小檗堿聯(lián)合復(fù)方左炔諾孕酮對多囊卵巢綜合征及腸道菌群的影響

陳 琛，蘇圣梅，曾薇薇，劉 剴，都紅蕾

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院婦科，廣東 深圳 518028)

多囊卵巢綜合征(PCOS)為育齡期女性常見的生殖內(nèi)分泌疾病，以月經(jīng)異常、持續(xù)少排卵或無排卵、高雄激素樣表現(xiàn)、胰島素抵抗(IR)等為主要特征，發(fā)病率為8%～13%[1]，可致不孕、肥胖、多毛、月經(jīng)不調(diào)等，同時還會增加代謝綜合征、心血管疾病、心理障礙及子宮內(nèi)膜疾病等遠(yuǎn)期風(fēng)險[2]，嚴(yán)重影響女性身心健康。PCOS發(fā)病機(jī)制目前尚存在較大爭議，既往研究認(rèn)為其與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激、IR/高胰島素血癥、下丘腦-垂體軸功能紊亂等密切相關(guān)[3-4]。目前，臨床治療藥物以調(diào)節(jié)生殖激素及胰島素水平的雌激素、孕激素、促排卵藥及二甲雙胍等為主。最新研究證實，腸道菌群異常參與了包括PCOS在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，腸道菌群可通過影響雄激素代謝、誘導(dǎo)IR及炎性反應(yīng)等途徑在PCOS的病因中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5]。小檗堿為毛茛科黃連屬植物黃連的根狀莖中提取的活性成分，臨床主要用于抗腸道感染，近年來的研究發(fā)現(xiàn)其同時還具有良好的降糖、降脂、調(diào)節(jié)代謝、改善IR等作用[6]。本研究將小檗堿聯(lián)合復(fù)方左炔諾孕酮用于治療PCOS，并觀察了其療效及對患者腸道菌群的影響，以期為臨床治療PCOS提供一種新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年7月至2021年6月本院婦科收治的90例PCOS患者，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和觀察組，每組45例。PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)：參考鹿特丹ESHRE/ASRM[7]中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，下述滿足任意2項即可確診：(1)超聲檢查提示卵巢增大、多囊樣改變，卵巢體積大于10 cm3或直徑2～9 mm的卵泡多于12個；(2)稀發(fā)排卵或無排卵；(3)高雄激素樣表現(xiàn)或高雄血癥。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診為PCOS；(2)入組前3個月內(nèi)未接受過激素類藥物、益生菌、抗生素或免疫抑制劑治療；(3)無其他內(nèi)科合并癥；(4)未處于哺乳或妊娠期。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他可致激素水平異常疾病，如甲狀腺疾病、先天性腎上腺皮質(zhì)增生、高泌乳血癥等；(2)近期接受過胃腸道手術(shù)，或急慢性腸炎、胃腸道疾??；(3)嚴(yán)重心肺肝腎功能不全；(4)惡性腫瘤病史；(5)對本研究用藥過敏；(6)未能完成整個療程而中斷治療。2組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有患者均自愿參與并簽署知情同意書。

表1 2組患者一般資料比較

1.2方法

1.2.1治療方法 2組患者在治療期間均進(jìn)行飲食調(diào)節(jié)、運(yùn)動鍛煉、減脂減重、調(diào)整生活方式等非藥物基礎(chǔ)治療。對照組口服復(fù)方左炔諾孕酮片(華潤紫竹藥業(yè)有限公司，0.15毫克/片，國藥準(zhǔn)字：H11020047)，于月經(jīng)周期第1天開始，每天1次口服標(biāo)有相應(yīng)日期的淡黃色藥片，按箭頭所指方向依次服用，服用完21片淡黃色藥片后再依次服用7片淡粉色藥片，服用完所有28片藥片后再按上述順序繼續(xù)服用新的1盒藥片，連續(xù)服用3個月經(jīng)周期。觀察組在對照組基礎(chǔ)上聯(lián)合小檗堿片(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，0.1克/片，國藥準(zhǔn)字：H44020757)，每天3次，每次3片，連續(xù)服用3個月經(jīng)周期。

1.2.2觀察指標(biāo) (1)臨床療效。參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[8]中的標(biāo)準(zhǔn)評價治療后的臨床療效，①顯效：患者痤瘡、排卵不暢等主要臨床癥狀基本消失，月經(jīng)末期的月經(jīng)量明顯減少；②有效：痤瘡、排卵不暢等主要臨床癥狀有所緩解，主要指標(biāo)有所改善；③無效：主要臨床癥狀無改善甚至加重?？傆行?(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。(2)血清激素指標(biāo)。清晨采集患者空腹肘靜脈血10 mL，離心取上層血清，采用化學(xué)發(fā)光法檢測其中促黃體生成素(LH)、促卵泡素(FSH)、睪酮(T)、雌二醇(E2)、性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)和硫酸脫氫表雄酮(DHEAs)水平，計算LH/FSH比值和游離雄性激素指數(shù)(FAI)，于月經(jīng)周期的第1～5天內(nèi)完成上述檢測，其中FAI=T/SHBG×100。(3)糖脂代謝指標(biāo)。取患者血清，采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖(FBG)，采用化學(xué)發(fā)光法測定空腹胰島素(FINS)，應(yīng)用全自動生化儀(美國Beckman Coulter公司)檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平,并計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，其中HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。(4)血清炎癥因子指標(biāo)。取患者血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平，試劑盒購自美國BioTSZ公司，全自動酶聯(lián)免疫分析儀購自美國Beckman Coulter公司，所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。(5)腸道菌群分布情況。分別于入組時和治療結(jié)束后，采用無菌糞便標(biāo)本采集套裝(深圳達(dá)云基因科技有限公司，型號：ML-001A)收集患者糞便標(biāo)本，避開經(jīng)期。采用DNA提取試劑盒(美國MPbio公司)提取糞便標(biāo)本中總DNA，測定總DNA水平，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增16S rRNA的V1～V3區(qū)，引物為338F(序列：5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC A-3′)和806R(序列：5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min、95 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、70 ℃ 60 s，共25個循環(huán)，最終72 ℃延伸7 min。采用Illumina MiSeq高通量平臺進(jìn)行測序，對超過97%相似性的產(chǎn)物進(jìn)行同源比對并聚類為可操作分類單元，采用線性判別分析對菌群樣本進(jìn)行α多樣性分析，包括豐度、均勻度、Shannon-Wiener指數(shù)和最大Shannon-Wiener指數(shù)。(6)安全性。記錄患者發(fā)生的并發(fā)癥及不良反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.12組臨床療效比較 觀察組治療后總有效率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.036)。見表2。

表2 2組臨床療效比較

2.22組血清激素指標(biāo)比較 治療前，2組各項血清激素水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組治療后血清T、LH、LH/FSH、DHEAs、FAI及SHBG水平優(yōu)于治療前，且觀察組各指標(biāo)優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組血清激素指標(biāo)比較或M(P25～P75)，n=45]

組別SHBG(nmol/L)治療前治療后E2(pmol/L治療前治療后DHEAs(ng/mL)治療前治療后FAI治療前治療后對照組1.41±0.181.62±0.21a55.93(28.43～78.69)52.74(27.61～71.69)255.32±40.84205.43±30.582.09±0.531.12±0.29a觀察組1.43±0.171.83±0.22ab56.78(29.99～88.92)54.81(28.23～77.65)251.35±38.98183.34±26.652.05±0.630.85±0.20ab

2.32組糖脂代謝指標(biāo)比較 2組治療前糖脂代謝指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組治療后FBG、FINS、HbA1c、HOMA-IR、TG和HDL-C水平低于治療前，且觀察組各指標(biāo)(HbA1c除外)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組糖脂代謝指標(biāo)比較

組別TC(mmol/L)治療前治療后TG(mmol/L)治療前治療后HDL-C(mmol/L)治療前治療后LDL-C(mmol/L)治療前治療后對照組4.41±0.584.32±0.411.52±0.311.22±0.21a1.62±0.841.33±0.58a2.59±0.532.53±0.49觀察組4.43±0.574.29±0.321.49±0.401.05±0.20ab1.65±0.881.14±0.55ab2.55±0.592.49±0.40

2.42組炎癥因子指標(biāo)比較 2組治療前TNF-α、hs-CRP和IL-6比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組治療后TNF-α、hs-CRP和IL-6水平低于治療前，且觀察組各指標(biāo)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 2組炎癥因子指標(biāo)比較

2.52組腸道菌群變化情況比較 2組治療前乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸桿菌和腸球菌菌落數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組治療后乳酸桿菌和雙歧桿菌菌落數(shù)明顯高于治療前，而腸桿菌菌落數(shù)明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。觀察組治療后乳酸桿菌和雙歧桿菌菌落數(shù)高于對照組，而腸桿菌菌落數(shù)低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 2組腸道菌群變化情況比較

2.62組腸道菌群多樣性比較 2組治療前腸道菌群多樣性參數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。2組治療后腸道菌群豐度、Shannon-Wiener指數(shù)和最大Shannon-Wiener指數(shù)高于治療前，且觀察組腸道菌群豐度、Shannon-Wiener指數(shù)高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表7。

表7 2組腸道菌群多樣性比較

2.72組不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 2組不良反應(yīng)發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.080，P=0.777)。見表8。

表8 2組不良反應(yīng)發(fā)生情況比較[n(%)]

3 討 論

PCOS是育齡期女性常見的內(nèi)分泌紊亂綜合征，以糖脂代謝異常和生殖內(nèi)分泌激素水平紊亂為主要表現(xiàn)，對育齡期女性的生殖、代謝和心理健康均造成了嚴(yán)重影響[9]。復(fù)方左炔諾孕酮為炔雌醇和左炔諾孕酮的復(fù)方制劑，是目前臨床治療PCOS的一線用藥之一，其中炔雌醇為雌激素類藥物，可通過刺激垂體合成和分泌促性腺激素而降低血清中游離睪酮水平，左炔諾孕酮為全合成強(qiáng)效孕激素，具有較強(qiáng)抗雌激素活性和蛋白同化作用，故該復(fù)方制劑具有調(diào)節(jié)月經(jīng)、改善宮頸黏液稠度、抑制子宮內(nèi)膜增生、預(yù)防子宮內(nèi)膜癌等作用[10]。已有諸多學(xué)者研究證實，復(fù)方左炔諾孕酮對PCOS療效確切，可顯著改善患者生殖內(nèi)分泌激素和胰島素水平異常，調(diào)節(jié)血糖和血脂水平，提高排卵率及妊娠率[11-12]。

隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，腸道菌群在人體營養(yǎng)攝取、生長發(fā)育、生化代謝、抵御病原及免疫調(diào)控等生理過程中所扮演的重要角色逐漸被認(rèn)知。腸道菌群因數(shù)量龐大、生理功能廣泛，被稱為“人類第二基因組”，其與人體基因組共同通過與外界環(huán)境相互作用而影響人體的生理和病理過程。一旦腸道菌群失調(diào)，機(jī)體便可能出現(xiàn)多種病理性變化，如炎性腸病、代謝紊亂等，并可通過“腸-腦”軸、“腸肝”軸、“腸-骨”軸等與遠(yuǎn)端臟器組織發(fā)生關(guān)聯(lián)，誘發(fā)或促進(jìn)包括心血管疾病、代謝綜合征、全身免疫系統(tǒng)疾病等在內(nèi)的多種疾病[13]。腸道菌群與PCOS的關(guān)系已成為目前的研究熱點之一。目前研究普遍認(rèn)為，腸道菌群失衡可誘導(dǎo)生殖激素水平異常、IR及慢性炎癥等，從而與PCOS發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14]。一項基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，來曲唑誘導(dǎo)PCOS模型小鼠腸道菌群出現(xiàn)多樣性改變，且與睪酮水平呈負(fù)相關(guān)[15]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，PCOS患者腸道菌群存在多樣性和特定物種結(jié)構(gòu)的差異，且特定菌群豐度差異與PCOS臨床特征有關(guān)，提示腸道菌群與PCOS發(fā)生、發(fā)展存在緊密聯(lián)系[16]。根據(jù)腸道菌群與宿主的關(guān)系，可分為有益菌群(如乳酸桿菌、雙歧桿菌等)、條件致病菌(如腸桿菌、腸球菌等)和有害菌群(如葡萄球菌、沙門氏菌屬等)，有益菌群具有促進(jìn)消化吸收、增強(qiáng)免疫等功能，而有害菌群可導(dǎo)致腸道功能紊亂、引發(fā)感染。腸道菌群失調(diào)可引發(fā)腸道炎性反應(yīng)，導(dǎo)致腸道黏膜通透性增加，使得腸道中乳酸桿菌、雙歧桿菌等優(yōu)勢菌種豐度下降及腸桿菌、腸球菌等條件致病菌種豐度增加，從而增加腸道內(nèi)毒性物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)，激活宿主免疫系統(tǒng)，造成抗原-抗體反應(yīng)，引發(fā)慢性炎性反應(yīng)。而慢性炎癥狀態(tài)又可導(dǎo)致胰島素受體功能受損，進(jìn)而造成體內(nèi)胰島素水平異常，并同時增加卵巢雄激素分泌，進(jìn)一步導(dǎo)致卵巢功能異常，加重卵巢細(xì)胞凋亡，從而形成惡性循環(huán)[17]。

小檗堿為黃連中提取的主要有效成分，在臨床上長期用于清熱、解毒和抗腸道感染等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿還具有調(diào)節(jié)血糖和血脂、抗炎、抗腫瘤、改善IR及調(diào)節(jié)代謝等作用[18]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，小檗堿可通過改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，降低大鼠腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門等多糖菌屬豐度，抑制多糖降解，從而降低血糖和血脂水平；同時還可增加腸道內(nèi)生產(chǎn)短鏈脂肪酸(SCFA)菌群豐度，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，減輕對宿主的抗原負(fù)荷，緩解系統(tǒng)性炎性反應(yīng)，降低代謝性內(nèi)毒素血癥，從而起到改善IR的作用[19]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)小檗堿具有胰島素增敏作用，可降低葡萄糖攝取量，改善卵巢糖代謝異常，其機(jī)制可能與逆轉(zhuǎn)胰島素信號分子蛋白激酶B-2、糖原合成酶激酶3β、ERK mRNA的表達(dá)，抑制17a-羥化酶、微小染色體維持蛋白-2 mRNA的表達(dá)有關(guān)。關(guān)于分子層面的研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可增加子宮內(nèi)膜組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)，改善胰島素信號通路，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜增殖、分化和蛻膜化，從而改善PCOS患者IR狀態(tài)[20]。李慕白等[20]臨床研究發(fā)現(xiàn),小檗堿具有調(diào)節(jié)部分激素水平作用，可降低PCOS患者DHEAs、LH、T等水平，提高排卵率，并可改善PCOS患者IR水平，降低患者BMI、腰臀比、LDL-C、TC和TG。本研究結(jié)果顯示，2組患者經(jīng)治療后均取得了良好的療效,患者乳酸桿菌和雙歧桿菌菌落數(shù)均顯著升高，而腸桿菌菌落數(shù)顯著降低；觀察組治療后乳酸桿菌和雙歧桿菌菌落數(shù)高于對照組，而腸桿菌菌落數(shù)低于對照組；2組治療后α多樣性參數(shù)均顯著改善，且觀察組更優(yōu)。提示小檗堿與復(fù)方左炔諾孕酮聯(lián)用可使腸道菌群穩(wěn)態(tài)得以恢復(fù)，菌群多樣性得到改善，且單用復(fù)方左炔諾孕酮也達(dá)到了調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)和多樣性的效果，因此腸道菌群與PCOS之間可能存在相互作用，互為因果。

PCOS患者由于下丘腦-垂體-卵巢功能紊亂，垂體大量分泌LH，引發(fā)雄性激素大量分泌，導(dǎo)致患者呈現(xiàn)高LH/FSH比率和高雄性激素生理特征，進(jìn)而導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常，無優(yōu)勢卵泡形成；而長期無規(guī)律的LH高表達(dá)又可抑制FSH的分泌，導(dǎo)致LH/FSH比值進(jìn)一步增大，形成高雄性激素和無排卵的惡性循環(huán)[21]。既往研究認(rèn)為，腸道菌群可通過“腸-腦”軸影響LH和FSH分泌，導(dǎo)致雄性激素合成和分泌增加[22]。此外，腸道菌群還可通過SCFA與游離脂肪酸受體2相結(jié)合而抑制食欲刺激素的表達(dá)，導(dǎo)致雄性激素水平的升高。本研究結(jié)果顯示，2組治療后糖脂代謝指標(biāo)及血清T、LH、LH/FSH、DHEAs和FAI水平均顯著改善，且觀察組優(yōu)于對照組。提示2組的治療方案均可顯著改善PCOS患者糖脂代謝異常和生殖激素水平紊亂，且小檗堿與復(fù)方左炔諾孕酮聯(lián)合用藥的改善效果更為顯著。

PCOS是一種慢性低度炎癥相關(guān)性疾病。PCOS患者胰島素靶組織、脂肪組織中通常聚集大量的促炎巨噬細(xì)胞，可分泌大量促炎因子，如TNF-α、IL-6等，造成患者機(jī)體處于慢性低度炎癥狀態(tài)，而這種慢性低度炎癥狀態(tài)又可反過來通過干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、降低胰島素敏感性等途徑引發(fā)IR[23]。既往研究認(rèn)為，腸道菌群可通過脂多糖(LPS)、SCFA、支鏈氨基酸(BCAA)和膽汁酸等介導(dǎo)慢性低度炎性反應(yīng)，LPS可通過LPS結(jié)合蛋白、CD14、骨髓分化因子傳遞，與Toll樣受體4相結(jié)合，激活下游信號通路，促進(jìn)炎癥因子如TNF-α、IL-6等表達(dá)[24]。本研究結(jié)果顯示，2組治療后TNF-α、hs-CRP和IL-6水平均顯著降低，且觀察組降低較為明顯；與此同時，2組腸道菌群紊亂和多樣性改變均明顯改善，且觀察組優(yōu)于對照組。提示小檗堿可通過改善腸道菌群而對PCOS發(fā)揮良好療效。本研究結(jié)果顯示，觀察組加服小檗堿片并未增加不良反應(yīng)發(fā)生率，提示其安全性良好。

綜上所述，小檗堿與復(fù)方左炔諾孕酮聯(lián)合用藥可有效提高治療PCOS的療效，顯著改善患者生殖激素水平失調(diào)、糖脂代謝異常、慢性低度炎癥狀態(tài)，其機(jī)制可能與小檗堿改善腸道菌群紊亂有關(guān)。本研究樣本量較小，且未排除地域、飲食習(xí)慣、生活環(huán)境等對腸道菌群的影響，可能導(dǎo)致結(jié)果偏差，今后仍需增加樣本量進(jìn)行大規(guī)模、多中心的臨床研究以進(jìn)一步驗證。