yīng)用具有滋陰活血通絡(luò)功效的柔肝通絡(luò)湯臨床治療缺血性腦卒中取得良好療效，但其作用機(jī)制尚不明確。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族是一類血管調(diào)節(jié)因子，在維護(hù)腦卒中神經(jīng)血管單元穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2-3]。因此，本研究構(gòu)建缺血性腦卒中大鼠模型，采用柔肝通絡(luò)湯進(jìn)行干預(yù)，以VEGF為切入點(diǎn)，觀察柔肝通絡(luò)湯對(duì)缺血性腦卒中模型大鼠腦皮質(zhì)血管再生、神經(jīng)元損傷的影響，探討柔肝通絡(luò)湯的干預(yù)靶點(diǎn)，以期為其臨床進(jìn)一步應(yīng)用治療腦卒中提供理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取SPF級(jí)健康雄性SD大鼠60只，4~6月齡，體質(zhì)量140~250 g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2022-0002，粵監(jiān)證字2006A017。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（津）2020-00010]完成，室溫15~20℃，濕度約為70%，每日12 h光照，喂養(yǎng)條件為自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)方案已經(jīng)我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2藥物、試劑與儀器所有中藥材由廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院提供；阿司匹林片（四川新輝煌動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：獸藥字220771192）；兔抗VEGF單克隆抗體、兔抗血管內(nèi)皮生長因子受體1（VEGFR1）單克隆抗體、兔抗血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）單克隆抗體，辣根過氧化酶標(biāo)記抗兔IgG，血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（CD31）（北京中杉金橋公司）；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒（上海生物工程有限公司）；蛋白定量試劑盒（美國Bio-Rad公司）。XSZ-5B切片機(jī)（重慶光學(xué)儀器廠）；光學(xué)顯微鏡（桂林中輝科技發(fā)展有限公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。

1.3柔肝通絡(luò)湯制備柔肝通絡(luò)湯組成：制首烏15 g、桑椹15 g、枸杞子30 g、丹參30 g、葛根30 g、當(dāng)歸尾10 g、赤芍10 g、地龍10 g、山楂15 g。一煎加水500 mL，煎汁150 mL，二煎加水300 mL，煎汁150 mL，取2次煎汁混合后文火煎制成膏狀（含生藥2 g/mL），冷藏備用。

1.4建模選取50只大鼠參照文獻(xiàn)方法[4]采用Zea-Longa線栓法構(gòu)建缺血性腦卒中模型。2%戊巴比妥鈉麻醉注射后，使用3%恩氟烷混合70%N2O和30%O2維持麻醉，術(shù)中對(duì)大鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈進(jìn)行分離處理，使用尼龍縫合線從大鼠的頸外動(dòng)脈側(cè)端插入，由頸內(nèi)動(dòng)脈至距離頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉口位置1.5 cm處停止該操作再穿入Willis環(huán)，阻斷右側(cè)大腦中動(dòng)脈血供約1 h后將栓子拔出。術(shù)后控制大鼠體溫在37℃左右。將大鼠尾部提起后左側(cè)前肢表現(xiàn)為屈曲，則判斷造模成功。

1.5分組與給藥將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、柔肝通絡(luò)湯低劑量組、柔肝通絡(luò)湯中劑量組、柔肝通絡(luò)湯高劑量組、阿司匹林組，每組各10只。將剩余的10只大鼠設(shè)為正常組。柔肝通絡(luò)湯低、中、高劑量組分別給予5.0、10.0、20.0 g/kg（相當(dāng)于50.0 kg成人等效劑量的0.5、1、2倍）柔肝通絡(luò)湯膏劑的生理鹽水溶液灌胃，阿司匹林組給予20.0 mg/kg阿司匹林生理鹽水混懸液灌胃，正常組與模型組給予生理鹽水15.0 mL/kg灌胃。每日1次，連續(xù)14 d。

1.6觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 Bederson法評(píng)定大鼠神經(jīng)功能缺損情況 將大鼠尾巴提起并高于桌面部分，正常大鼠前爪伸向桌面，腦卒中大鼠對(duì)側(cè)前肢屈曲。將大鼠放在利于爪子抓牢且有彈性的記錄紙上，將其尾部提起并用手輕推大鼠肩部，直至前肢滑動(dòng)幾厘米為宜，并在不同方向重復(fù)，正常及輕度神經(jīng)功能障礙大鼠會(huì)在不同方向以相同的力量抵抗推力。

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]：神經(jīng)功能健全為0分，前肢出現(xiàn)提尾懸空且不伴有其他不正?，F(xiàn)象為1分，側(cè)推抵抗力下降并伴前肢屈曲和無轉(zhuǎn)圈行為2分，同2分行為并伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)為3分。得分越高表示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.6.2 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察腦組織病理變化 取腦去除嗅球及小腦部分后冷凍固定，石蠟包埋，冠狀切片（厚度為4 μm）。脫水后進(jìn)行蘇木素、伊紅染色，烘干后用中性樹脂封片。顯微鏡下觀察后拍照。

1.6.3 TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 取腦皮質(zhì)石蠟切片，脫蠟后按照說明書操作。顯微鏡下觀察，TUNEL陽性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色顆粒。計(jì)算神經(jīng)元凋亡指數(shù)：陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦皮質(zhì)CD31表達(dá)取腦皮質(zhì)石蠟切片（厚度4 μm），常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化；加3%H2O2去離子水孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗；加一抗CD31（1∶2 000稀釋）37℃孵育1 h，PBS沖洗；加二抗（1∶2 000稀釋）37℃孵育30 min，PBS沖洗；DAB顯色，鏡下觀察染色，終止反應(yīng)，清水沖洗5 min；蘇木素淡染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選5個(gè)不重復(fù)的高倍鏡視野，應(yīng)用Motic Images Advanced軟件進(jìn)行分析，計(jì)算CD31陽性細(xì)胞（呈棕色顆粒）面積百分比。

1.6.5 Western Blot法檢測(cè)腦皮質(zhì)VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá) 取腦皮質(zhì)裂解、離心取上清，BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白含量。取總蛋白20 μg，高溫變性，加樣，15%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白，濃縮膠所用電壓為80 V 30 min，分離膠電壓120 V 1 h，半干轉(zhuǎn)膜（VEGF轉(zhuǎn)膜40 min，VEGFR2轉(zhuǎn)膜15 min，VEGFR1轉(zhuǎn)膜15 min）。5%脫脂奶粉封閉1 h后，一抗VEGF（1∶1 000稀 釋）、VEGFR1（1∶1 500稀釋）、VEGFR2（1∶1 500稀釋）、β-actin（1∶2 000稀釋）4℃孵育過夜。次日，TBST液洗膜3次，每次10 min，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，超敏化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑顯色，曝光。最后應(yīng)用ImageJ軟件分析條帶灰度值，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值表示。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能明顯損傷。治療7、14 d后，與模型組比較，柔肝通絡(luò)湯低、中、高劑量組和阿司匹林組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分降低，其中，除柔肝通絡(luò)湯低劑量組，其他各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而與阿司匹林組比較，柔肝通絡(luò)湯高劑量組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分降低（P＜0.05）。給藥14 d后，各治療組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分均低于給藥7 d后，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較Figure 1 Comparison of neurological impairment scores among various groups of rats （±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較Figure 1 Comparison of neurological impairment scores among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組同時(shí)間點(diǎn)比較；②P＜0.05，與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較；③P＜0.05，與阿司匹林組同時(shí)間點(diǎn)比較

?

2.2各組大鼠腦組織病理形態(tài)比較圖1結(jié)果顯示：正常組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)無異常，細(xì)胞排列整齊，無水腫及壞死現(xiàn)象；模型組及柔肝通絡(luò)湯低劑量組大鼠腦組織有壞死空洞、水腫形成，且組織結(jié)構(gòu)紊亂、形態(tài)異常，炎癥細(xì)胞浸潤明顯；柔肝通絡(luò)湯中劑量組及阿司匹林組大鼠腦組織細(xì)胞腫脹現(xiàn)象較模型組有所減輕，炎癥細(xì)胞浸潤稍減輕，但仍伴有部分水腫現(xiàn)象；柔肝通絡(luò)湯高劑量組大鼠腦組織病灶范圍較模型組縮小，水腫明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少。

圖1 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果（×400）Figure 1 HE staining results of brain tissue in various groups of rats（×400）

2.3各組大鼠神經(jīng)元凋亡情況比較表2、圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠神經(jīng)元凋亡指數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組比較，柔肝通絡(luò)湯低、中、高劑量組和阿司匹林組大鼠神經(jīng)元凋亡指數(shù)降低，其中，除柔肝通絡(luò)湯低劑量組，其他各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與阿司匹林組比較，柔肝通絡(luò)湯高劑量組大鼠神經(jīng)元凋亡指數(shù)降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠神經(jīng)元TUNEL染色結(jié)果Figure 2 Results of TUNEL staining of neurons in various groups of rats（×200）

表2 各組大鼠神經(jīng)元凋亡指數(shù)比較Table 2 Comparison of neuronal apoptosis indices among various groups of rats （±s）

表2 各組大鼠神經(jīng)元凋亡指數(shù)比較Table 2 Comparison of neuronal apoptosis indices among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

?

2.4各組大鼠腦皮質(zhì)中CD31陽性表達(dá)比較表3、圖3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)中CD31陽性表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，柔肝通絡(luò)湯低、中、高劑量組和阿司匹林組大鼠腦皮質(zhì)中CD31陽性表達(dá)水平更高，其中，除柔肝通絡(luò)湯低劑量組，其他各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與阿司匹林組比較，柔肝通絡(luò)湯高劑量組大鼠腦皮質(zhì)中CD31陽性表達(dá)水平升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠腦皮質(zhì)血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（CD31）免疫組織化學(xué)結(jié)果Figure 3 Immunohistochemical results of CD31 in brain cortex of each group of rats（×200）

表3 各組大鼠腦皮質(zhì)中血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（CD31）陽性表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of CD31 positive expression level in the cerebral cortex among various groups of rats（±s）

表3 各組大鼠腦皮質(zhì)中血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（CD31）陽性表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of CD31 positive expression level in the cerebral cortex among various groups of rats（±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

?

2.5各組大鼠腦皮質(zhì)中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)比較表4、圖4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠腦皮質(zhì)中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，柔肝通絡(luò)湯中、高劑量組和阿司匹林組大鼠腦皮質(zhì)中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與阿司匹林組比較，柔肝通絡(luò)湯高劑量組大鼠腦皮質(zhì)中VEGF、VEGFR1、VEGFR2表達(dá)水平均升高（P＜0.05）。

圖4 各組腦皮質(zhì)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）1、VEGFR2蛋白電泳圖Figure 4 Electrophoretogram of VEGF，VEGFR1 and VEGFR2 proteins in cerebral cortex in various groups

表4 各組大鼠腦皮質(zhì)中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）1、VEGFR2蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of protein expressions of VEGF，VEGFR1 and VEGFR2 in cerebral cortex among various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠腦皮質(zhì)中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）1、VEGFR2蛋白表達(dá)比較Table 4 Comparison of protein expressions of VEGF，VEGFR1 and VEGFR2 in cerebral cortex among various groups of rats （±s）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與阿司匹林組比較

?

3 討論

神經(jīng)血管單元（neurovascular unit）概念的提出，為治療缺血性腦卒中提供了新靶點(diǎn)，即應(yīng)針對(duì)包括神經(jīng)元、微循環(huán)及神經(jīng)膠質(zhì)在內(nèi)的整體進(jìn)行治療，彌補(bǔ)以往單一針對(duì)神經(jīng)元或血管治療的局限性[6]。而中醫(yī)藥基于“整體觀”特色理論可通過多層次、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)作用于相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)的作用[7]。

腦卒中時(shí)因引起海馬區(qū)神經(jīng)元損傷可造成相關(guān)神經(jīng)功能的損害[8]。腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的破壞程度與神經(jīng)元損傷程度具有相關(guān)性[9]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)柔肝通絡(luò)湯干預(yù)后，缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分降低，表明柔肝通絡(luò)湯可改善缺血性腦卒中引起的神經(jīng)功能受損，重塑神經(jīng)功能。

當(dāng)腦卒中發(fā)生時(shí)，腦內(nèi)的神經(jīng)元常表現(xiàn)為不可逆性壞死，且靠近核心區(qū)的半暗帶內(nèi)的神經(jīng)元因能量代謝障礙通常以凋亡形式走向死亡[10-12]。因此，遏止壞死區(qū)域的擴(kuò)大、挽救半暗帶、抑制細(xì)胞凋亡是臨床腦保護(hù)及腦治療的主要靶點(diǎn)。腦卒中病灶邊緣區(qū)域是神經(jīng)元凋亡發(fā)生最多的區(qū)域，存有大量處于休眠或半休眠狀態(tài)的可逆性神經(jīng)元，若治療及時(shí)，神經(jīng)元可向正常組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，反之則會(huì)影響病情的發(fā)生發(fā)展[13]。本研究結(jié)果顯示，柔肝通絡(luò)湯組大鼠的腦神經(jīng)元凋亡指數(shù)較模型組顯著降低，表明柔肝通絡(luò)湯可抑制神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（CD31）是主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞中的一種糖蛋白，可作為血管生成標(biāo)志物，在腦損傷疾病中可用于評(píng)價(jià)微血管密度，反映血管新生情況[14]。本研究結(jié)果顯示，柔肝通絡(luò)湯組大鼠腦皮質(zhì)中CD31陽性表達(dá)水平顯著高于模型組，表明柔肝通絡(luò)湯可促進(jìn)缺血性腦卒中大鼠腦皮質(zhì)血管再生。

相關(guān)研究表明，腦卒中發(fā)生時(shí)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其相關(guān)受體在誘導(dǎo)基因、蛋白的表達(dá)和調(diào)節(jié)血管通透性、腦皮質(zhì)血管再生以及神經(jīng)元損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。VEGF被認(rèn)為是最有效的促進(jìn)血管新生因子，可與其相關(guān)因子結(jié)合，在促進(jìn)血管內(nèi)皮存活、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、增加血管通透性及促進(jìn)血管新生等方面發(fā)揮重要作用[15-16]。VEGF對(duì)神經(jīng)元的營養(yǎng)和保護(hù)發(fā)揮越來越重要的作用，VEGF與VEGFR1、VEGFR2結(jié)合可促進(jìn)缺血腦組織神經(jīng)元的生長和存活[17-18]。本研究結(jié)果顯示，柔肝通絡(luò)湯組大鼠腦皮質(zhì)中VEGF、VEGFR1、VEGFR2蛋白表達(dá)水平較模型組升高，表明柔肝通絡(luò)湯可上調(diào)缺血性腦卒中大鼠腦皮質(zhì)VEGF及其受體的表達(dá)。

綜上所述，柔肝通絡(luò)湯可有效改善缺血性腦卒中大鼠腦組織病理學(xué)改變及神經(jīng)功能損害，其機(jī)制可能與上調(diào)腦皮質(zhì)VEGF及其受體的表達(dá)促進(jìn)血管再生、抑制腦神經(jīng)元凋亡有關(guān)。