低溫暫養(yǎng)對(duì)珍珠龍膽石斑魚存活、非特異性免疫及抗氧化指標(biāo)的影響

袁仲瑾 ，岑劍偉, ，李來(lái)好，楊賢慶，黃 卉，魏 涯，郝淑賢，趙永強(qiáng)，王悅齊，林 織

1. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306

2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

3. 大連工業(yè)大學(xué)/海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034

4. 廣東順欣海洋漁業(yè)集團(tuán)有限公司，廣東 陽(yáng)江 529800

珍珠龍膽石斑魚 (Epinephelus fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus ♂) 是名貴的暖水性經(jīng)濟(jì)海水魚類，在商品魚市場(chǎng)主要以鮮銷為主，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益[1]。石斑魚背鰭發(fā)達(dá)，在運(yùn)輸環(huán)節(jié)易對(duì)操作者和魚體造成損傷，且在魚體捕撈起塘后如無(wú)適合的暫養(yǎng)條件容易使魚體產(chǎn)生劇烈的應(yīng)激反應(yīng)，使其組織和器官產(chǎn)生應(yīng)答機(jī)制，引發(fā)生理功能紊亂，導(dǎo)致魚體病原感染、組織受損甚至死亡[2]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。應(yīng)激反應(yīng)還會(huì)增加魚體氨類代謝物質(zhì)的排放量，加速氨氮等有毒物質(zhì)在水中的富集，使魚類成活率進(jìn)一步降低。因此，研究珍珠龍膽石斑魚在?；盍魍ㄖ械年P(guān)鍵技術(shù)對(duì)于提高其經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。

低溫?；钍窃谒锼m溫度范圍內(nèi)盡可能地將溫度控制在最低水平，降低水生生物對(duì)外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)度，從而延長(zhǎng)?；顣r(shí)間。低溫?；罴夹g(shù)已在大菱鲆 (Scophthalmus maximus)、大口黑鱸 (Micropterus salmoides)、彭澤鯽 (Carassius auratus) 及凡納濱對(duì)蝦 (Litopenaeus vannamei) 等水產(chǎn)品中進(jìn)行了廣泛的研究與應(yīng)用[3-6]。然而，不同種類的魚對(duì)低溫的敏感性不同，過低的溫度會(huì)引發(fā)機(jī)體內(nèi)部組織器官的氧化損傷，從而降低魚體的生存能力[7]。暖水性魚類比溫水性魚類對(duì)低溫的耐受性低，攀鱸 (Anabas testudineus) 的死亡低溫范圍為 9.4～13.5 ℃[8]，小黃魚 (Larimichthys polyactis) 的起始致死溫度為6 ℃[9]，點(diǎn)籃子魚 (Siganus guttatus) 的死亡臨界溫度為11.69～15.39 ℃[10]。本研究通過分析珍珠龍膽石斑魚在不同暫養(yǎng)溫度下的行為特征、成活率、物質(zhì)代謝、非特異性免疫和抗氧化能力的變化，探討其合適的長(zhǎng)時(shí)暫養(yǎng)溫度，為珍珠龍膽石斑魚的?；盍魍ㄌ峁├碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鮮活的珍珠龍膽石斑魚 [體質(zhì)量 (550±43) g] 購(gòu)于廣州融漁科技有限公司，養(yǎng)殖水溫23～25 ℃。將購(gòu)回的石斑魚置于暫養(yǎng)池中，暫養(yǎng)6 h以消除短途運(yùn)輸造成的應(yīng)激反應(yīng)，之后用于試驗(yàn)。暫養(yǎng)條件：魚、水質(zhì)量比為1∶20，水溫23～24 ℃，鹽度25‰～26‰，暫養(yǎng)期間使用水循環(huán)系統(tǒng)循環(huán)過濾海水，空氣泵24 h供氧，保證水體溶解氧質(zhì)量濃度>7 mg·L?1。

1.2 主要試劑和儀器

1 000 μg·mL?1氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液 (GSB 04-2832-2011，國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心)；水質(zhì)氨氮環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)樣品 (批號(hào)：2005120、2005122，環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所)；濃鹽酸 (優(yōu)級(jí)純，廣州化學(xué)試劑廠)；濃硫酸、無(wú)水乙醇 (分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；溴酸鉀、溴化鉀以及氫氧化鈉 (分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；溶菌酶 (LZM)、補(bǔ)體蛋白3 (C3) 檢測(cè)試劑盒 (上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 (上海碧云天生物科技有限公司)；超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GPx) 及丙二醛 (MDA) 測(cè)定試劑盒 (南京建成科技有限公司)。

Multi 3630 IDS便攜式多參數(shù)測(cè)量?jī)x (德國(guó)WTW公司)；AJ-300氣相分子吸收光譜儀 (上海安杰環(huán)?？萍脊煞萦邢薰?；BS-800M全自動(dòng)生化分析儀 (深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；UV2550紫外可見分光光度計(jì) (日本島津公司)；Bio-Tek全自動(dòng)酶標(biāo)儀 (上海Bio-Tek公司)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) (湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)；SPX型智能生化培養(yǎng)箱 (寧波江南儀器廠)；KD-2AS風(fēng)冷式冷水機(jī) (廣州市澳鑫設(shè)備科技有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 行為學(xué)試驗(yàn)

使用循環(huán)冷水機(jī)以0.5～1.0 ℃·h?1的速率緩慢降低珍珠龍膽石斑魚的暫養(yǎng)水體溫度，觀察單位時(shí)間內(nèi)鰓蓋張合的次數(shù)，以其作為魚的呼吸頻率，記錄不同溫度下每尾石斑魚的行為特征和呼吸頻率。每次試驗(yàn)6尾魚，試驗(yàn)重復(fù)3次，共觀察18尾魚。

1.3.2 ?；钐幚?/p>

珍珠龍膽石斑魚使用循環(huán)冷水機(jī)以0.5～1.0 ℃·h?1的速率分別緩慢降溫至 14、16、18、20、24 ℃進(jìn)行禁食暫養(yǎng)試驗(yàn)，期間魚、水質(zhì)量比為1∶10。每個(gè)溫度組3個(gè)平行，每個(gè)平行6尾魚。每6 h觀察一次魚體的狀態(tài)，以魚體轉(zhuǎn)移至常溫狀態(tài)5 min內(nèi)對(duì)外界刺激仍無(wú)反應(yīng)視為死亡，記錄不同溫度下魚體的存活時(shí)間。

珍珠龍膽石斑魚使用循環(huán)冷水機(jī)以0.5～1.0℃·h?1的速率分別緩慢降溫至 16、18、20、24 ℃后禁食暫養(yǎng)48 h，以在23～24 ℃暫養(yǎng)池中暫養(yǎng)6 h后的新鮮魚體為對(duì)照組，各溫度組和對(duì)照組均設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行3尾魚。取各組中魚體的血液和肝臟作為樣品用于后續(xù)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3.3 水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)組保活0、24、48、72 h后各取100 mL水樣于100 mL聚乙烯瓶中。使用多參數(shù)水質(zhì)分析儀測(cè)定水樣電導(dǎo)率和pH。

水體中總氨氮測(cè)定參考金慧等[11]的方法。水樣采集后加硫酸調(diào)節(jié)pH為1～3，加蓋密封后搖勻，移取45 mL搖勻的樣品至50 mL樣品管中，將樣品管置于氣相分子吸收光譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器的進(jìn)樣盤上，進(jìn)行樣品的測(cè)定。儀器參數(shù)設(shè)定為：氘燈電流50.00 mA；測(cè)定波長(zhǎng)213.90 nm；載氣流量0.197 L·min?1；載氣為空氣；加熱系統(tǒng) 87.5 ℃；制冷系統(tǒng) 1.8 ℃；樣品泵速 80 r·min?1；試劑泵速45 r·min?1；氧化泵速 35 r·min?1。

1.3.4 非特異性免疫指標(biāo)測(cè)定

將魚體從?；钕渲袚瞥鼋?jīng)二氧化碳麻醉后 [水體通入二氧化碳達(dá)到飽和濃度，魚體處于A4麻醉期 (沉在底部，尾部停止擺動(dòng)，鰓蓋張合停止時(shí))][12]，使用1 mL一次性醫(yī)用注射器從尾部靜脈取血注入無(wú)抗凝劑的采血管中，血樣在37 ℃生化培養(yǎng)箱中放置 2 h，4 ℃ 冰箱放置過夜后，4 ℃、3 000 r·min?1離心20 min制備血清，血清分裝后移入?80 ℃保存?zhèn)溆?。每尾魚取500 μL血清使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)、堿性磷酸酶 (AKP)、肌酸激酶 (CK)、白蛋白(ALB)、球蛋白 (GLB) 和總蛋白 (TP)。其中，ALT、AST、AKP和CK活性的測(cè)定采用速率法，ALB的測(cè)定采用溴甲酚綠法，TP的測(cè)定采用雙縮脲法，GLB質(zhì)量濃度通過計(jì)算得到。血清中LZM活性、C3質(zhì)量濃度的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行。

1.3.5 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

每尾魚收集 (2.0±0.1) g肝臟組織放入50 mL離心管中，添加9倍體積的0.86%生理鹽水，在冰上對(duì)組織進(jìn)行均質(zhì)，勻漿以4 ℃、3 000 r·min?1離心15 min，收集上清液，保存于?80 ℃待分析。肝臟組織中SOD、CAT、GPx活性與MDA濃度均采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (±SD)”表示，組間差異采用單因素方差 (One-way ANOVA) 結(jié)合鄧肯檢驗(yàn)法進(jìn)行比較分析。用Origin 2021軟件繪制相關(guān)圖表。

2 結(jié)果

2.1 降溫過程中珍珠龍膽石斑魚的行為特征

本研究采用的降溫速率為0.5～1.0 ℃·h?1，魚體呼吸頻率及行為特征在降溫過程中的變化見表1。隨著溫度的降低，石斑魚的呼吸頻率和反應(yīng)靈敏度呈下降趨勢(shì)。溫度降至20 ℃時(shí)，石斑魚鰓蓋開合幅度明顯減弱，呼吸頻率下降至31～33 次·min?1；溫度降至16 ℃時(shí)，魚體鰓蓋開合幅度繼續(xù)減弱，魚體受到外界刺激 (如敲擊缸體) 時(shí)鰭棘會(huì)豎立，但無(wú)游動(dòng)等行為出現(xiàn)；溫度降至14 ℃時(shí)，部分魚體失去平衡左右晃動(dòng)，極少部分出現(xiàn)浮頭行為，并且體表脫落物開始增多，水體渾濁程度加重；繼續(xù)降溫至13 ℃時(shí)，魚體失去平衡、側(cè)翻于水底并伴隨著躁動(dòng)不安、爭(zhēng)向水面活動(dòng)等應(yīng)激行為；水溫降至12 ℃時(shí)，魚體因呼吸中斷出現(xiàn)裂鰓現(xiàn)象，短時(shí)間內(nèi)置于常溫水體中5 min可恢復(fù)正常游動(dòng)，若長(zhǎng)時(shí)間處于此狀態(tài)下會(huì)導(dǎo)致死亡。

表1 不同溫度下珍珠龍膽石斑魚的呼吸頻率及行為特征Table 1 Respiratory frequency and behavioral characteristics of grouper at different temperatures

2.2 暫養(yǎng)溫度對(duì)珍珠龍膽石斑魚存活時(shí)間的影響

暫養(yǎng)過程中珍珠龍膽石斑魚陸續(xù)死亡，其生存曲線見圖1，石斑魚的存活時(shí)間隨著溫度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。14 ℃組魚體的存活時(shí)間顯著低于其他溫度?；罱M，暫養(yǎng)18 h后的成活率僅為33.3%；16、18、20和24 ℃暫養(yǎng)條件下魚體的存活時(shí)間分別為109、91、83和63 h。相較于24 ℃組，低溫 (16、18 ℃) 組的魚體存活時(shí)間增加了28～46 h。

圖1 不同溫度與時(shí)間對(duì)珍珠龍膽石斑魚成活率的影響Fig. 1 Effects of different temperatures and time on survival rate of grouper

2.3 暫養(yǎng)溫度對(duì)珍珠龍膽石斑魚非特異性免疫的影響

魚類的非特異性免疫在其免疫系統(tǒng)中占據(jù)主導(dǎo)地位，受到外界刺激時(shí)，非特異性免疫中的免疫因子會(huì)發(fā)生改變以增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。因?yàn)槭唪~在14 ℃暫養(yǎng)24 h以內(nèi)全部死亡，所以魚體血清非特異性免疫指標(biāo)的測(cè)定不包括14 ℃組。

與新鮮對(duì)照組相比，16 ℃暫養(yǎng)48 h后ALT、AST、CK活性無(wú)顯著變化 (P>0.05)。在暫養(yǎng)過程中，ALT、AST和CK活性均隨溫度的升高呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì)，16、18和20 ℃組間ALT活性差異不顯著 (P>0.05)。與16 ℃組相比，24 ℃組ALT活性升高57.7%，AST活性升高323.73%，CK活性升高717.02% (圖2-a、2-b)，原因可能是魚體長(zhǎng)時(shí)間處于氨氮脅迫和饑餓脅迫的狀態(tài)，導(dǎo)致肝臟、心肌組織受損。16～20 ℃范圍內(nèi)，暫養(yǎng)前后AKP活性無(wú)顯著變化 (P>0.05)，24 ℃暫養(yǎng)48 h后AKP活性顯著升高 (P<0.05)，較16 ℃組增加了43.56%。低溫 (16、18 ℃) 組的LZM活性和暫養(yǎng)前相比無(wú)顯著差異 (P>0.05)，而20和24 ℃組中LZM活性顯著升高 (P<0.05)，且在24 ℃時(shí)達(dá)到最高，較16 ℃升高了32.72% (圖2-c、2-d)。

暫養(yǎng)過程中隨著溫度的升高，血清GLB和TP質(zhì)量濃度呈下降趨勢(shì) (圖2-e、2-f)。同新鮮對(duì)照組相比，18、20 ℃組中GLB和TP質(zhì)量濃度無(wú)顯著變化 (P>0.05)，16 ℃組中GLB和TP質(zhì)量濃度顯著上升 (P<0.05)，24 ℃組中GLB和TP質(zhì)量濃度顯著降低 (P<0.05)。C3質(zhì)量濃度僅在16 ℃組中顯著升高 (P<0.05)。

圖2 不同溫度對(duì)珍珠龍膽石斑魚非特異性免疫的影響注：柱上不同英文字母表示各組間存在顯著差異 (P<0.05)，圖3同此。Fig. 2 Effects of different temperatures on non-specific immunity of grouperNote: Different letters indicate significant difference among groups (P<0.05). The same case in Fig. 3.

2.4 暫養(yǎng)溫度對(duì)珍珠龍膽石斑魚抗氧化能力的影響

同其他組相比，16 ℃組肝臟組織中SOD活性顯著升高 (P<0.05)，18 ℃組無(wú)顯著變化 (P>0.05)，20和24 ℃組顯著降低 (P<0.05)。各組CAT活性均存在顯著差異 (P<0.05)，其中，16、18和20 ℃組的CAT活性較暫養(yǎng)前顯著升高 (P<0.05)，24 ℃組顯著降低 (P<0.05)。暫養(yǎng)48 h后GPx活性顯著下降 (P<0.05)，且在16～20 ℃范圍內(nèi)，隨著保活溫度的降低，GPx活性顯著上升(P<0.05)。肝臟組織中的MDA質(zhì)量摩爾濃度經(jīng)暫養(yǎng)后顯著升高，不同溫度組之間存在顯著差異(P<0.05)，在24 ℃組中達(dá)到最高水平，為新鮮對(duì)照組的20倍 (圖3)。

圖3 不同溫度對(duì)珍珠龍膽石斑魚抗氧化能力的影響Fig. 3 Effects of different temperatures on antioxidant capacity of grouper

2.5 暫養(yǎng)過程中水質(zhì)指標(biāo)的變化

隨著暫養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，水面漂浮的黃白色泡沫逐漸增多，水體逐漸發(fā)黃、變渾濁，水中珍珠龍膽石斑魚體表脫落物和代謝廢物增多。暫養(yǎng)過程中水體總氨氮 (TAN) 質(zhì)量濃度和電導(dǎo)率呈不斷上升的趨勢(shì)，其中24 ℃組的增速最快。在0～48 h內(nèi)，各組TAN質(zhì)量濃度增速緩慢，暫養(yǎng)時(shí)間超過48 h后，18、20和24 ℃組TAN質(zhì)量濃度迅速上升。暫養(yǎng)過程中，16 ℃組的pH無(wú)顯著變化 (P>0.05)，24 ℃組的顯著下降 (P<0.05，圖4)。

圖4 不同溫度對(duì)暫養(yǎng)過程中水質(zhì)指標(biāo)的影響注：不同英文字母表示差異顯著 (P<0.05)。Fig. 4 Effects of different temperatures on water quality indexes during acclimation processNote: Different letters indicate significant difference (P<0.05).

3 討論

3.1 不同暫養(yǎng)溫度對(duì)珍珠龍膽石斑魚成活率的影響

珍珠龍膽石斑魚是暖水性海水魚，暫養(yǎng)溫度降至14 ℃時(shí)，存活時(shí)間顯著低于其他溫度組，原因可能是低溫或者溫度驟降破壞了魚體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，其物質(zhì)代謝[13]、免疫系統(tǒng)[14]、細(xì)胞凋亡[15]、組織形態(tài)[16]、基因表達(dá)[17]等均受到影響，導(dǎo)致魚體的抵抗力下降，同時(shí)引起魚體組織內(nèi)部發(fā)生氧化損傷，從而造成魚體死亡。秦旭等[4]在研究彭澤鯽的低溫?zé)o水保活時(shí)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于休眠溫度7 ℃，14 ℃時(shí)魚體既能維持極低的耗氧量，又能通過自身調(diào)節(jié)維持正常代謝，更適合作為彭澤鯽的保活溫度。通過在暫養(yǎng)過程中實(shí)施梯度降溫誘導(dǎo)活魚進(jìn)入休眠狀態(tài)，在長(zhǎng)途?；钸\(yùn)輸過程保持與暫養(yǎng)水溫一致，使得活魚的能量代謝降低，保障長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)某苫盥?。相?duì)于24 ℃組，低溫 (16、18 ℃) 組的魚體存活時(shí)間顯著增加，16 ℃組魚體的存活時(shí)間約為24 ℃組的1.73倍。由此可見，過高或過低的溫度均不利于珍珠龍膽石斑魚的存活。

3.2 暫養(yǎng)溫度對(duì)珍珠龍膽石斑魚非特異性免疫的影響

血清轉(zhuǎn)氨酶活性被認(rèn)為是肝臟受損最敏感的指標(biāo)之一，當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性改變，胞漿中的ALT和線粒體中的AST會(huì)外滲進(jìn)入血液[18]。CK是一種細(xì)胞質(zhì)酶，在Mg2+的幫助下可逆催化ATP和磷酸肌酸之間的磷酸轉(zhuǎn)移，參與能量穩(wěn)態(tài)，以骨骼肌和心臟中含量為多。研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫對(duì)斜帶石斑魚 (E. coioides) 和荷那龍羅非魚 (Oreochromis hornorum) 的肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞造成了難以修復(fù)的損傷，導(dǎo)致血清中的AST、ALT和CK活性在脅迫期間不斷上升[19-20]。在16 ℃暫養(yǎng)48 h后ALT、AST和CK活性同暫養(yǎng)前相比無(wú)顯著變化，原因可能是低溫條件下魚體代謝水平低，外界環(huán)境中氨類代謝廢物的含量在魚體的承受閾值內(nèi)，且能較好地維持體內(nèi)能量代謝平衡。與16 ℃組相比，20、24 ℃ 組的 ALT、AST和 CK活性顯著上升，且溫度越高上升越顯著。本研究結(jié)果與大口黑鱸?；钤囼?yàn)的結(jié)果一致[21]，原因可能是魚體能量消耗和代謝速率在20和24 ℃條件下保持較高水平，導(dǎo)致水體中的有害物質(zhì)富集速度過快，且魚體在暫養(yǎng)過程中未攝取食物，只能依靠分解自身糖原和脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供生命活動(dòng)所需能量，長(zhǎng)時(shí)間的饑餓狀態(tài)和水體中高濃度的氨氮等有害物質(zhì)的刺激致使魚體能量穩(wěn)態(tài)失衡，解毒調(diào)節(jié)機(jī)制被破壞，誘發(fā)肝臟及心肌組織的損傷。

溶酶體對(duì)由免疫應(yīng)激或應(yīng)激源觸發(fā)的活性氧(ROS) 較敏感，一旦ROS過量產(chǎn)生，會(huì)增加溶酶體膜的通透性和溶酶體蛋白水解酶 (如AKP、LZM等) 的釋放[22]。24 ℃暫養(yǎng)48 h后血清中AKP和LZM活性顯著升高，原因可能是24 ℃條件下魚體代謝速率較高，ATP消耗量增多，水體中有害物質(zhì)的富集速度高于低溫組，魚體為了維持能量代謝的正常運(yùn)行、抵抗氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，加速了AKP和LZM的釋放，借此來(lái)維持內(nèi)部平衡，這與半滑舌鰨 (Cynoglossus semilaevis) 急性溫度脅迫和黃顙魚 (Pelteobagrus fulvidraco) 慢性氨氮脅迫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似[23-24]。

TP包括ALB和GLB，在調(diào)節(jié)滲透壓、運(yùn)輸代謝物質(zhì)、修復(fù)機(jī)體受損組織等方面發(fā)揮著重要作用；其中，ALB幾乎全由肝臟合成，當(dāng)肝臟組織受損或機(jī)體長(zhǎng)期處于不良狀態(tài)時(shí)，蛋白補(bǔ)償機(jī)制被破壞，導(dǎo)致ALB偏低[25-26]。同新鮮對(duì)照組相比，血清TP在18、20 ℃組中無(wú)顯著變化，表明在此溫度下魚體蛋白代謝功能在暫養(yǎng)過程中正常運(yùn)轉(zhuǎn)。16 ℃組GLB和TP顯著上升，可能是由于低溫應(yīng)激蛋白的合成導(dǎo)致血清TP質(zhì)量濃度增加。24 ℃組血清蛋白質(zhì)量濃度顯著降低，原因可能是石斑魚在此溫度下暫養(yǎng)48 h后，其肝臟組織受損，造成蛋白質(zhì)的合成受阻，且由于魚體長(zhǎng)時(shí)間處于饑餓脅迫狀態(tài)，為了滿足機(jī)體內(nèi)部功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，消耗了血清中的部分蛋白質(zhì)來(lái)提供能量。

補(bǔ)體系統(tǒng)參與機(jī)體的特異性和非特異性免疫機(jī)制，其主要作用為協(xié)助清除抗原，是免疫防御系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，C3作為補(bǔ)體系統(tǒng)的中心因子，在3種補(bǔ)體系統(tǒng)激活途徑 (即經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替補(bǔ)途徑) 中發(fā)揮著核心作用[27]。應(yīng)激反應(yīng)造成組織損傷后，大部分補(bǔ)體成分的合成會(huì)增強(qiáng)[28]。有研究表明，魚類等變溫動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)溫度變化更為敏感[29]。C3質(zhì)量濃度僅在16 ℃組顯著升高，其余各組間無(wú)顯著差異，原因可能是珍珠龍膽石斑魚的補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)溫度的變化較為敏感，為了抵御低溫脅迫對(duì)組織造成的損傷，補(bǔ)體系統(tǒng)被誘導(dǎo)激活合成了C3，參與肝臟能量代謝和調(diào)節(jié)肝損傷再生，以提高機(jī)體的免疫能力，降低對(duì)疾病的易感性。

3.3 暫養(yǎng)溫度對(duì)珍珠龍膽石斑魚抗氧化能力的影響

低溫和氨等不利環(huán)境因素會(huì)誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生氧自由基并導(dǎo)致氧化應(yīng)激，為了平衡細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，生物體通過改變抗氧化酶 (SOD、CAT和GPx) 的活性以清除氧自由基，抵消氧化應(yīng)激并防止氧化損傷，抗氧化酶活性是監(jiān)測(cè)生物體抗氧化狀態(tài)的重要指標(biāo)[30]。CAT與SOD清除超氧化物自由基，產(chǎn)生H2O和O2[31]。GPx可以清除細(xì)胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物和羥自由基，從而減輕細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的過氧化作用[32]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，體內(nèi)MDA含量表征活性氧和自由基對(duì)脂質(zhì)的氧化損傷程度[33]。低溫 (16、18 ℃)組肝臟SOD、CAT活性較暫養(yǎng)前顯著升高，原因可能是在低溫條件下魚體活性氧自由基水平和MDA含量增加，為了維持身體組織抗氧化水平的平衡，魚體內(nèi)部生理調(diào)節(jié)導(dǎo)致了抗氧化酶活性的補(bǔ)償性增加，通過消耗抗氧化物質(zhì)來(lái)抵抗氧化反應(yīng)帶來(lái)的損傷。隨著溫度的升高，肝臟SOD、CAT、GPx水平呈顯著下降趨勢(shì)，這可能與MDA濃度的顯著增加有關(guān)。在長(zhǎng)期氨類代謝廢物的脅迫下，抗氧化酶的活性受到抑制，使魚體的抗氧化能力降低，不能有效清除氧自由基，過量的氧自由基加速脂質(zhì)過氧化和增加MDA濃度，機(jī)體自由基的防御系統(tǒng)被破壞，導(dǎo)致酶活性迅速下降，免疫系統(tǒng)失衡，因此抗氧化酶活性明顯低于對(duì)照組。這與紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes) 和斑點(diǎn)石斑魚(E. fuscoguttatus♀×E. lanceolatu ♂) 在氨氮脅迫下抗氧化酶活性的變化相似[34-35]。

3.4 暫養(yǎng)過程中水質(zhì)指標(biāo)的變化

氨作為魚類蛋白質(zhì)代謝的主要排泄產(chǎn)物之一，占氮排泄物總量的70%～90%，以離子氨和非離子氨 (NH3) 兩種形式存在。NH3因其較強(qiáng)的脂溶性和不帶電荷的特性，能穿透大部分生物膜并對(duì)機(jī)體各器官造成嚴(yán)重?fù)p害[36]。研究表明，NH3濃度的增加會(huì)導(dǎo)致魚體生長(zhǎng)發(fā)育障礙、組織損傷、免疫紊亂和死亡率增加[37-38]。本研究中，相對(duì)于高溫 (20、24 ℃) 組，低溫 (16、18 ℃) 組水體中 TAN質(zhì)量濃度下降了23.1%～84.5%，這與黃蓋鰈 (Pseudopleuronectes yokohamae)、梭鱸 (Sander lucioperca)及大瀧六線魚 (Hexagrammos otakii) 的排氨率隨溫度降低而下降的研究結(jié)果相一致[39-41]，表明低溫條件可以有效降低珍珠龍膽石斑魚代謝廢物的排放量，減緩水體中氨氮等物質(zhì)的富集速度，從而達(dá)到延長(zhǎng)保活流通的目的。在0～48 h內(nèi)，各組TAN質(zhì)量濃度增速緩慢，暫養(yǎng)時(shí)間超過48 h后，18、20和24 ℃組TAN質(zhì)量濃度迅速上升，原因可能是硝化細(xì)菌、氨氮好氧菌等在不同時(shí)間形成了優(yōu)勢(shì)種群，使氨氮先小幅度波動(dòng)后迅速上升[42]。?；钸^程中各組pH基本維持在7.0以上，盡管存在一定的差異，但均在珍珠龍膽石斑魚適宜生存的pH范圍內(nèi)。

4 結(jié)論

本研究以0.5～1.0 ℃·h?1的速率將珍珠龍膽石斑魚降溫至16、18、20、24 ℃條件下進(jìn)行暫養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，16 ℃時(shí)石斑魚在禁食條件下的存活時(shí)間最長(zhǎng) (109 h)。隨著暫養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，水質(zhì)逐漸惡化，魚體非特異性免疫和抗氧化能力受到不同程度的影響，導(dǎo)致肝臟、心肌等組織器官出現(xiàn)不可逆損傷，加速了石斑魚在暫養(yǎng)過程中的死亡。相較于對(duì)照組，16 ℃暫養(yǎng)48 h后魚體血清中ALT、AST、CK、AKP、LZM活性無(wú)顯著變化，血清TP、GLB和C3濃度顯著增加，肝臟抗氧化酶活性升高，總體優(yōu)于其他溫度組。結(jié)果表明，16 ℃暫養(yǎng)溫度下珍珠龍膽石斑魚非特異性免疫和抗氧化系統(tǒng)調(diào)控能力保持在較高水平，減緩了?；钸^程中珍珠龍膽石斑魚肝臟的氧化應(yīng)激損傷，能更好地維持機(jī)體能量物質(zhì)代謝平衡，延長(zhǎng)魚體的存活時(shí)間，該暫養(yǎng)溫度條件可為制定珍珠龍膽石斑魚?；钸\(yùn)輸策略提供重要參考。