FGF2的生物信息學(xué)分析及其在低氧神經(jīng)保護中的作用研究*

曹曉宇，楊海霞，靳慶玲，謝 偉，2，邵 國，鮑牧蘭，2，巴德仁貴,2

(1.包頭醫(yī)學(xué)院內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，內(nèi)蒙古包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)與麻醉學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室)

缺血/低氧是臨床醫(yī)學(xué)常見的基本病理過程和死因，也是航天、高原、深水等特殊環(huán)境所面臨的基本問題。缺血/低氧導(dǎo)致腦損傷的分子機制主要包括缺氧加重組織炎癥反應(yīng)釋放細胞毒性物質(zhì)來損傷腦組織及細胞能量代謝障礙加重腦組織細胞壞死，但內(nèi)源性的防護機制可以提高細胞和組織對缺血/低氧的耐受[1]。缺血/低氧預(yù)適應(yīng)(Ischemia/Hypoxia Preconditioning，I/HPC)是動員細胞和組織對缺血/低氧耐受的一種有效手段。I/HPC被認為是細胞內(nèi)源性防護機制的啟動，這種防護機制一般通過預(yù)先給機體一個溫和的(亞致死性)缺血/低氧刺激，可以增強機體對隨后更嚴(yán)重的(致死性)缺血/低氧刺激的耐受力[2]。

成纖維生長因子(Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)是一種在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達的促有絲分裂原，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長、發(fā)育及損傷修復(fù)具有重要意義[3-5]。特別是在缺血/低氧刺激腦損傷后，內(nèi)源性的FGF能夠刺激海馬神經(jīng)前體神經(jīng)母細胞分化，起到保護腦神經(jīng)的作用[6,7]。通常FGFs以家族的形式存在，作為細胞間信號分子在胚胎發(fā)生和分化過程中發(fā)揮作用[8]。目前，在人體內(nèi)鑒定出23個FGFs家族成員，其中FGF15尚未證實，多數(shù)FGFs(FGF3-8、10、15、17-19、21-23)的N末端具有典型的信號序列分泌蛋白。

有研究表明，癲癇或缺血性腦損傷后內(nèi)源性FGF2對腦海馬組織的空間結(jié)構(gòu)、語境記憶及神經(jīng)元再生具有重要的作用，特別是腦損傷后內(nèi)源性的FGF2的合成能夠刺激海馬神經(jīng)前體神經(jīng)母細胞分化，起到保護腦神經(jīng)的作用[9,10]。同樣，Graham等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2在幼年大鼠的學(xué)習(xí)與記憶功能發(fā)展過程中起促進作用，同時有助于成年個體恢復(fù)受損的認知功能[11]。雖然I/HPC及FGF均可以對組織產(chǎn)生保護作用，但是其確切的分子機制尚無定論，總體概括起來是降低能耗/增加供能和抑制死亡/促進生存，而這些保護性分子如何被調(diào)動和參與其中是個值得研究的問題。

1 材料與方法

1.1實驗材料 HT22細胞(小鼠海馬神經(jīng)元細胞)(北京協(xié)和細胞中心)。

1.2數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

1.2.1數(shù)據(jù)的搜索與獲得 從MGI(Mouse Genome Informatics，http://www.informatics.jax.org)、UNIPROT (http://www.uniprot.org/)、NCBI (National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等數(shù)據(jù)庫中搜索FGF基因家族成員，并利用UCSC genome browser 在線Blat分析軟件(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)作為補充對比數(shù)據(jù)。為了保證序列比對的可靠性，分別選取了人(Homo sapiens)的FGF1(NP_000791.1，NM_000800.4 )和小鼠(Mus musculus)的FGF1(NP_034327.1，NM_010197.3)的序列作為標(biāo)準(zhǔn)查詢序列，利用SMART在線工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)和CD-search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)分析鑒定候選蛋白的FGF結(jié)構(gòu)域。將鑒定出FGF2基因家族成員作后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1.2.2FGFs基因家族成員的鑒定 從MGI、UNIPROT、NCBI三大數(shù)據(jù)庫中搜索FGF基因家族成員，以小鼠(Mus musculus)的FGF1(NP_034327.1，NM_010197.3)的氨基酸序列作為標(biāo)準(zhǔn)探針序列，同時建立本地BLAST文庫進行數(shù)據(jù)搜索作為補充數(shù)據(jù)。使用SMART和CD search在線工具分析鑒定候選蛋白的FGF結(jié)構(gòu)域，利用MEGA6(http://www. megasoftware.net)軟件中的Clustal W程序?qū)υ摰鞍准易宓陌被釟埢M行多序列聯(lián)配，其他參數(shù)為默認值。將比對序列結(jié)果使用鄰位相接法(Neighbor-Joining，NJ)進行系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建，其參數(shù)設(shè)置為：自舉法分析(bootstrap analysis)進行1 000次重復(fù)，代替模型(substitution model)為泊松分布，差異/缺失數(shù)據(jù)處理(gap/missing data treatment)為完全刪除等。分析進化樹每個節(jié)點上自舉值得期望值，同時使用最大簡約法(Maximum Parsimony，MP)作為優(yōu)化方案并驗證NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹的可靠性。應(yīng)用CLC Sequence Viewer 6.8軟件構(gòu)建FGF家族蛋白序列比對。參數(shù)設(shè)置：序列分布(sequence layout)；Spacing設(shè)為10個氨基酸殘基；fixed wrap設(shè)為70氨基酸殘基，注釋分布選擇默認值，Residue Coloring設(shè)為含有背景顏色；Consensus設(shè)為選擇隱藏；Graph設(shè)為選擇隱藏，其他參數(shù)選擇默認值。

1.3建立HT22細胞低氧模型 經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后選取狀態(tài)良好的細胞，分為空白對照組(C)、低氧組(H)及低氧預(yù)適應(yīng)組(HPC)。設(shè)置低氧預(yù)適應(yīng)組條件，低氧(1 % O2/5 % CO2/ 94 % N2)30 min和常氧(21 % O2/ 5 % CO2/ 75 % N2)30 min循環(huán)交替進行，共4個循環(huán)，后急性低氧13 h，復(fù)氧6 h；低氧組則為直接低氧刺激13 h，復(fù)氧6 h?？瞻讓φ战M不進行任何處理，完成模型后收集各組細胞。

1.4細胞中FGF2 mRNA的qRT-PCR檢測 使用Trizol提取法，按照說明書步驟提取各組細胞總RNA，使用Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒，取3 μg總RNA用于cDNA第一鏈合成，對FGF2及β-actin基因進行qRT-PCR檢測。

1.5細胞中FGF2蛋白表達變化檢測 向細胞沉淀中加入100 μL RIPA裂解液和1 μL蛋白酶/磷酸酶抑制劑，振蕩混勻，4 ℃ 12 000 rpm離心15 min，收集上清液為蛋白懸液。使用Thermo BCA蛋白定量試劑盒，根據(jù)說明書測定每個樣品的蛋白濃度。在12 % SDS-PAGE凝膠上電泳分離蛋白后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。將膜封閉在5%的脫脂牛奶中以35 rpm/min室溫封閉1.5 h，使用1×TBST洗膜10 min，共3次。使用抗FGF2一抗(1∶1000稀釋，Santa)，抗β-actin一抗(1∶1000稀釋，Santa)于4 ℃條件下孵育PVDF過夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min。室溫下用辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔和山羊抗小鼠抗體孵育1.5 h，1×TBST洗膜10 min，共3次，然后使用ECL超敏發(fā)光液覆蓋在PVDF膜上，放入化學(xué)發(fā)光儀曝光，檢測抗體的表達。

1.6統(tǒng)計分析 所有實驗均重復(fù)三次或以上，實驗數(shù)據(jù)取各組平均值，使用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，使用單因素方差分析(ANOVA)來比較多組數(shù)據(jù)間差異，兩組間數(shù)據(jù)比較使用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1FGF家族系統(tǒng)進化樹構(gòu)建及保守序列分析 系統(tǒng)進化樹法是一種親緣分支分類方法。為了研究家族基因之間的進化關(guān)系，采用MEGA6軟件中距離依靠法(distance methods)中的NJ方法對人源FGF1-FGF23和鼠源FGF1-FGF23基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖1)。分析結(jié)果表明，F(xiàn)GFs家族又分為7個亞家族(即：FGF1、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF15/19)，每個亞家族含有2～4個成員，F(xiàn)GF每個亞家族自舉法的期望值較高，人源和鼠源FGF基因在進化上同源性較高，聚為一類。其中FGF15/19亞家族中除了FGF22、FGF23分別對應(yīng)并聚類在一個進化分支上，鼠源FGF15與人源FGF19聚類在一個進化分支上。

2.2FGF家族保守序列分析 以FGF蛋白為查詢序列，CD search在線工具分析鑒定FGF結(jié)構(gòu)域，同時通過CLC Sequence Viewer 6.8軟件對序列進行比對，本文只列出具有典型FGF家族結(jié)構(gòu)域的FGF1和FGF2進行系統(tǒng)分析(圖2)。FGF1含有一個由16個氨基酸組成的FGF受體結(jié)合域(Y-x31-S-x-E-x-A-x27-P-x7-E-x2-EENHYN-x-Y-x33-L-x-L-x-L)，而FGF2含有一個由17個氨基酸組成的FGF受體結(jié)合域(K-x2-Y-x31-Q-x-E-x-R-x27-V-x7-E-x2-ESNNYN-x-Y-x31-L-x- L-x-M)。雖然FGF家族典型結(jié)構(gòu)域部分氨基酸不同，有多個保守的基序組成，但不同F(xiàn)GF家族成員能夠與特定的FGF受體結(jié)合進行信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。FGF家族成員含有肝素結(jié)合區(qū)域。肝素結(jié)合位點是由富含賴氨酸和精氨酸結(jié)構(gòu)域(KK-K-R-K)組成，肝素與FGF-FGFR復(fù)合物的FGFR-1接觸，促進FGFR二聚化，通過調(diào)控FGF的活性進而調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進細胞的增殖和分裂。

圖2 FGF蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測和序列比對

2.3低氧和低氧預(yù)適應(yīng)對FGF2 mRNA表達水平的調(diào)控 基于生物信息學(xué)研究結(jié)果分析，結(jié)合前期實驗對FGF家族成員在大腦皮層和海馬區(qū)的表達譜分析，F(xiàn)GF2的功能研究具有重要意義，因此本研究通過細胞實驗進一步檢測FGF2在低氧及低氧預(yù)適應(yīng)條件下的表達情況，進而探討其功能特點。結(jié)果如圖3所示，相比于C組，H組和HPC組FGF2 mRNA表達水平均有所下降(P<0.05)，而與H組相比，HPC組FGF2 mRNA表達水平有所升高(P<0.05)。結(jié)果顯示，低氧刺激和低氧預(yù)適應(yīng)均降低了FGF2在mRNA水平的表達，而低氧預(yù)適應(yīng)相比于低氧刺激FGF2 mRNA表達有所升高，表明低氧預(yù)適應(yīng)的神經(jīng)保護作用可能與FGF2的差異表達有關(guān)。

圖3 各組HT22細胞中FGF2 mRNA表達水平

2.4低氧和低氧預(yù)適應(yīng)對FGF2蛋白表達水平的調(diào)控 結(jié)果如圖4所示，相比于C組，H組和HPC組FGF2蛋白水平表達均有所下降(P<0.05)，而與H組相比，HPC組FGF2蛋白水平表達有所升高(P<0.05)。結(jié)果顯示，低氧刺激和低氧預(yù)適應(yīng)均降低FGF2在蛋白水平的表達，而低氧預(yù)適應(yīng)相比于低氧刺激FGF2表達有所升高，表明FGF2可能參與低氧耐受神經(jīng)保護作用。

圖4 各組FGF2蛋白表達水平

3 討論

提高神經(jīng)細胞對缺氧的耐受性可減輕缺血/缺氧所引起的腦部疾病(如缺血性腦卒中)的癥狀[12,13]。低氧預(yù)適應(yīng)作為機體的內(nèi)源性保護機制，通過間斷性低氧刺激手段可以有效地預(yù)防這一疾病的發(fā)生。有研究表明，在這一保護過程中多種相關(guān)基因在mRNA以及蛋白水平均發(fā)生明顯的變化，進而影響機體的學(xué)習(xí)記憶能力[14-16]。

生物信息學(xué)方法與傳統(tǒng)的基于實驗室生物學(xué)研究相比，可以用較低的成本和較快的時間獲得研究線索。通過對家族蛋白的系統(tǒng)進化關(guān)系、理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)功能域的預(yù)測和分析，發(fā)現(xiàn)新規(guī)律、新信息，為進一步的實驗研究提供思路和切入點[17-19]。

新生血管的生成對缺血性腦血管疾病的治療是目前國內(nèi)外研究的熱點。FGF2是纖維細胞生長因子家族成員之一，是最早發(fā)現(xiàn)的血管生成因子之一，其在體內(nèi)、體外具有促使細胞遷移和血管生成等作用[20,21]。缺血性卒中后，F(xiàn)GF2可能上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)周細胞中PDGFRβ的表達，通過與PDGF-BB的相互作用激活周細胞的功能，有助于神經(jīng)保護和血管生成，表明FGF2是治療腦缺血的潛在靶基因[22]。此外，研究表明，敲除FGF2明顯增加小鼠腦梗死體積并且影響B(tài)DNF和NF-κB表達的水平，揭示內(nèi)源性FGF2在缺血性腦損傷中具有重要的神經(jīng)保護作用[23]。本研究探索FGF2是否參與低氧耐受神經(jīng)保護過程。本研究提取了各組小鼠海馬神經(jīng)元細胞(HT22)中的總蛋白和RNA，通過WB和qPCR的方法檢測FGF2的表達變化。研究發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，低氧與低氧預(yù)適應(yīng)處理均下調(diào)了FGF2表達，但低氧預(yù)適應(yīng)組相比于低氧組，F(xiàn)GF2的表達有所上調(diào)，揭示低氧預(yù)適應(yīng)作為細胞內(nèi)源性防護機制的啟動，通過觸發(fā)多種機制來誘導(dǎo)其神經(jīng)保護作用，例如增強血管調(diào)節(jié)，通過上調(diào)與血管生成相關(guān)基因的表達(如FGF2的表達)，以此增強機體對之后更嚴(yán)重的低氧/缺血刺激的耐受性。雖然本研究表明FGF2可能參與低氧預(yù)適應(yīng)的神經(jīng)保護作用，但FGF及其家族成員的種類及功能十分復(fù)雜，因此FGF2參與神經(jīng)保護的相關(guān)信號通路還需要深入探索。本研究旨在為缺血/低氧相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展機制提供新的理論依據(jù)。