納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹免疫保護(hù)和抗氧化能力的影響

賈慧凝，侍苗苗，卞永樂(lè)，侍崇敬，劉恒蔚，宋學(xué)宏，秦粉菊

1. 蘇州科技大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009

2. 蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123

作為世界第一水產(chǎn)養(yǎng)殖和貿(mào)易大國(guó)，中國(guó)2020年淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量為3 088.9×104t，其中中華絨螯蟹 (Eriocheir sinensis) 總產(chǎn)量為 77.59×104t，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中具有重要地位[1]。同時(shí)，隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高、電子商務(wù)的迅速發(fā)展和冷鏈物流配套設(shè)施的逐步完善，中華絨螯蟹的消費(fèi)增速較快，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

中華絨螯蟹養(yǎng)殖以家庭農(nóng)場(chǎng)為主，養(yǎng)殖難度較高，各種環(huán)境因素和病害的頻繁爆發(fā)嚴(yán)重限制了其發(fā)展。河塘養(yǎng)殖條件下，夏季高水溫、有機(jī)物輸入以及殘餌和糞便積聚等因素會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖水體溶解氧(DO) 濃度降低[2]，使生長(zhǎng)在河塘底部的中華絨螯蟹組織或血管中的氧濃度降低，產(chǎn)生低氧脅迫。低氧脅迫會(huì)影響蟹的免疫機(jī)能和抗氧化能力[3]，導(dǎo)致其對(duì)病原體的抵抗能力下降、易于感染致病菌而造成損傷甚至死亡[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)具有提高抗氧化能力、改善低氧耐受能力、降低細(xì)胞代謝和氧消耗等多種功效[5]。因此，開(kāi)展中華絨螯蟹營(yíng)養(yǎng)調(diào)控以應(yīng)對(duì)低氧脅迫的研究，具有十分重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

生物機(jī)體必需微量元素——硒 (Se)，對(duì)細(xì)胞抗氧化和動(dòng)物機(jī)體免疫能力起重要調(diào)節(jié)作用[6-7]。研究表明，飼料中補(bǔ)充硒可以顯著改善中華絨螯蟹的抗氧化能力、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、免疫應(yīng)答和生長(zhǎng)代謝[8-9]，但傳統(tǒng)硒源的安全范圍較窄，納米硒 (nano-Se) 高效低毒的特性能夠解決傳統(tǒng)硒源最佳使用劑量和致毒濃度之間安全限度非常狹窄的問(wèn)題，且其抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能優(yōu)于傳統(tǒng)硒源[10]，而揭示納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹抗氧化能力和免疫保護(hù)作用機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。在筆者課題組前期納米硒營(yíng)養(yǎng)研究的基礎(chǔ)上[11]，本研究設(shè)置了不同添加水平的納米硒處理，探索其對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹的免疫保護(hù)作用及抗氧化調(diào)控機(jī)制，以期為納米微量元素營(yíng)養(yǎng)調(diào)控應(yīng)對(duì)中華絨螯蟹低氧脅迫提供一定的理論依據(jù)和應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

納米硒由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)蘇州研究院提供；嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila, CL99920) 由江蘇省水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供 (編號(hào)SC097)；中華絨螯蟹基礎(chǔ)飼料購(gòu)于蘇州鑫裕飼料有限公司 (表1)，采用逐級(jí)擴(kuò)大混合的方法，將納米硒分別按 0、0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.6 mg·kg?1的水平加入基礎(chǔ)飼料中，加水混勻，用小型絞肉機(jī)制成直徑2.5 mm左右的顆粒飼料，晾干后密封與空氣隔絕，置于?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料配方組成Table 1 Ingredients of composition of basal diets

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 中華絨螯蟹的養(yǎng)殖

1 800只中華絨螯蟹幼蟹購(gòu)于蘇州市臨湖現(xiàn)代漁業(yè)產(chǎn)業(yè)園，體質(zhì)量 (4.5±0.4) g；適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為6個(gè)添加水平組，分別以0 (對(duì)照組)、0.1、0.2、0.4、0.8 和 1.6 mg·kg?1納米硒添加實(shí)驗(yàn)飼料飼喂90 d，養(yǎng)殖于玻璃鋼水族箱 (長(zhǎng)60 cm×寬50 cm×高100 cm)。飼養(yǎng)期間，水溫 (25±1) ℃，pH 7.95±0.06，DO 質(zhì)量濃度 (6.4±0.2)mg·L?1，總氨質(zhì)量濃度 (0.35±0.02) mg·L?1，氯化物質(zhì)量濃度 (135±16) mg·L?1，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度低于0.05 mg·L?1，鹽度3‰，光暗交替12 h。每天早晚各投喂實(shí)驗(yàn)飼料1次，投喂量為蟹體質(zhì)量的2%，飼喂期間蟹正常取食，換水率為20%·d?1，每天清除糞便。

1.2.2 低氧脅迫實(shí)驗(yàn)

將用塑料薄膜封口的儲(chǔ)水桶 (87 cm×63 cm×61 cm) 一側(cè)通入氮?dú)?，使用碘量法[12]實(shí)時(shí)測(cè)定儲(chǔ)水桶中的DO水平，使DO質(zhì)量濃度保持在 (2.0±0.4)mg·L?1，形成低氧水環(huán)境。飼喂90 d后，從每個(gè)添加水平組中選取120只體格相當(dāng)、健康、肢體健全的中華絨螯蟹，平均體質(zhì)量為19.74 g，設(shè)置6個(gè)平行組，每組20只，分別置于3 L的密閉具塞三角燒瓶中，接通低氧水系統(tǒng)。其中3個(gè)平行組用于測(cè)定免疫保護(hù)率：在低氧脅迫第0、第12和第24小時(shí)記錄死亡率，計(jì)算納米硒對(duì)中華絨螯蟹的免疫保護(hù)率。另3個(gè)平行組用于測(cè)定低氧脅迫第0、第12和第24小時(shí)其他指標(biāo)：采集血淋巴與抗凝劑按1∶1體積比混勻以備血細(xì)胞計(jì)數(shù)，部分血淋巴經(jīng)凝固離心制備上清，對(duì)肝胰腺、鰓進(jìn)行采樣，將組織樣品和血淋巴上清置于?70 ℃冰箱保存。

免疫保護(hù)率 (IPR, %) 的計(jì)算公式為：

式中：M0為 0 mg·kg?1納米硒組蟹的死亡率 (%)；Mn為不同添加水平納米硒組蟹的死亡率 (%)。

1.2.3 低氧脅迫下嗜水氣單胞菌對(duì)中華絨螯蟹攻毒實(shí)驗(yàn)

飼喂90 d后，從每個(gè)添加水平組中選取60只體格相當(dāng)、健康、肢體健全的中華絨螯蟹，平均體質(zhì)量為19.74 g，設(shè)置3個(gè)平行組，每組20只，從第三步足與體壁關(guān)節(jié)膜肌肉處注射4×106CFU·kg?1劑量的嗜水氣單胞菌，置于3 L的密閉具塞三角燒瓶中，接通低氧水系統(tǒng)。實(shí)時(shí)觀察并記錄死亡情況，計(jì)算納米硒對(duì)中華絨螯蟹的免疫保護(hù)率。

1.3 指標(biāo)測(cè)定及方法

取低氧脅迫下中華絨螯蟹經(jīng)抗凝劑處理的血淋巴20 μL，使用血球計(jì)數(shù)板和光學(xué)顯微鏡統(tǒng)計(jì)總血細(xì)胞數(shù)量 (THC)、大顆粒細(xì)胞 (LGC)、小顆粒細(xì)胞(SGC)、透明細(xì)胞 (HC)。參考Nickerson等[13]的方法，使用紫外吸收比色法測(cè)定血清中血藍(lán)蛋白濃度。選取組織樣本，按照南京建成生物工程研究所和蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的試劑盒，測(cè)定乳酸 (LD) 濃度，超氧化物歧化酶 (SOD) 、過(guò)氧化氫酶 (CAT) 、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSH-Px) 活性和丙二醛 (MDA) 濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 死亡率

飼料中添加納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹死亡率的影響見(jiàn)表2。未進(jìn)行低氧脅迫時(shí)，納米硒各添加水平組中華絨螯蟹死亡率均為0%，低氧脅迫12和24 h蟹死亡率分別上升至12.66% (P>0.05) 和62.45% (P<0.05)。在飼料中添加納米硒，低氧脅迫12和24 h蟹死亡率均隨著納米硒添加水平的增加先下降后上升，添加0.1、0.2 mg·kg?1納米硒組低氧脅迫下的死亡率顯著低于未添加組 (P<0.05)，其中0.2 mg·kg?1組效果更好，低氧脅迫12和24 h的免疫保護(hù)率分別可達(dá)80.25%和58.98%；添加0.8、1.6 mg·kg?1納米硒會(huì)顯著提高低氧脅迫下中華絨螯蟹的死亡率 (P<0.05)。

表2 納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹死亡率的影響 (N=10)Table 2 Effects of nano-Se on mortality rate of E. sinensis under hypoxia stress (N=10)

2.2 嗜水氣單胞菌致蟹死亡率

飼料中添加納米硒對(duì)低氧脅迫下嗜水氣單胞菌致蟹死亡率的影響見(jiàn)表3。與單獨(dú)低氧脅迫處理(表2) 相比，低氧脅迫下嗜水氣單胞菌感染12和24 h的蟹死亡率分別由12.66%增至50.36%，62.45%增至100%。在飼料中添加適量納米硒 (0.1～0.4 mg·kg?1)，低氧脅迫下嗜水氣單胞菌的致死率顯著下降 (P<0.05)，其中 0.2 mg·kg?1組中華絨螯蟹的死亡率顯著低于其他添加水平組 (P<0.05)，對(duì)低氧脅迫下12和24 h中華絨螯蟹的免疫保護(hù)率分別可達(dá)75.22%和43.18%。

表3 納米硒對(duì)低氧脅迫下嗜水氣單胞菌致死率的影響 (N=10)Table 3 Effects of nano-Se on lethality of A. hydrophila under hypoxia stress (N=10)

2.3 血淋巴耐低氧指標(biāo)

飼料中添加納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹血淋巴中血藍(lán)蛋白和LD濃度的影響見(jiàn)圖1。與對(duì)照組比較，0 mg·kg?1組在低氧脅迫第12小時(shí)蟹血淋巴中血藍(lán)蛋白濃度顯著上升 (P<0.05)，繼續(xù)脅迫至第24小時(shí)回落。低氧脅迫12和24 h，血藍(lán)蛋白濃度均隨著納米硒添加水平的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且均以0.2 mg·kg?1組上升最為顯著 (P<0.05)，1.6 mg·kg?1組則顯著下降 (P<0.05)。

圖1 納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹血淋巴耐低氧指標(biāo)的影響 (N=6)注：柱上不同英文字母表示相同低氧脅迫時(shí)間下顯著差異 (P<0.05)；*. 與對(duì)照組差異顯著 (P<0.05)；后圖同此。Fig. 1 Effects of nano-Se on hemolymph hypoxia tolerance indexes of E. sinensis under hypoxia stress (N=6)Note: Different lowercase letters on the bar indicate significant difference at the same hypoxia stress time (P<0.05); *. Significant difference compared with the control group (P<0.05); the same case in the following figures.

低氧脅迫下中華絨螯蟹血淋巴中LD和血藍(lán)蛋白濃度具有基本相反的規(guī)律性。與對(duì)照組相比，低氧脅迫12和24 h顯著增加0 mg·kg?1組蟹血淋巴中LD濃度 (P<0.05)。在飼料中添加納米硒，低氧脅迫12和24 h，LD濃度均隨著納米硒添加水平的增加先下降后上升，均以0.2 mg·kg?1組LD濃度最低，且顯著低于其他添加水平組 (P<0.05)。

2.4 血淋巴血細(xì)胞數(shù)量

飼料中添加納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹血淋巴中THC、LGC、SGC和HC的影響見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比，0 mg·kg?1組蟹血淋巴中 THC、LGC、SGC和HC在低氧脅迫第12 h小時(shí)顯著增加 (P<0.05)，至第24小時(shí)下降。在飼料中添加納米硒，低氧脅迫12和24 h，THC、LGC、SGC和HC均隨納米硒添加水平的增加先上升后下降，且均以0.2 mg·kg?1組顯著高于其他添加水平組，低氧第24小時(shí)0.8和1.6 mg·kg?1組則顯著低于其他添加水平組 (P<0.05)。

圖2 納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹血淋巴血細(xì)胞數(shù)量的影響 (N=6)Fig. 2 Effects of nano-Se on hemolymph hemocyte count of E. sinensis under hypoxia stress (N=6)

2.5 抗氧化能力

低氧脅迫下中華絨螯蟹不同組織中SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA濃度分別見(jiàn)圖3、圖4、圖5和圖6。

圖3 納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹不同組織中超氧化物歧化酶活性的影響 (N=6)Fig. 3 Effects of nano-Se on SOD activity in different tissues of E. sinensis under hypoxia stress (N=6)

圖4 納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹不同組織中過(guò)氧化氫酶活性的影響 (N=6)Fig. 4 Effects of nano-Se on CAT activity in different tissues of E. sinensis under hypoxia stress (N=6)

圖5 納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹不同組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的影響 (N=6)Fig. 5 Effects of nano-Se on GSH-Px activity in different tissues of E. sinensis under hypoxia stress (N=6)

圖6 納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹不同組織中丙二醛濃度的影響 (N=6)Fig. 6 Effects of nano-Se on MDA concentration in different tissues of E. sinensis under hypoxia stress (N=6)

與對(duì)照組比較，0 mg·kg?1組蟹肝胰腺、鰓和血清中的SOD、CAT、GSH-Px活性基本均呈現(xiàn)出在低氧脅迫第12小時(shí)顯著上升 (P<0.05)，第24小時(shí)又下降的趨勢(shì)。在飼料中添加納米硒，蟹3種組織中的SOD、CAT、GSH-Px活性均隨納米硒添加水平的增加先上升后下降；低氧脅迫第12小時(shí)，3種組織中0.2 mg·kg?1組SOD和CAT活性均最高，且與其他添加水平組有顯著差異 (P<0.05)；低氧脅迫第24小時(shí)，肝胰腺和鰓組織中SOD、CAT活性均以0.1、0.2和0.4 mg·kg?1組最高，且與其他添加水平組有顯著差異 (P<0.05)；低氧脅迫第12和第24 小時(shí)，肝胰腺和血清中GSH-Px活性均以0.2 mg·kg?1組最高，且與其他添加水平組有顯著差異 (P<0.05)，鰓組織中GSH-Px活性各添加水平組間無(wú)顯著差異 (P>0.05)。

與對(duì)照組相比，蟹肝胰腺、鰓和血清中MDA濃度在低氧脅迫第12至第24小時(shí)持續(xù)顯著上升 (P<0.05)。在飼料中添加納米硒，蟹3種組織中MDA濃度隨其添加水平的增加先下降后上升。低氧脅迫第12和第24 小時(shí)，0.1、0.2和0.4 mg·kg?1組蟹3種組織中MDA濃度均顯著低于其他添加水平組 (P<0.05)，1.6 mg·kg?1納米硒組MDA濃度最高，且與其他添加水平組有顯著差異(P<0.05)。

3 討論

3.1 納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹免疫保護(hù)的影響

DO水平對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖尤為重要，低氧脅迫易造成甲殼類(lèi)動(dòng)物氧化損傷，誘發(fā)水產(chǎn)疾病，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[14]。嗜水氣單胞菌是引起水產(chǎn)養(yǎng)殖大規(guī)模傳染疾病的主要病原菌[15]，極易在不良脅迫尤其是低氧環(huán)境下感染水生動(dòng)物，導(dǎo)致中華絨螯蟹顫抖病和水腫病等多種疾病的發(fā)生，是造成其養(yǎng)殖巨大經(jīng)濟(jì)損失的重要因素[16-17]。程超等[18]發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌會(huì)破壞中華絨螯蟹鰓、肝胰腺等組織結(jié)構(gòu)，并影響其免疫相關(guān)基因的表達(dá)。鑒于此，本研究選擇嗜水氣單胞菌研究低氧脅迫下中華絨螯蟹對(duì)致病菌的免疫能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射嗜水氣單胞菌使低氧脅迫12 h的蟹死亡率由12.66%增加到50.36%，低氧脅迫24 h的死亡率由62.45%增加到100%。而在飼料中添加0.2 mg·kg?1的納米硒，低氧脅迫12和24 h嗜水氣單胞菌的致蟹死亡率分別降至12.48%和56.82%，免疫保護(hù)率分別可達(dá)75.22%和43.18%，有效地緩解了低氧脅迫下中華絨螯蟹免疫力的降低，而以0.8、1.6 mg·kg?1水平添加納米硒則會(huì)進(jìn)一步提高低氧脅迫和低氧下嗜水氣單胞菌攻毒的蟹死亡率。相似地，Kong等[19]發(fā)現(xiàn)在日本沼蝦 (Macrobrachium nipponense) 的飼料中添加0.47和0.59 mg·kg?1酵母硒可以顯著提高其成活率，而過(guò)量 (1.17 mg·kg?1)的酵母硒則會(huì)產(chǎn)生毒性，抑制其生長(zhǎng)和免疫能力。

中華絨螯蟹免疫系統(tǒng)是非特異性的，主要通過(guò)血細(xì)胞和從細(xì)胞釋放到血漿中的各種活性因子來(lái)清除病原體[20-21]。其中血細(xì)胞是中華絨螯蟹血液循環(huán)中的氧載體，通過(guò)吞噬作用、產(chǎn)生抗菌肽和活性氧等功能以抵御病原體[22]，根據(jù)其形態(tài)和功能主要被分為大顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和透明細(xì)胞3類(lèi)[23]。血藍(lán)蛋白是甲殼類(lèi)動(dòng)物血淋巴中的主要蛋白質(zhì)，在中華絨螯蟹中占血淋巴總蛋白的90%以上，除載氧功能外，還具有酚氧化酶的功能，通過(guò)酶促切割對(duì)病原產(chǎn)生免疫防御[24-25]。因此，血淋巴中血細(xì)胞數(shù)量和血藍(lán)蛋白濃度是中華絨螯蟹免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，也是評(píng)估其在低氧環(huán)境脅迫下免疫能力的重要指標(biāo)。

le Moullac等[26]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)角對(duì)蝦 (Penaeus stylirostris) 暴露在嚴(yán)重低氧 (1 mg·L?1) 環(huán)境下24 h血淋巴中LGC、SGC、HC和THC顯著降低，從而導(dǎo)致溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus) 的感染致死率顯著增加。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低氧脅迫第12小時(shí)蟹血淋巴中各類(lèi)型血細(xì)胞數(shù)量顯著增加，繼續(xù)脅迫至第24小時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能與實(shí)驗(yàn)設(shè)置的DO水平不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中低氧脅迫第12小時(shí)蟹血藍(lán)蛋白濃度顯著上升 (P<0.05)，繼續(xù)脅迫至第24小時(shí)回落，LD濃度則繼續(xù)增加。Song等[27]對(duì)中華絨螯蟹、Wang等[28]對(duì)青蟹(Scylla paramamosain) 的低氧脅迫研究均得到相似結(jié)論。在低氧脅迫下，中華絨螯蟹為適應(yīng)低氧環(huán)境產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，通過(guò)增加血細(xì)胞數(shù)量和血藍(lán)蛋白濃度以提高攜氧能力，作為無(wú)氧呼吸產(chǎn)物——LD的增加可以有效消除波爾效應(yīng)并提高血藍(lán)蛋白結(jié)合氧的能力。低氧脅迫延長(zhǎng)至第24小時(shí)，蟹血淋巴細(xì)胞數(shù)量和血藍(lán)蛋白濃度降低，LD濃度增加，同時(shí)伴隨蟹死亡率增加和嗜水氣單胞菌致蟹死亡率加劇，表明低氧脅迫影響血藍(lán)蛋白、LD濃度和血細(xì)胞數(shù)量而降低中華絨螯蟹的耐低氧及免疫能力。本研究在中華絨螯蟹飼料中添加納米硒，0.2 mg·kg?1組血細(xì)胞數(shù)量和血藍(lán)蛋白濃度顯著高于其他添加水平組，LD濃度顯著低于其他水平組，提示納米硒可以提高低氧脅迫下中華絨螯蟹的免疫、載氧和耐低氧能力。李彥紅等[29]研究發(fā)現(xiàn)，使用添加0.2、0.4和0.8 mg·kg?1納米硒的飼料飼喂齊口裂腹魚(yú) (Schizothorax prenanti) 8周，血清總蛋白、球蛋白水平和免疫器官指數(shù)明顯升高，說(shuō)明納米硒具有增強(qiáng)免疫的作用，且以0.2 mg·kg?1添加水平的效果最明顯，這與本研究結(jié)果相似。另外本研究中，最佳添加水平對(duì)蟹LD濃度的抑制效果以及對(duì)各類(lèi)型血細(xì)胞 (THC、LGC和HC，除SGC外) 的增加效果均在低氧第12小時(shí)最佳，說(shuō)明0.2 mg·kg?1添加水平在短時(shí)間 (低氧 12 h) 內(nèi)對(duì)蟹免疫功能的保護(hù)和調(diào)節(jié)作用更佳，脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，其保護(hù)效率下降。

3.2 納米硒對(duì)低氧脅迫下中華絨螯蟹抗氧化能力的影響

低氧條件下，中華絨螯蟹的鰓、肝胰腺和血淋巴中產(chǎn)生大量活性氧 (ROS) 如過(guò)氧化物、超氧物、羥基自由基和單線態(tài)氧。ROS會(huì)導(dǎo)致DNA鏈斷裂、堿基修飾，攻擊膜蛋白造成細(xì)胞損傷，其最顯著的細(xì)胞損傷是脂質(zhì)過(guò)氧化[30-32]。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的天然產(chǎn)物，反映了細(xì)胞的過(guò)氧化狀態(tài)，通常用于監(jiān)測(cè)內(nèi)源性氧化損傷，其濃度升高通常與各種環(huán)境應(yīng)激和動(dòng)物病理狀態(tài)有關(guān)[33-35]?？寡趸赶到y(tǒng)作為中華絨螯蟹非特異性細(xì)胞吞噬免疫和抗氧化防御體系的重要組成部分，可以消除生物體內(nèi)過(guò)量的ROS。中華絨螯蟹體內(nèi)的抗氧化酶包括SOD、GSH-Px和CAT等[36-37]。SOD和CAT可以清除超氧自由基 (·O2?) 和過(guò)氧化氫 (H2O2)，GSH-Px 的作用是通過(guò)谷胱甘肽 (GSH) 轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽(GSSG) 的過(guò)程催化H2O2和過(guò)氧化脂類(lèi)的還原[38-39]。

de Oliveira等[40]發(fā)現(xiàn)西南大西洋穴居蟹 (Chasmagnathus granulata) 在低氧脅迫8 h后鰓組織中的SOD活性降低，CAT和GSH-Px活性升高，MDA水平升高。管越強(qiáng)等[41]發(fā)現(xiàn)日本沼蝦 (Macrobrachium nipponense) 在低氧 (2 mg·L?1) 環(huán)境 8 h 后SOD活性降低、CAT活性和總抗氧化能力升高。Nam等[42]和Bundgaard等[43]對(duì)皺紋盤(pán)鮑 (Haliotis discus hannai) 和鯽 (Carassius carassius) 的低氧脅迫研究均有相似結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)中低氧脅迫12 h中華絨螯蟹肝胰腺、血清和鰓中SOD活性降低，CAT和GSH-Px活性升高，MDA水平升高，這與前人的研究結(jié)論一致；繼續(xù)低氧脅迫至第24小時(shí)，3種抗氧化酶活性均降低，MDA水平繼續(xù)增加。本研究結(jié)果說(shuō)明低氧脅迫12 h會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，中華絨螯蟹抗氧化酶CAT和GSH-Px活性升高以維持體內(nèi)ROS平衡，SOD作為唯一以·O2?為底物的酶，隨著攝入O2減少，產(chǎn)生·O2?的量減少而活性降低；隨著低氧脅迫時(shí)間延長(zhǎng)至24 h，中華絨螯蟹體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)受到影響，使中華絨螯蟹的抗氧化能力下降進(jìn)而損傷蟹免疫功能。

硒 (Se) 是甲殼類(lèi)動(dòng)物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，是抗氧化酶GSH-Px和其他硒蛋白的重要組成成分和活性中心，對(duì)防止氧化損傷和調(diào)節(jié)免疫功能起重要作用[44-45]。趙亞偉等[46]發(fā)現(xiàn)不同硒源的抗氧化能力具有顯著差異，低毒高效的納米單質(zhì)硒作用最為顯著。膳食補(bǔ)充納米硒可以提高機(jī)體血清中硒水平，降低脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化，上調(diào)GSH-Px、SOD和CAT等抗氧化酶水平，減輕氧化應(yīng)激程度[47]。Kong等[19]發(fā)現(xiàn)在日本沼蝦的飼料中添加0.31、0.47和0.59 mg·kg?1酵母硒可以顯著提高 GSH-Px 和SOD活性，降低MDA水平，抗氧化能力顯著提高。黃小紅等[48]發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.25、0.5和0.75 mg·kg?1納米硒可以顯著提高草魚(yú) (Ctenopharyngodon idellus) 血清中的GSH-Px、SOD和總抗氧化能力 (T-AOC) 水平，降低MDA水平，其中0.5 mg·kg?1納米硒作用更顯著。本研究中，隨著飼料中納米硒添加水平的提高，SOD、CAT和GSHPx活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中0.2 mg·kg?1納米硒組達(dá)到最高水平，1.6 mg·kg?1組達(dá)到最低水平，表明適量納米硒可顯著提高中華絨螯蟹的抗氧化能力，過(guò)量添加則會(huì)降低其抗氧化能力。低氧脅迫下0.2 mg·kg?1納米硒組蟹各組織中的MDA水平均達(dá)最低值，這與該水平納米硒可以有效提高低氧脅迫下中華絨螯蟹的抗氧化能力結(jié)論相一致。此外，不同脅迫時(shí)間下，最佳水平納米硒在不同抗氧化指標(biāo)以及相同抗氧化指標(biāo)在不同組織中的效果不一致，但可以發(fā)現(xiàn)0.2 mg·kg?1納米硒對(duì)3種組織中SOD活性的提升效果均在低氧第12小時(shí)更明顯，脅迫時(shí)間延長(zhǎng)至第24小時(shí)，納米硒的保護(hù)效果降低；在低氧12 h下，0.2 mg·kg?1納米硒對(duì)肝胰腺中CAT和GSH-Px活性的提升效果更好，相應(yīng)地，此時(shí)0.2 mg·kg?1納米硒對(duì)肝胰腺中MDA水平的抑制作用也優(yōu)于低氧24 h。這些結(jié)果均表明0.2 mg·kg?1納米硒在低氧第12小時(shí)對(duì)蟹抗氧化能力的保護(hù)效果更佳。

本研究發(fā)現(xiàn)在蟹飼料中添加0.2 mg·kg?1納米硒可以顯著改善其免疫能力，降低其在不良脅迫下的死亡率，綜合筆者課題組前期研究[11]，該劑量納米硒也可提高中華絨螯蟹的生長(zhǎng)性能，改善其營(yíng)養(yǎng)組成，具有非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和發(fā)展前景。

4 結(jié)論

飼料中添加納米硒可顯著改善低氧脅迫下中華絨螯蟹的抗氧化能力和免疫機(jī)能，降低其在低氧脅迫下的死亡率和病菌致死率，且添加水平以0.2 mg·kg?1為宜。