circMRPS35和KAT7在胃癌組織中的表達及預后評估價值*

黃燦坡，王 琳，林建泉，王建鋒，張誠華

中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第910醫(yī)院普外科，福建泉州 362000

胃癌是常見的胃腸道惡性腫瘤，全球每年因胃癌死亡病例高達73萬[1]。胃癌早期癥狀不明顯，許多患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，即使經(jīng)過積極治療，5年生存率仍不足30%[2-3]。環(huán)狀RNA MRPS35(circMRPS35)是近年來發(fā)現(xiàn)的新的環(huán)狀RNA(circRNA)，具有表達豐富、序列保守及較高的組織特異性的特點[4-5]。研究表明，circMRPS35能夠通過調(diào)節(jié)突觸融合蛋白3的表達，泛素化降解磷酸酶和張力蛋白同源物，進而促進腫瘤的惡性進展[6]。賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶7(KAT7)具有組蛋白H4特異性乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，其在結(jié)直腸癌等惡性腫瘤中表達上調(diào)，通過表觀遺傳學修飾(如甲基化、乙酰化等)調(diào)控癌基因的表達，促進腫瘤的惡性增殖[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，circMRPS35能夠作為分子支架，招募KAT7至下游基因(如插頭框O1基因)的啟動子區(qū)域，調(diào)控腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移[8]。本研究對胃癌組織中circMRPS35和KAT7的表達情況進行了檢測，并探討其在胃癌預后評估中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年2月至2019年2月本院診治的88例胃癌患者為研究對象，其中男50例，女38例；年齡55～77歲，平均(62.3±5.1)歲；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例；腫瘤最大徑≤5 cm 54例，>5 cm 34例；腫瘤位置：位于胃底/胃體部者26例，位于幽門/胃竇部者62例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ期23例；分化程度：高/中分化48例，低分化40例。納入標準：根據(jù)術(shù)后病理組織學檢查結(jié)果明確診斷為胃癌(由2名病理科醫(yī)師共同閱片確診)；初診患者，無腫瘤治療史；患者精神狀態(tài)良好，能夠配合檢查及治療。排除標準：臨床病理資料不完整；伴中重度臟器功能衰竭；合并胃腸道細菌感染性疾病。所有研究對象出院后定期隨訪，每3個月電話隨訪1次，連續(xù)隨訪3年，隨訪內(nèi)容為患者生存情況，隨訪截止時間為2022年2月，隨訪終點為隨訪結(jié)束或患者死亡。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審核通過。

1.2實時熒光定量PCR檢測circMRPS35和KAT7 mRNA表達水平 應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測患者胃癌組織及癌旁組織(距胃癌邊緣2 cm以上)標本中circMRPS35和KAT7 mRNA的表達。應(yīng)用RNAiso Plus試劑(日本，TaKaRa公司)提取組織總RNA，采用微量分光光度計檢測RNA的濃度和純度。使用PrimeScript RT Reagent Kit(日本，TaKaRa公司)將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq II(日本，TaKaRa公司)和ABI 7500 StepOne Plus系統(tǒng)(美國，Applied Biosystems公司)通過實時熒光定量PCR檢測circMRPS35和KAT7 mRNA的表達。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，70 ℃ 30 s，35個循環(huán)。反應(yīng)總體系為10 μL，包括模板1 μL，上、下游引物各1 μL，SYBR Premix 5 μL，去離子水2 μL。檢測結(jié)果采用2-ΔΔCt法表示。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3免疫組織化學法檢測KAT7蛋白表達 將胃癌及癌旁組織標本置于4%中性甲醛固定液中固定24 h，石蠟包埋后切片，烘箱60 ℃ 2 h烘干；二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟2次，每次10 min；梯度乙醇水化，每次5 min；采用高壓鍋法進行抗原熱修復2 min，自然冷卻；3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶,室溫下30 min；5%羊血清封閉30 min；一抗4 ℃孵育過夜 (兔抗人KAT7單克隆抗體購自Abcam公司，批號ab240315，稀釋比為1∶500)；羊抗兔二抗37 ℃孵育1 h；辣根過氧化物酶標記的三抗37 ℃孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色5 min，蘇木素復染1 min;梯度乙醇脫水，中性樹脂封片。高倍鏡下觀察，對免疫組織化學法染色結(jié)果進行評分[9]，不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分，評分≥2分判定為陽性。

2 結(jié) 果

2.1胃癌組織和癌旁組織中circMRPS35和KAT7 mRNA表達水平比較 胃癌組織和癌旁組織中circMRPS35表達水平分別為0.813±0.150、1.913±0.361，KAT7 mRNA表達水平分別為3.026±0.382、1.021±0.263。與癌旁組織相比，胃癌組織中circMRPS35表達水平明顯降低(t=110.884，P<0.001)，KAT7 mRNA表達水平明顯升高(t=110.884，P<0.001)。

2.2胃癌組織中circMRPS35和KAT7 mRNA表達水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，胃癌組織中circMRPS35表達水平與KAT7 mRNA表達水平呈負相關(guān)(r=-0.504，P<0.001)。

2.3胃癌組織和癌旁組織中KAT7蛋白表達情況比較 KAT7蛋白染色呈棕黃色位于細胞核，見圖1。胃癌組織中KAT7蛋白陽性率為70.5%(62/88)，明顯高于癌旁組織的13.6%(12/88)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=58.294，P<0.001)。

2.4胃癌組織中circMRPS35和KAT7 mRNA表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 不同TNM分期患者胃癌組織中circMRPS35、KAT7 mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同性別、年齡、腫瘤最大徑、腫瘤位置、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者胃癌組織中circMRPS35、KAT7 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.5胃癌組織中circMRPS35、KAT7 mRNA表達水平對患者生存預后的影響 所有患者隨訪時間為2～36個月，平均(26.6±3.5)個月，死亡27例，失訪2例，3年總體生存率為68.6%(59/86)。分別以circMRPS35、KAT7 mRNA表達水平均值0.813、3.026為界，分為circMRPS35高表達組(n=42)和低表達組(n=44)，KAT7 mRNA高表達組(n=43)和低表達組(n=43)。circMRPS35低表達組患者3年總體生存率為50.0%(22/44)，明顯低于高表達組患者的88.1%(37/42)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.163，P<0.001)。KAT7 mRNA高表達組患者3年總體生存率為48.8%(21/43)，明顯低于低表達組患者的88.4%(38/43)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.321，P<0.001)，見圖2。

圖1 胃癌組織與癌旁組織中KAT7蛋白表達情況(×200)

表2 胃癌組織中circMRPS35、KAT7 mRNA表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

續(xù)表2 胃癌組織中circMRPS35、KAT7 mRNA表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：A為circMRPS35高、低表達患者的Kaplan-Meier生存曲線；B為KAT7 mRNA高、低表達患者的Kaplan-Meier生存曲線。圖2 胃癌組織中circMRPS35、KAT7 mRNA高、低表達患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.6單因素及多因素Cox回歸分析影響胃癌患者預后的危險因素 以胃癌患者的生存情況作為因變量(1=死亡，0=存活)，納入性別(1=女，0=男)、年齡(1=≥60歲，0<60歲)、腫瘤位置(1=幽門/胃竇部，0=胃底/胃體部)、腫瘤最大徑(1=>5 cm，0=≤5 cm)、分化程度(1=低分化，0=高/中分化)、TNM分期(1=Ⅲ期，0=Ⅰ～Ⅱ期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(1=有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，0=無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)、circMRPS35(1=低表達，0=高表達)、KAT7 mRNA(1=高表達，0=低表達)為自變量進行單因素COX回歸分析，將差異有統(tǒng)計學意義的指標又納入多因素Cox回歸分析模型，結(jié)果顯示，胃癌組織中circMRPS35低表達、KAT7 mRNA高表達、TNM分期為Ⅲ期是胃癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，見表3、4。

表3 影響胃癌患者預后的單因素Cox回歸分析結(jié)果

表4 影響胃癌患者預后的多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討 論

2020年我國胃癌新發(fā)病例數(shù)為34.6萬，發(fā)病率達24.3/10萬，且發(fā)病率有逐漸增高的趨勢[10]。近年來，隨著對胃癌發(fā)病機制研究的不斷深入，新開發(fā)的治療藥物，如免疫檢查點抑制劑及分子靶向藥物等，改善了患者的遠期生存狀況[11]。但治療過程中仍然存在治療不敏感或治療一段時間后出現(xiàn)治療抵抗的現(xiàn)象。因此，尋找與胃癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的新機制，對于敏感治療藥物的研發(fā)、實現(xiàn)胃癌的個體化治療等意義重大。

circRNA是具有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的新型RNA分子，主要位于細胞質(zhì)中，少部分位于細胞核中。近年來研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可以充當微小RNA的分子海綿或內(nèi)源性競爭RNA，進而調(diào)控靶基因的表達；也可與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，從而調(diào)節(jié)特定蛋白的表達；其還具有參與蛋白翻譯等功能，從而間接參與一些疾病的發(fā)生、發(fā)展過程[12]。circMRPS35是近年來新發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤調(diào)控功能的RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)，circMRPS35能夠通過抑制抑癌基因PTEN的表達，促進肝癌的進展[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中circMRPS35表達水平較癌旁組織明顯降低(P<0.05)。既往研究利用二代測序?qū)ξ赴┙M織及癌旁組織中差異性表達的circRNA進行篩選，結(jié)果也表明胃癌組織中circMRPS35表達下調(diào)[7]，與本研究利用實時熒光定量PCR檢測結(jié)果一致。目前，胃癌組織中circMRPS35表達下調(diào)的機制尚不清楚，可能與胃癌組織中N6-甲基腺苷(m6A)對circMRPS35修飾后促進其降解有關(guān)。研究表明，胃癌組織中m6A修飾參與circRNA的轉(zhuǎn)錄和降解調(diào)控，circMRPS35被m6A修飾后，核糖核酸內(nèi)切酶能夠特異性識別并降解circMRPS35，導致circMRPS35表達水平顯著降低[13]。此外，本研究中TNM分期為Ⅲ期患者的胃癌組織中circMRPS35表達水平較Ⅰ～Ⅱ期患者低，表明胃癌組織中circMRPS35的低表達可能參與促進胃癌的進展。研究發(fā)現(xiàn)，p21、p27作為細胞周期激酶抑制因子，抑制細胞周期G1期/S期轉(zhuǎn)換，而circMRPS35通過促進腫瘤細胞中抑癌基因p21、p27的表達發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用，并通過促進E-鈣黏蛋白的表達抑制腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[7]。進一步分析發(fā)現(xiàn)，circMRPS35低表達的胃癌患者3年總體生存率更低，并且circMRPS35低表達是胃癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，提示檢測胃癌組織中circMRPS35的表達水平有助于判斷胃癌患者臨床預后，circMRPS35可作為新的預后判斷標志物。

KAT7是 MYST乙酰轉(zhuǎn)移酶家族成員，該家族成員還包括MOZ、Ybf1/Sas3、Sas2和Tip60，參與組蛋白H4和 H3K14的乙?；揎棥Ｑ芯勘砻?，KAT7在人類肝細胞癌[14]、膀胱癌[15]及卵巢癌[16]等多種惡性腫瘤中異常表達率增加，并通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路促進腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)移。本研究表明，胃癌組織中KAT7 mRNA表達水平和蛋白陽性率均較癌旁組織升高，其原因一方面可能與參與KAT7 mRNA轉(zhuǎn)錄后穩(wěn)定性調(diào)控的微小RNA-639表達水平降低有關(guān)，腫瘤中微小RNA-639表達水平降低導致KAT7 mRNA穩(wěn)定性增加，進而促進下游Wnt/β-catenin信號通路的激活，導致腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強[17]；另一方面，KAT7蛋白表達的穩(wěn)定性也受到泛素化的修飾調(diào)節(jié)。研究表明，胃癌發(fā)生時泛素化復合體不能泛素化降解KAT7蛋白，KAT7蛋白不能進入蛋白酶體途徑進行降解，而KAT7蛋白的過度表達能夠顯著激活絲裂原活化的蛋白激酶信號通路，促進腫瘤細胞的增殖[18]。此外，本研究中胃癌組織KAT7 mRNA表達水平與TNM分期有關(guān)，提示KAT7表達上調(diào)促進了胃癌的進展。研究表明，KAT7磷酸化激活后能夠結(jié)合細胞周期素激酶1，促進腫瘤細胞的有絲分裂，而利用RNA干擾技術(shù)抑制KAT7的表達后，可抑制腫瘤細胞的惡性增殖，進一步證實了KAT7表達上調(diào)對腫瘤增殖的促進作用[19-20]。此外，胃癌組織中KAT7 mRNA高表達是胃癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，表明KAT7可能有潛力作為新的胃癌預后判斷標志物，針對以KAT7為靶點的治療可能有利于改善胃癌患者的預后，值得臨床深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中circMRPS35表達水平與KAT7 mRNA表達水平呈負相關(guān)(r=-0.504，P<0.001)。JIE等[8]研究表明，circMRPS35能夠作為分子支架，招募并結(jié)合KAT7，誘導下游周期調(diào)控蛋白p21的表達，發(fā)揮阻滯細胞周期，抑制腫瘤惡性增殖的功能。因此，胃癌組織中circMRPS35表達水平降低導致其不能結(jié)合KAT7，細胞核中KAT7表達水平升高并激活下游信號通路，促進胃癌進展，但目前二者之間的作用機制尚不清楚，需要進一步研究。本研究通過單因素及多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，circMRPS35低表達、KAT7 mRNA高表達、TNM分期為Ⅲ期是胃癌患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。臨床上可以通過檢測胃癌組織中circMRPS35、KAT7 mRNA的表達水平對胃癌患者的預后進行評估，對不同評估結(jié)果的胃癌患者制訂個體化的治療及隨訪方案，以改善患者預后。

綜上所述，胃癌組織中circMRPS35表達水平降低，而KAT7 mRNA表達水平及蛋白陽性率升高。circMRPS35低表達、KAT7 mRNA高表達、TNM分期為Ⅲ期是胃癌患者預后的獨立危險因素。但限于本研究樣本量較小，未對不同臨床特征的患者群體進行分層分析，有待今后開展前瞻性的臨床研究深入探索。