基于高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合PLS-DA 的肝復(fù)康丸質(zhì)量控制

蘇 若，李桂女

（1. 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102； 2. 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570100）

肝復(fù)康丸是由五味子、太子參、白花蛇舌草加工而成的復(fù)方丸劑，具有收斂、益氣、解毒、降低轉(zhuǎn)氨酶的功效，常用于急慢性肝炎、早期肝硬化、肝功能不良等癥［1］?！吨腥A人民共和國衛(wèi)生部藥品標準 中藥成方制劑（第七冊）》WS3-B-1146-92 中僅采用薄層色譜法對五味子、太子參、白花蛇舌草做了定性鑒別，以及檢查丸劑通則項下相關(guān)項目［1］。文獻［2 - 3］也僅對五味子單味藥材中的五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等成分做了方法學(xué)研究，方法專屬性低，無法全面、準確地評價肝復(fù)康丸的質(zhì)量。指紋圖譜以高效液相色譜（HPLC）法為分析手段，與指標成分定量分析相結(jié)合，用于評價中藥制劑質(zhì)量的整體性和穩(wěn)定性［4］。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）法是通過主成分分析（PCA）結(jié)合統(tǒng)計軟件，實現(xiàn)分類和篩選差異標志物的目的［5］。中藥指紋圖譜結(jié)合 PLS - DA 和PCA 等化學(xué)模式識別技術(shù)具有直觀性及預(yù)測性等特點，已廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量的控制和評價［6-7］。本研究中采用HPLC 法建立了肝復(fù)康丸的指紋圖譜，并指認出其中11種成分，同時結(jié)合PLS- DA 分析了4 個生產(chǎn)廠家的16 批樣品，為肝復(fù)康丸的質(zhì)量評價提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；XS525型電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團，精度為0.01 mg）；KQ-500DBG型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為450 W，頻率為40 kHz）；QYSW-30A型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

五味子醇甲對照品（批號為110957-202025，含量為99.5%），五味子酯甲對照品（批號為111549 -202006，含量為95.9%），五味子甲素對照品（批號為110763 - 202115，含量為99.1%），五味子乙素對照品（批號為110767-202013，含量為99.6%），槲皮素對照品（批號為100181-202110，含量為99.5%），山柰素對照品（批號為110861 - 202117，含量為95.2%），4 - 香豆酸對照品（批號為112057-202009，含量為99.3%），阿魏酸對照品（批號為110783 - 202111，含量為98.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；太子參環(huán)肽B對照品（批號為200511，含量≥98.1%），車葉草苷對照品（批號為191218，含量≥98.0%），去乙酰車葉草酸酐對照品（批號為1911018，含量≥96.8%），均購自四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；肝復(fù)康丸為市售，其相關(guān)信息見表1。

表1 肝復(fù)康丸樣品信息、生產(chǎn)廠家與規(guī)格Tab.1 Information，manufacturers and specifications of Ganfukang Pills samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［8-10］與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Agilent Ecilipse C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%醋酸溶液（B），梯度洗脫（程序見表2）；流速：0.95 mL/min；檢測波長：203 nm（太子參環(huán)肽B），238 nm（車葉草苷和去乙酰車葉草酸酐），254 nm（五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素），320 nm（阿魏酸和4-香豆酸），369 nm（槲皮素和山柰素）；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，11 個成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對稱因子為0.96～1.06，表明系統(tǒng)適用性良好。

表2 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.2 Program of gradient elution of mobile phase（%）

2.2 溶液制備

分別取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、車葉草苷、去乙酰車葉草苷酸、槲皮素、太子參環(huán)肽B、山柰素、阿魏酸、4-香豆酸對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解成質(zhì)量濃度分別為182.7，236.7，218.3，200.8，240.2，366.8，147.2，198.5，201.2，421.5，202.9 μg/mL 的混合對照品溶液。分別取 16 批樣品，每批5 袋，研細，混勻，取2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入85%甲醇50 mL，密塞，靜置1 h，稱定質(zhì)量，室溫超聲提?。üβ蕿?50 W，頻率為40 kHz）40 min，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用85%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗：取2.2 項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以車葉草苷（14號峰）為參照。結(jié)果26 個共有峰相對保留時間的RSD為0.14%～0.54%（n=6），相對峰面積的RSD為0.28%～0.97%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（編號為A3），按2.2 項下方法制備供試品溶液，室溫下放置0，5，10，15，20，24，48，72 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，以車葉草苷（14號峰）為參照。結(jié)果26 個共有峰相對保留時間的RSD為0.35%～1.09%（n=8），相對峰面積的RSD為0.69%～2.37%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（編號為A3），按2.2 項下方法制備供試品溶液，共6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，以車葉草苷（14號峰）為參照。結(jié)果26個共有峰相對保留時間的RSD為0.77%～1.96%（n=6），相對峰面積的RSD為 0.91%～1.93%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜研究

2.4.1 指紋圖譜及對照指紋圖譜生成與共有峰確定

按2.2 項下方法制備16 批樣品的供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012A 版分析。以A4 為參照圖譜，獲得16 批樣品的HPLC 疊加指紋圖譜。由圖1 可知，共有峰有26個。通過與混合對照品溶液保留時間比對，共標定11 個色譜峰，分別為去乙酰車葉草酸酐（1 號峰）、阿魏酸（5號峰）、4-香豆酸（6號峰）、槲皮素（10號峰）、山柰素（12 號峰）、車葉草苷（14 號峰）、太子參環(huán)肽B（18 號峰）、五味子醇甲（20號峰）、五味子酯甲（22號峰）、五味子甲素（23 號峰）、五味子乙素（24 號峰）。詳見圖2。16 批樣品的相似度分別為0.941，0.939，0.947，0.933，0.956，0.951，0.959，0.953，0.894，0.897，0.900，0.899，0.913，0.916，0.915，0.920，表明樣品質(zhì)量總體穩(wěn)定。

2.4.2 參照峰選擇及相對峰面積和相對保留時間計算

由圖1 和圖2 可知，車葉草苷（14 號峰）峰面積響應(yīng)大且與前后峰分離好，故以車葉草苷為參照。16 批樣品HPLC 疊加指紋圖譜中各共有峰相對保留時間的RSD為0.19%～1.95%，相對峰面積的RSD為1.14%～2.87%。

圖1 16批肝復(fù)康丸高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 16 batches of Ganfukang Pills

圖2 混合對照品溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference solution

2.5 PLS-DA 模型建立與分析

2.5.1 PLS-DA 模型建立

為分析不同廠家樣品的差異性，將26 個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件，啟動PLS - DA 程序，獲得PLS - DA 模型［11］。提取 2 個主成分，行置換檢驗（設(shè)置分類矩陣變量，隨機排列20 次），R2擬合直線和Q2擬合直線在Y坐標軸的截距分別為0.573 和- 0.255，提示所建模型不存在過擬合現(xiàn)象。詳見圖3。

圖3 PLS-DA模型置換檢驗圖Fig.3 Permutation test of PLS-DA

2.5.2 PLS-DA

PLS - DA 模型中所有數(shù)據(jù)點均在95%置信區(qū)間內(nèi)，表明4 個生產(chǎn)廠家樣品的整體質(zhì)量差異不大；同一廠家樣品緊密聚集，各批次間差距小，表明產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定（圖4）。PLS-DA 載荷散點圖中，距離中心離散程度越遠，成分權(quán)重越大，對樣品差異性作用也越大。太子參環(huán)肽B（18 號峰）、五味子醇甲（20 號峰）、車葉草苷（14號峰）、五味子甲素（23號峰）、五味子乙素（24號峰）5 種成分距離中心離散程度較遠（圖5）。10 個色譜峰的變量重要性投影大于1為差異標志物，其中太子參環(huán)肽B、五味子醇甲、車葉草苷、五味子甲素及五味子乙素5 個已知化合物對結(jié)果權(quán)重影響大于50%。詳見圖6。

圖4 4個廠家肝復(fù)康丸的PLS-DA得分散點圖Fig.4 PLS-DA scoring plot of Ganfukang Pills from four manufacturers

圖5 16批肝復(fù)康丸的PLS-DA載荷散點圖Fig.5 PLS-DA loading plot of 16 batches of Ganfukang Pills

圖6 PLS-DA 變量重要性投影值圖Fig.6 Variable importance in the projection plot of PLS - DA

3 討論

3.1 指認指標選擇

肝復(fù)康丸的君藥五味子來源于木蘭科植物五味子的干燥成熟果實，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，其藥理作用為保肝、抗氧化、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。五味子含有木脂素、揮發(fā)油、有機酸、多糖等多種化合物，其中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素在木脂素類成分中含量高［12-13］。太子參藥食兩用，具有健脾益氣、潤肺生津功效，為石竹科孩兒參干燥塊根，廣泛用于治療肝炎、心絞痛及冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等癥，主要活性成分為太子參環(huán)肽類、氨基酸類、脂肪酸類、微量元素類等，且太子參環(huán)肽B 較其他環(huán)肽含量大［14-15］。民間最常用的抗腫瘤中草藥為白花蛇舌草，以全草入藥，味苦、甘，性寒，常用于治療肝炎、咽喉痛、肝癌、胃癌等癥［16-17］，目前從白花蛇舌草中分離出的化學(xué)成分主要有環(huán)烯醚萜類化合物（車葉草苷和去乙酰車葉草酸酐）、黃酮類化合物（槲皮素和山柰素）及有機酸類（阿魏酸和4-香豆酸）等。故本研究中選擇五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、車葉草苷、去乙酰車葉草酸酐、槲皮素、太子參環(huán)肽B、山柰素、阿魏酸、4 - 香豆酸為指認指標，并考察方中指標性成分對不同廠家樣品質(zhì)量穩(wěn)定性的影響［18］。

3.2 色譜條件選擇

曾考察不同檢測波長（190～400 nm），流動相不同溶劑（有機相為甲醇或乙腈，無機相為0.05%磷酸或0.05%醋酸）及同梯度比例，不同柱溫（25，30，35 ℃），不同流速（0.8，0.9，1.0 mL/min），不同超聲提取次數(shù)（1次、2次、3次），不同品牌色譜柱（Kromasil C18柱、Agilent Ecilipse C18柱）及不同品牌高效液相色譜儀（Agilent1260型高效液相色譜儀、UItimate 型高效液相色譜儀）對肝復(fù)康丸HPLC 分析結(jié)果的影響，綜合分析色譜峰的數(shù)量、峰形分離效果，最終確定2.1 項下色譜條件作為肝復(fù)康丸HPLC疊加指紋圖譜的分析條件。

3.3 方法評價

建立的HPLC 指紋圖譜操作簡單、準確、重復(fù)性好，與PLS- DA 技術(shù)結(jié)合，可為肝復(fù)康丸的質(zhì)量標準提升提供參考。