基于4D 蛋白組學(xué)分析RhoE 基因敲除對(duì)糖尿病大鼠心臟組織中蛋白質(zhì)表達(dá)的影響及機(jī)制

趙 鋆，施凱佳，伍彩霞，鄒 園，吳林栩，陳 旭，申志華，郭峻莉，揭 偉

（1. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院海南省熱帶心血管病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；2. 廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東 湛江 524023；3.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南 ?？?571199）

糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是指不能用高血壓性心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病及其他已知病因的心臟病變來(lái)解釋的糖尿病并發(fā)的心肌疾?。?，2］，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜迄今尚未闡明。因此，尋找合適的生物標(biāo)志物為DCM 的預(yù)防及治療具有極其重要的意義。近年來(lái)發(fā)展的轉(zhuǎn)錄組學(xué)［3］、蛋白組學(xué)［4］、代謝組學(xué)［5］、修飾組學(xué)［6］等研究都為此提供潛在的方案。

RhoE，也稱Rnd3，為Rho 家庭GTPase 蛋白質(zhì)超家族成員之一。RhoE 功能多樣，與細(xì)胞增殖、周期、凋亡、遷移及分化等生物學(xué)功能有關(guān)［7］。文獻(xiàn)報(bào)道，RhoE 表達(dá)異常與較多的心血管疾病有關(guān)［8-10］。前期基于CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了RhoE 基因穩(wěn)定敲除的H9C2 心肌細(xì)胞系，通過芯片篩查差異表達(dá)基因并富集RhoE 有關(guān)的信號(hào)途徑，發(fā)現(xiàn)RhoE 參與調(diào)控膽固醇生物合成途徑、oncostatin-M 信號(hào)、干擾素信號(hào)及TGF-β1 信號(hào)等，凸顯了RhoE 在心臟疾病中的重要角色［11］。迄今，有關(guān)RhoE 與DCM 相關(guān)研究未見報(bào)道。

4D 蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種高通量差異表達(dá)蛋白質(zhì)篩選方法，近年來(lái)受到較多的關(guān)注［12，13］。本研究擬采用4D 非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，檢測(cè)RhoE表達(dá)改變?cè)谔悄虿〈笫笮呐K組織中蛋白質(zhì)表達(dá)譜，表征其心臟組織中調(diào)控的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，結(jié)合生物信息學(xué)手段來(lái)挖掘在差異表達(dá)蛋白質(zhì)涉及的功能、分布及參與的相關(guān)信號(hào)通路，為解析RhoE 在DCM 中的角色提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑：鏈脲佐菌素（YEASEN，中國(guó)），二硫蘇糖醇、三氟乙酸、三氯甲烷、尿素、四甲基乙二胺、Seppro?Rat Spin Columns（Sigma-Aldrich，美 國(guó)），乙腈、甲醇、TMT 標(biāo)記試劑、蛋白標(biāo)志物（Thermo-Fisher Scientific，美國(guó)），PAGE 銀染試劑盒、DNA提取酚試劑（北京Solarbio），Pierce Top 12 Abundant Protein Depletion Spin Columns、硝酸纖維過濾膜、聚偏氟乙烯（Bio-Rad Laboratories，美國(guó)）。

主要儀器：NanoElute、高分辨質(zhì)譜儀Bruker timsTOF Pro、超聲儀（ThermoFisher Scientific，美國(guó)），電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽（Bio-Rad，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年RhoE 基因全身敲除的雜合子Sprague Dawley（SD）大鼠（RhoE+/-，雄性，體重200～250 g），野生型SD 大鼠（雄性，6 周齡，體重200～250 g）由江蘇賽業(yè)生物科技有限公司提供，飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心病進(jìn)行繁育和基因型鑒定［14］。采用高脂飼料配合一次性鏈脲佐菌素（70 mg/kg）聯(lián)合構(gòu)建糖尿病大鼠模型，給予鏈脲佐菌素注射2周后，連續(xù)3 次空腹血糖值≥16.7 mmol/L，取各組心臟組織用于蛋白組學(xué)研究。分組如下：正常對(duì)照大鼠（WT_NG），即WT 大鼠予以腹腔注射等量檸檬酸鈉鹽水；糖尿病大鼠（WT_HG），即WT 大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)成1 型糖尿?。籖hoE 敲除對(duì)照大鼠（KO_NG），即RhoE+/-腹腔注射等量檸檬酸鈉 鹽 水；RhoE 敲 除 糖 尿 病 大 鼠（KO_HG），即RhoE+/-腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)成1 型糖尿病。動(dòng)物均飼養(yǎng)于SPF 級(jí)環(huán)境，糖尿病組予以高脂飲食和常規(guī)飲水，對(duì)照組予以常規(guī)飲食和飲水。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求（倫理 編 號(hào)：GDY2016003）。 每 組 大 鼠 均 為3 只（n=3）。

1.3 蛋白提取與酶解

參考文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行［15，16］。研缽用液氮預(yù)冷后置入適量心肌組織樣品，加入液氮后將組織塊完全研磨成粉末狀。每組樣品加入4 倍粉末體積的裂解緩沖液（含1%蛋白酶抑制劑，50 mmol/L 煙酰胺3 μmol/L 去乙酰化酶抑制劑，8 mol/L 尿素），行超聲裂解。離心（4 ℃，12 000g，10 min）后將上清液轉(zhuǎn)移到另一無(wú)菌離心管，使用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取等量各樣品蛋白，用裂解液調(diào)整各組體積至一致。輕柔地加入20%三氯乙酸，渦旋后充分混勻，4 ℃沉淀2 h 后離心，用冷丙酮洗滌沉淀3 次。將沉淀置于超凈臺(tái)晾干，加入200 mmol/L 的四乙基溴化銨后用超聲打散，按蛋白酶∶蛋白=1∶50 的比例加入胰酶，過夜酶解。加入二硫蘇糖醇調(diào)節(jié)終濃度為5 mmol/L，56 ℃反應(yīng)30 min，最后加入碘乙酰胺，調(diào)節(jié)終濃度至11 mmol/L，各樣品避光孵育15 min 后備用。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析和數(shù)據(jù)分析

利用杭州景杰公司的技術(shù)平臺(tái)完成有關(guān)色譜-質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)步驟參考相關(guān)報(bào)道［15-17］。將含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液混合，配制成流動(dòng)相A；含0.1%甲酸和100%乙腈溶液混合，配制成流動(dòng)相B。用液相色譜流動(dòng)相A 相溶解各樣本的肽段，Nano Elute 超高效液相系統(tǒng)分離。設(shè)置液相梯度為0～70 min，6%～24% B；70～84 min，24%～32%B；84～87 min，32%～80% B；87～90 min，80% B，維持流速為450 nL/min。超高效液相系統(tǒng)分離肽段后加入Capillary 離子源中電離，隨后timsTOF Pro 質(zhì)譜分析電離后的肽段，設(shè)置離子源電壓為1.7 kV，使用timsTOF Pro 質(zhì)譜檢測(cè)和分析肽段母離子及其二級(jí)碎片。設(shè)置二級(jí)質(zhì)譜掃描區(qū)間為100～1 700。設(shè)置數(shù)據(jù)采集模式為平行累積串行碎裂（PASEF）模式。使用Maxquant（v1.6.15.0）對(duì)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，搜索到Rattus_norvegicus_10116_PR_20201214.fasta 共2 9940 條序列。添加反庫(kù)后計(jì)算隨機(jī)匹配造成的假陽(yáng)性率（FDR），調(diào)整蛋白質(zhì)和多肽的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率為1%。在搜庫(kù)完成后，需要進(jìn)行一系列質(zhì)控，保證結(jié)果質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。將差異表達(dá)量變化（FC）＞1.5 同時(shí)P＜0.05 設(shè)置為表達(dá)顯著上調(diào)，F(xiàn)C＜1.5 且P＜0.05 設(shè)置為表達(dá)顯著下調(diào)。

1.5 生物信息學(xué)分析

對(duì)各比較組中差異表達(dá)蛋白質(zhì)分別進(jìn)行GO 分類和KEGG 通路富集分析，通過Fisher 精確檢驗(yàn)，評(píng)價(jià)差異表達(dá)蛋白質(zhì)富集的功能分類和通路的顯著水平。應(yīng)用分層聚類方法繪制聚類熱圖。將不同比較組中差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)或蛋白序列比對(duì)STRING（v.11.0）蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫(kù)，按照confidence score ＞0.7 提取得到差異蛋白互作關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)鑒定與解析

各組大鼠心臟酶解后的蛋白經(jīng)BCA 定量分析后符合質(zhì)譜分析要求。通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析及數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共得到二級(jí)質(zhì)譜譜圖總數(shù)2 067 933個(gè)，與理論二級(jí)譜圖匹配的譜圖數(shù)308 807 個(gè)，肽段總數(shù)29 739 個(gè)，唯一肽段總數(shù)26 946 個(gè)，鑒定蛋白質(zhì)總數(shù)3 597 個(gè)，定量蛋白數(shù)2 931 個(gè)。總體鑒定到肽段長(zhǎng)度主要分布7～20 個(gè)氨基酸，大部分蛋白對(duì)應(yīng)兩個(gè)以上肽段，大部分蛋白的覆蓋度在20%以下，蛋白分子量主要分布10 ～120 kD。所有樣本兩兩之間計(jì)算Person 相關(guān)系數(shù)而繪制的熱圖。相應(yīng)肽段、蛋白質(zhì)分布情況及樣本之間的相關(guān)性見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)鑒定與解析Fig 1 Protein identification and analysis

2.2 RhoE 敲除前后心臟組織差異蛋白篩選

以FC＞1.5、P＜0.05 作為顯著上調(diào)的變化閾值，F(xiàn)C＜1.5、P＜0.05 為明顯下調(diào)的變化標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)與WT_NG 組相比，WT_HG 組上調(diào)差異表達(dá)蛋白198 個(gè)，下調(diào)331 個(gè)（圖2A）；KO_NG 組上調(diào)差異表達(dá)蛋白26 個(gè)，下調(diào)45 個(gè)（圖2B）。與KO_NG 相比，KO_HG 上調(diào)蛋白173 個(gè)，下調(diào)255 個(gè)（圖2C）。與WT_HG 相比，KO_HG 顯著上調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)19 個(gè)，明顯下調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)28 個(gè)（圖2D）。相應(yīng)表達(dá)最明顯的前10 個(gè)蛋白質(zhì)見表1。

表1 排名前10 的差異表達(dá)蛋白質(zhì)列表Tab 1 Top ten differentially expressed proteins

圖2 RhoE 敲除前后心臟組織的差異表達(dá)蛋白火山圖Fig 2 Volcano plot of differentially expressed proteins in cardiac tissue before and after RhoE knockout

2.3 RhoE 敲除前后心臟組織差異蛋白亞細(xì)胞定位注釋

WT_NG 組相比，KO_NG 組心臟組織中上調(diào)蛋白主要位于線粒體、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞核，下調(diào)蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞核；WT_HG 組心臟組織中上調(diào)蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)、線粒體、細(xì)胞外基質(zhì)，下調(diào)蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞外基質(zhì)。與WT_HG 組相比，KO_HG組的心臟組織中上調(diào)蛋白主要位于細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、線粒體，下調(diào)蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞外基質(zhì)。與KO_NG 組相比，KO_HG 組心臟組織中上調(diào)蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)、線粒體，下調(diào)蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)、線粒體、細(xì)胞核。各組間比較差異蛋白亞細(xì)胞定位注釋分類圖見圖3。

圖3 RhoE 敲除前后心臟組織差異蛋白亞細(xì)胞定位注釋Fig 3 Annotation of subcellular localization of differential proteins in cardiac tissues before and after RhoE knockout

2.4 差異表達(dá)蛋白GO 注釋

將篩選的差異蛋白從細(xì)胞組成，分子功能和生物過程3 個(gè)層面進(jìn)行GO 注釋，結(jié)果顯示，與WT_NG 相比，WT_HG 組的心臟組織中上調(diào)蛋白主要分布于過氧化物酶體（peroxisome），下調(diào)蛋白主要分布于核糖體亞單位（ribosomal subunit）；上調(diào)蛋白的分子功能主要集中于共因子結(jié)合（cofactor binding），下調(diào)蛋白的分子功能主要集中于核糖體的結(jié)構(gòu)成分（structural constituent of ribosome）；上調(diào)蛋白主要參與細(xì)胞脂質(zhì)代謝生物過程（peroxisome organization），下調(diào)蛋白主要參與肽段生物合成 過 程（peptide biosynthetic process）（圖4A、B）。與WT_NG 相比，KO_NG 組的心臟組織中上調(diào)蛋白主要分布于免疫球蛋白復(fù)合體（immunoglobulin complex），下調(diào)蛋白主要分布于細(xì)胞外區(qū)域（extracellular region）；上調(diào)蛋白的分子功能主要集中于免疫球蛋白受體結(jié)合（immunoglobulin receptor binding），下調(diào)蛋白的分子功能主要集中于細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（extracellular matrix structure constituent）；上調(diào)蛋白主要參與免疫球蛋白介導(dǎo)的免疫反應(yīng)生物過程（immunoglobulin mediated immune response），下調(diào)蛋白主要參與氨基聚糖生物合成過程（aminoglycan biosynthetic process）（圖4C、D）。與KO_NG 相比，KO_HG 組的心臟組織中上調(diào)蛋白主要分布于過氧化物酶基質(zhì)（peroxisomal matrix），下調(diào)蛋白主要分布于核糖體亞單位（ribosomal subunit）；上調(diào)蛋白的分子功能主要集中于共因子結(jié)合（cofactor binding），下調(diào)蛋白的分子功能主要集中于核糖體結(jié)構(gòu)成分（structural constituent of ribsome）；上調(diào)蛋白主要參與過氧化物酶組成生物過程（peroxisome organization），下調(diào)蛋白主要參與肽段生物合成過程（peptide biosynthetic process）（圖4E、F）。與WT_HG 相比，KO_HG 組的心臟組織中上調(diào)蛋白主要分布于細(xì)胞外空間（extracellular region），下調(diào)蛋白主要分布于胞質(zhì)大核糖體亞基（cytosolic large ribosomal subunit）；上調(diào)蛋白的分子功能主要集中于血小板衍生生長(zhǎng)因子結(jié)合（plateletderived growth factor binding），下調(diào)蛋白的分子功能主要集中于核糖體的結(jié)構(gòu)組成部分（structural constituent of ribosome）；上調(diào)蛋白主要參與血壓調(diào)節(jié)生物過程（regulation of blood pressure），下調(diào)蛋白主要參與中性脂質(zhì)分解生物過程（neutral lipid catabolic process）（圖4G、H）。

圖4 差異表達(dá)蛋白GO 注釋Fig 4 GO annotation of differentially expressed proteins

2.5 差異表達(dá)蛋白KEGG 通路富集分析

將差異表達(dá)蛋白與KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后進(jìn)行差異信號(hào)分析發(fā)現(xiàn)，與WT_NG 組相比，WT_HG 組的心臟組織中上調(diào)的信號(hào)通路主要為過氧化物酶體（rno04146 peroxisome）、細(xì)胞色素P450 對(duì)外源生物代謝的影響（rno00980 metabolism of xenobiotics by cytochrome P450）、花生四烯酸代謝（rno00590 arachidonic acid metabolism）等（圖5A）；下調(diào)的信號(hào)通路主要有核糖體（rno03010 ribosome）、冠狀病毒病- COVID-19（rno05171 coronavirus disease COVID-19）、蛋白質(zhì)消化吸收（rno04974 protein digestion and absorption）等（圖5B）。與WT_NG 組相比，KO_NG 組的心臟組織中上調(diào)的信號(hào)通路為rno04621 nod 樣受體信號(hào)通路（rno04621 NOD-like receptor signaling pathway）（圖5C）；下調(diào)的信號(hào)通路主要為蛋白質(zhì)消化吸收（rno04974 protein digestion and absorption）、血管平滑肌收縮（rono04270 vascular smooth muscle contraction）、松弛素信號(hào)通路（rno04926 relaxin signal pathway）（圖5D）等。與KO_NG 相比，KO_HG 組的心臟組織中上調(diào)的信號(hào)通路主要為萜類主鏈生物合成（rno00900 terpenoid backbone biosynthesis）、花生四烯酸代謝（rno00590 arachidonic acid metabolism）、過氧物酶體（peroxisome）等（圖5E），下調(diào)的信號(hào)通路主要為核糖體（ribosome）、金黃色葡萄球菌感染（staphylococcus aureus infection）、冠狀病毒病- COVID-19（rno05171 coronavirus disease COVID-19）（ 圖 5F）。 與WT_HG 組相比，KO_HG 組的心臟組織中差異表達(dá)蛋白參與的上調(diào)信號(hào)通路主要為蛋白質(zhì)消化吸收（rno04974 protein digestion and absorption），細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用（rno04512 ECM receptor interaction），糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)（rno04933 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complication），下調(diào)信號(hào)通路主要為維生素消化吸收（rno04977 Vitamin digestion and absorption），脂肪消化吸收（fat digestion and absorption），膽固醇代謝（cholesterol metabolism）（圖5G）。

2.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

將KO_HG vs WT_HG 中顯著差異表達(dá)的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)或蛋白序列與STRING 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫(kù)（V.11.0）對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)KO_HG 組與WT_HG 組相比的心臟組織上調(diào)蛋白中Col 1α1、Col 1α2 相互作用的蛋白較多，下調(diào)蛋白中參與核糖體 通 路 的 相 關(guān) 蛋 白（Rps8、Rpl7、Rpl18、Rpl23、Rpl31）在網(wǎng)絡(luò)中的相互作用蛋白較多（圖6）。

圖6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig 6 Analysis of protein interaction network

3 討論

DCM 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。為了解RhoE 在DCM 中的作用，本研究利用RhoE 基因編輯模式動(dòng)物復(fù)制了糖尿病模型，并利用當(dāng)前最新的4D 蛋白組學(xué)進(jìn)行研究，以期為從全局角度剖析RhoE 與DCM 的關(guān)系。

以往利用RhoE 基因編輯細(xì)胞和動(dòng)物模型揭示了許多RhoE 的在心血管系統(tǒng)疾病的新功能［8-11］，本研究首先委托蘇州賽業(yè)公司基于CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)構(gòu)建RhoE 基因敲除雜合子SD 大鼠，進(jìn)一步繁育和鑒定獲得了實(shí)驗(yàn)所需的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，再應(yīng)用經(jīng)典的腹腔注射鏈脲佐菌素誘導(dǎo)成急性1 型糖尿病，該模型的成功復(fù)制為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。隨后分離各組大鼠心臟，采用傳統(tǒng)的酶解法獲得了滿足蛋白組學(xué)所需的蛋白裂解物。通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分離到總的二級(jí)質(zhì)譜譜圖總數(shù)2 067 933 個(gè)，肽段總數(shù)29 739 個(gè)，定蛋白質(zhì)總數(shù)3 597個(gè)，可定量蛋白數(shù)2 931 個(gè)。通過嚴(yán)格的質(zhì)控，本組中肽段長(zhǎng)度、蛋白覆蓋度、蛋白分子量均符合質(zhì)控要求。相關(guān)性分析表明組內(nèi)樣本Person 相關(guān)系數(shù)大于0.99，組間樣本Person 相關(guān)系數(shù)為0.95～0.97，提示本研究所用動(dòng)物組內(nèi)差異很小重復(fù)性好，但組間存在顯著性區(qū)別，提示送檢樣本符合實(shí)驗(yàn)要求。

在鑒定的3 597 個(gè)蛋白中，發(fā)現(xiàn)與WT_NG 組相比，WT_HG 組上調(diào)差異表達(dá)蛋白198 個(gè)，下調(diào)331 個(gè)，代表性的蛋白質(zhì)有Cat、Ftl1、Ighm、Acot2、Pdk4、Myh6、Tuba8、Coq5、Itih2、Serpinh1 等；KO_NG 組上調(diào)差異表達(dá)蛋白26 個(gè)，下調(diào)45 個(gè)，代表性蛋白質(zhì)包括Nit2、Gstz1、Ighm、Igg-2a、S100a8、Myl4、Tagln、Myh11、Mybphl、Myl7 等；與KO_NG相比，KO-HG 上調(diào)蛋白173 個(gè)，下調(diào)255 個(gè)，代表性蛋 白 質(zhì) 包 括Cat、Maoa、Ftl1、Pdk4、Myl4、A1i3、Fgg、Myh6、A1m、Rps9 等；與WT_HG 相 比，KO_HG 明顯上調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)19 個(gè)，明顯下調(diào)差異表達(dá)蛋白質(zhì)28 個(gè)，代表性蛋白質(zhì)包括Postn、Cacna2d2、 Ndufaf1、 Col1a1、 Col1a2、 Ighm、Lgals3bp、Plin2、Abhd16a 和Apoa4 等。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析顯示，非糖尿病狀態(tài)下，RhoE 基因敲除前后蛋白分布改變最明顯的是細(xì)胞骨架（cytoskeleton）、過氧化物酶體（peroxisome）和細(xì)胞核（nucleus）；早期的研究提示RhoE 有調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的功能［7］，本研究結(jié)果也提示RhoE 敲除后顯著改變了細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)。此外，RhoE 敲除前后過氧化物酶體的改變也提示，其與RhoE 與氧化應(yīng)激有關(guān)，這與早期的一篇報(bào)道是一致的［18］。核蛋白分布的改變提示RhoE 參與了基因表達(dá)調(diào)控。有趣的是，糖尿病態(tài)下改變最顯著的分布是質(zhì)膜（plasma membrane）和胞外區(qū)域（extracellular）。研究顯示RhoE 表達(dá)下調(diào)促進(jìn)糖尿病大鼠分泌膠原蛋白Col1a1 和Col1a2，這與胞外區(qū)域的分布改變密切相關(guān)。

差異表達(dá)蛋白GO 注釋分析提示RhoE 敲除后的糖尿病大鼠主要的細(xì)胞外空間成分、相關(guān)血小板衍生生長(zhǎng)因子結(jié)合功能、血壓上調(diào)的生物過程均明顯上調(diào)，而有關(guān)胞質(zhì)大核糖亞基成分、核糖體結(jié)構(gòu)組成功能以及中性脂質(zhì)的分解的生物過程明顯下調(diào)。這與先前報(bào)道的RhoE 與心血管相關(guān)研究是一致的［10］。通過KEGG 分析，本研究發(fā)現(xiàn)KO_NG 組與WT_NG 組相比的心臟組織中差異表達(dá)蛋白參與的信號(hào)通路主要為松弛素信號(hào)通路、黏著斑與PI3K-Akt 信號(hào)通路等。而KO_HG 組與WT_HG組相比心臟組織中差異表達(dá)蛋白參與的信號(hào)通路主要為核糖體、冠狀病毒病- COVID-19 與脂肪消化吸收等。上述均提示RhoE 可能通過這些信號(hào)通路參與DCM 的病理生理過程。其中PI3K-Akt 信號(hào)通路在DCM 中至關(guān)重要，抑制PI3K/Akt 通路的自噬來(lái)改善胰島素抵抗［19］，上調(diào)microRNA-203 可以通過PI3K/Akt 信號(hào)通路的失活靶向PIK3CA，從而 為DCM 治 療 提 供 可 能［20］。另 外，H2 和H3 松 弛素抑制高糖誘導(dǎo)的新生大鼠心室肌細(xì)胞凋亡［21］，內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)的核糖體蛋白（RPS4Y1）可能通過調(diào)節(jié)p38 MAPK 信號(hào)通路導(dǎo)致高糖誘導(dǎo)的功能障礙［22］。此外，脂質(zhì)代謝紊亂在DCM 的發(fā)展中也起非常關(guān)鍵的作用，糾正脂質(zhì)代謝紊亂可減輕糖尿病小鼠的心功能不全［23］。而RhoE 的缺失都會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致上述信號(hào)通路的激活改變，從而對(duì)DCM 的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。這為后期的進(jìn)一步挖掘DCM 發(fā)病的分子機(jī)制提供了可能的方向。另一方面，最新研究表明住院的SARS-CoV-2 感染的2 型糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)急性心血管綜合征，而出現(xiàn)的急性心臟損傷相關(guān)的潛在機(jī)制仍不明確［24］。在本研究中，RhoE 缺乏的糖尿病大鼠的心臟組織中有關(guān)冠狀病毒病-COVID-19 通路被富集，這似乎為COVID-19感染糖尿病患者出現(xiàn)急性心臟損傷的相關(guān)機(jī)制研究提供新思路。

在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析中，發(fā)現(xiàn)KO_HG 組與WT_HG 組相比的心臟組織上調(diào)蛋白中Col 1α1 和Col 1α2 相互作用的蛋白較多，下調(diào)蛋白中，參與核糖體通路的相關(guān)蛋白，在網(wǎng)絡(luò)中的相互作用的蛋白較多，同樣在KO_NG 組與WT_NG 組相比的心臟組織中，得到了互作的蛋白（未發(fā)表資料）。這些信息為闡明DCM 的發(fā)病機(jī)制提供更直觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究存在一定局限性。首先，本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為RhoE 全身敲除的大鼠，并非心臟特異性敲除，因此可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。其次，此樣本為大鼠心臟并非人類，所得結(jié)論應(yīng)用人體研究尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。最后，富集到的相關(guān)蛋白及KEGG 信號(hào)還在驗(yàn)證中。

總之，本研究應(yīng)用最新的4D-LQF 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，首次揭示了RhoE 表達(dá)缺失后在糖尿病心臟組織中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化特征，初步解析了差異表達(dá)蛋白質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)功能，富集了差異表達(dá)蛋白質(zhì)參與的主要信號(hào)通路，研究結(jié)果從宏觀角度上為臨床上DCM 的診斷和治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)參考。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

揭偉，郭峻莉：論文設(shè)計(jì)；伍彩霞，鄒園：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及樣本準(zhǔn)備；趙鋆，施凱佳，吳林栩，陳旭：數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、圖表制作和文獻(xiàn)檢索；趙鋆，施凱佳，申志華，郭峻莉，揭偉：文稿撰寫、基金獲取。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。