不同核酸提取及擴(kuò)增系統(tǒng)組合檢測(cè)新型冠狀病毒核酸的效能比較*

李卓敏，張昕雨，于 洋，張 磊，王新宇，杜金龍，王志陽(yáng)，譚延國(guó)△

1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100038;2.首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)系，北京 100038

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情在我國(guó)仍在持續(xù)，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)RNA檢測(cè)仍是常態(tài)化疫情防控的首選手段，且為疑似病例診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]。隨著經(jīng)驗(yàn)的積累和技術(shù)的進(jìn)步，采用熒光定量PCR檢測(cè)SARS-CoV-2 RNA時(shí)單次實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率已從30%～50%提升至88%[2-3]，但如何進(jìn)一步提高檢測(cè)質(zhì)量和效能，仍是抗疫工作面臨的重要問(wèn)題之一。國(guó)務(wù)院印發(fā)的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè)(試行第二版)》規(guī)定，各醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)選用核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒指定的核酸提取試劑及擴(kuò)增設(shè)備等，并對(duì)各檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行必要的性能驗(yàn)證[4]。目前，核酸提取試劑及設(shè)備多為配套系統(tǒng)，但不同的擴(kuò)增試劑及擴(kuò)增設(shè)備多為搭配使用。首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室所使用的不同核酸提取設(shè)備和試劑、核酸擴(kuò)增設(shè)備和試劑構(gòu)成了多個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)，本研究通過(guò)回顧性分析陰性標(biāo)本內(nèi)標(biāo)基因(IC基因)以及弱陽(yáng)性質(zhì)控品N、O、IC基因的Ct值，試圖進(jìn)一步評(píng)估不同核酸提取及擴(kuò)增系統(tǒng)組合使用對(duì)SARS-CoV-2 RNA檢測(cè)效能的影響。

1 材料與方法

1.1人源性標(biāo)本 所有IC基因的Ct值均收集自2021年12月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)?fù)興醫(yī)院SARS-CoV-2核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)SARS-CoV-2 RNA為陰性的受檢者的標(biāo)本，共3 496份，均為單管采集的口咽拭子標(biāo)本。

1.2儀器與試劑

1.2.1提取系統(tǒng) 均為全自動(dòng)磁珠法，分別為32通道的Smart32核酸提取儀及配套試劑盒(檢測(cè)總耗時(shí)32 min，購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，以下稱(chēng)為提取系統(tǒng)a)，96通道的Autra9600核酸提取儀及配套試劑盒(檢測(cè)總耗時(shí)17 min，購(gòu)自上海之江生物科技股份有限公司，以下稱(chēng)為提取系統(tǒng)b)，96通道的MagNA Pure 96核酸提取儀及配套試劑盒[檢測(cè)總耗時(shí)58 min，購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，以下稱(chēng)為提取系統(tǒng)c]。

1.2.2擴(kuò)增系統(tǒng) 擴(kuò)增系統(tǒng)為購(gòu)自不同廠商的3種熒光定量PCR儀，分別為SLAN-96S(購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司，以下稱(chēng)為擴(kuò)增系統(tǒng)1)、安杰思AFD9600(購(gòu)自杭州安杰思生物科技有限公司，以下稱(chēng)為擴(kuò)增系統(tǒng)2)及LightCycler?480[購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，以下稱(chēng)為擴(kuò)增系統(tǒng)3]。

1.2.3擴(kuò)增試劑 SARS-CoV-2 RNA檢測(cè)試劑購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司(批號(hào)：2021391),該試劑同時(shí)擴(kuò)增的靶基因?yàn)镺、N和IC基因。檢測(cè)下限為500 copies/mL，Ct值≤30判定為陽(yáng)性。

1.2.4室內(nèi)質(zhì)控品 廣州邦德盛生物科技有限公司提供的SARS-CoV-2液體質(zhì)控品，選取S1濃度，靶值為1.6×103。

1.3方法 使用不同提取及擴(kuò)增系統(tǒng)組合進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程均嚴(yán)格按照儀器、試劑說(shuō)明書(shū)的相關(guān)要求。每92份標(biāo)本為一個(gè)檢測(cè)批次，每個(gè)批次均設(shè)置2個(gè)鹽水對(duì)照、1個(gè)陰性質(zhì)控及1個(gè)弱陽(yáng)性質(zhì)控，并全程參與核酸提取及擴(kuò)增。在實(shí)驗(yàn)有效的前提下，數(shù)據(jù)方可納入本研究。實(shí)驗(yàn)有效性的判定：弱陽(yáng)性質(zhì)控O、N及IC基因(CY5<30)均為陽(yáng)性，鹽水對(duì)照的O、N、IC基因均為陰性，陰性質(zhì)控的IC基因?yàn)殛?yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1不同提取、擴(kuò)增系統(tǒng)組合檢測(cè)人源性標(biāo)本IC基因的Ct值結(jié)果 不同提取系統(tǒng)提取的核酸在同一擴(kuò)增系統(tǒng)上擴(kuò)增、同一提取系統(tǒng)提取的核酸在不同擴(kuò)增系統(tǒng)上擴(kuò)增檢測(cè)人源性標(biāo)本IC基因的Ct值具體見(jiàn)表1。

2.1.1同一提取系統(tǒng)提取的核酸由不同擴(kuò)增系統(tǒng)擴(kuò)增的結(jié)果比較 提取系統(tǒng)a提取的核酸在擴(kuò)增系統(tǒng)1、2、3上分別擴(kuò)增，其IC基因的Ct值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003),且任意兩種擴(kuò)增系統(tǒng)之間IC基因的Ct值比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(擴(kuò)增系統(tǒng)1與2之間比較P=0.029，2與3之間比較P<0.001，1與3之間比較P=0.017)。提取系統(tǒng)b提取的核酸在擴(kuò)增系統(tǒng)1和3上擴(kuò)增，其IC基因的Ct比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)。提取系統(tǒng)c提取的核酸在擴(kuò)增系統(tǒng)2和3上擴(kuò)增，其IC基因的Ct值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表1。

2.1.2不同提取系統(tǒng)提取的核酸在同一擴(kuò)增系統(tǒng)上擴(kuò)增的結(jié)果比較 提取系統(tǒng)a、b、c提取的核酸在擴(kuò)增系統(tǒng)3上擴(kuò)增，其IC基因的Ct值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017),且任意兩種提取系統(tǒng)間差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(提取系統(tǒng)a與b之間比較P=0.034，b與c之間比較P<0.001，a與c之間比較P<0.001)；提取系統(tǒng)a、c提取的核酸在擴(kuò)增系統(tǒng)2上擴(kuò)增，其IC基因的Ct值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；提取系統(tǒng)a、b提取的核酸在擴(kuò)增系統(tǒng)1上擴(kuò)增，其IC基因的Ct值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)。見(jiàn)表1。

2.2不同提取、擴(kuò)增系統(tǒng)組合檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控品O、N、IC基因Ct值結(jié)果 不同提取系統(tǒng)提取的核酸在同一擴(kuò)增系統(tǒng)上擴(kuò)增、同一提取系統(tǒng)提取的核酸在不同擴(kuò)增系統(tǒng)上擴(kuò)增檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控品的O、N及IC基因Ct值具體見(jiàn)表2～4。

2.2.1N基因檢測(cè)結(jié)果 提取系統(tǒng)a提取的核酸，由擴(kuò)增系統(tǒng)2、3擴(kuò)增，其N(xiāo)基因Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.911)；提取系統(tǒng)a、b提取的核酸，由擴(kuò)增系統(tǒng)3擴(kuò)增，其N(xiāo)基因Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.307)；其余不同提取系統(tǒng)提取的核酸在同一擴(kuò)增系統(tǒng)上擴(kuò)增，以及同一提取系統(tǒng)提取的核酸在不同擴(kuò)增系統(tǒng)上擴(kuò)增，其N(xiāo)基因Ct值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2.2O基因檢測(cè)結(jié)果 提取系統(tǒng)a提取的核酸由擴(kuò)增系統(tǒng)2、3擴(kuò)增，其O基因Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.925)；提取系統(tǒng)a、c提取的核酸由擴(kuò)增系統(tǒng)2擴(kuò)增，其O基因Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.548)；提取系統(tǒng)b提取的核酸由擴(kuò)增系統(tǒng)1、3擴(kuò)增，其O基因Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.117)；其余不同提取系統(tǒng)提取的核酸在同一擴(kuò)增系統(tǒng)上擴(kuò)增，以及同一提取系統(tǒng)提取的核酸在不同擴(kuò)增系統(tǒng)上擴(kuò)增，其O基因Ct值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表1 不同提取、擴(kuò)增系統(tǒng)組合檢測(cè)人源性標(biāo)本IC基因的Ct值比較

表2 不同提取、擴(kuò)增系統(tǒng)組合檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控品N基因Ct值結(jié)果比較

表3 不同提取、擴(kuò)增系統(tǒng)組合檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控品O基因Ct值結(jié)果比較

2.2.3IC基因檢測(cè)結(jié)果 提取系統(tǒng)a、c提取的核酸由擴(kuò)增系統(tǒng)3擴(kuò)增，其IC基因Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.247)；提取系統(tǒng)a、c提取的核酸由擴(kuò)增系統(tǒng)2擴(kuò)增，其IC基因Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.905)；其余不同提取系統(tǒng)提取的核酸在同一擴(kuò)增系統(tǒng)上擴(kuò)增，以及同一提取系統(tǒng)提取的核酸在不同擴(kuò)增系統(tǒng)上擴(kuò)增，其IC基因Ct值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 不同提取、擴(kuò)增系統(tǒng)檢測(cè)弱陽(yáng)性質(zhì)控品IC基因Ct值結(jié)果比較

3 討 論

SARS-CoV-2核酸提取和擴(kuò)增儀器、試劑種類(lèi)繁多，性能不一[5-8]。本研究所用的不同提取及擴(kuò)增系統(tǒng)均經(jīng)過(guò)充分的性能驗(yàn)證且通過(guò)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)。在此基礎(chǔ)上，本研究嘗試進(jìn)一步探討不同檢測(cè)系統(tǒng)組合使用對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

因陽(yáng)性標(biāo)本較難留取，故本研究所納入的數(shù)據(jù)采集自陰性標(biāo)本的IC基因及同一批號(hào)弱陽(yáng)性質(zhì)控品的靶基因及IC基因,所有數(shù)據(jù)均來(lái)自室內(nèi)質(zhì)控在控的實(shí)驗(yàn)批次。實(shí)踐證明，采用人源性?xún)?nèi)標(biāo)的擴(kuò)增試劑可有效監(jiān)控每個(gè)標(biāo)本的采集質(zhì)量，以排除因未采集人源性標(biāo)本而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果[9]。

本研究?jī)H納入了單采標(biāo)本IC基因的Ct值，可避免混采標(biāo)本因采集過(guò)程繁瑣和標(biāo)本來(lái)源人數(shù)眾多所產(chǎn)生的質(zhì)量不確定性的問(wèn)題。本研究發(fā)現(xiàn)，不同的核酸提取、擴(kuò)增系統(tǒng)組合用于檢測(cè)SARS-CoV-2 RNA時(shí)結(jié)果存在差異，且有提取及擴(kuò)增系統(tǒng)的最佳配伍組合，如檢測(cè)人源性標(biāo)本IC基因時(shí)，提取系統(tǒng)c與擴(kuò)增系統(tǒng)3的組合所檢測(cè)的Ct值最低，為16.33±1.86，而提取系統(tǒng)a與擴(kuò)增系統(tǒng)2的組合所檢測(cè)的Ct值最高，為21.87±1.80。此外，對(duì)于室內(nèi)質(zhì)控品檢測(cè)，也存在類(lèi)似現(xiàn)象，如弱陽(yáng)性質(zhì)控品IC基因經(jīng)提取系統(tǒng)c或a提取后由擴(kuò)增系統(tǒng)3擴(kuò)增的組合。本研究顯示，最佳的配伍組合可顯著提升檢測(cè)效率，相對(duì)于效能最差的組合，其可將弱陽(yáng)性質(zhì)控品靶基因的Ct值提高；另外，對(duì)于不同提取系統(tǒng)提取的核酸，擴(kuò)增系統(tǒng)3的擴(kuò)增效率也顯著高于其他兩種擴(kuò)增系統(tǒng)。上述研究結(jié)果的臨床應(yīng)用對(duì)于提高低病毒載量標(biāo)本的檢出率具有非常重要的意義。

Ct值的高低從一定程度上可反映檢測(cè)系統(tǒng)的擴(kuò)增效率，但其值大小也會(huì)受實(shí)驗(yàn)條件等因素的影響，所以不能單純把Ct值作為評(píng)價(jià)試劑好壞的標(biāo)準(zhǔn)，還應(yīng)結(jié)合陽(yáng)性標(biāo)本的檢出率等綜合判定[10-11]。因缺乏SARS-CoV-2 RNA的陽(yáng)性標(biāo)本，本研究?jī)H比較了弱陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控品的各靶基因和IC基因的Ct值檢測(cè)結(jié)果，雖然與人源性標(biāo)本的基質(zhì)不同，可能導(dǎo)致結(jié)果的偏差，但對(duì)不同提取及擴(kuò)增系統(tǒng)的性能評(píng)估仍具有一定的參考價(jià)值[12]，因?yàn)橥粋€(gè)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，試劑種類(lèi)和批號(hào)、室內(nèi)質(zhì)控品水平和批號(hào)等也是相對(duì)固定的。如條件允許，應(yīng)使用陽(yáng)性標(biāo)本代替弱陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控品，進(jìn)一步對(duì)核酸提取系統(tǒng)及擴(kuò)增系統(tǒng)的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí)因收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)的下調(diào)，以及提取系統(tǒng)b及擴(kuò)增系統(tǒng)1購(gòu)買(mǎi)時(shí)間較晚，因此在本研究中缺少部分提取系統(tǒng)b搭配擴(kuò)增系統(tǒng)2以及提取系統(tǒng)a、c搭配擴(kuò)增系統(tǒng)1的檢測(cè)數(shù)據(jù)，此為本研究的不足之處。

為提升SARS-CoV-2 RNA的檢測(cè)效能，應(yīng)在性能驗(yàn)證的基礎(chǔ)上進(jìn)一步評(píng)估實(shí)驗(yàn)室內(nèi)各種核酸提取和擴(kuò)增系統(tǒng)的檢測(cè)效能，以便選擇最佳的提取、擴(kuò)增配伍組合。