基于轉(zhuǎn)錄組測序挖掘甜蕎自交不親和相關(guān)功能基因

張建，黃科慧，2，劉洋，唐恬，吳銀環(huán)，王于棟，陶建波，王藝鋼，姜澳華，劉佳琦，方小梅，易澤林

1. 西南大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/重慶市蕎麥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊， 重慶 400715；2. 甘肅省古浪縣防沙治沙技術(shù)推廣中心， 甘肅 古浪 733100

甜蕎Fagopyrumesculentum和苦蕎Fagopyrmtataricum都屬于蓼科Polygonaceae蕎麥屬Fagpyrum的1年生草本作物， 起源于中國， 具有生長期短、 抗逆性強的特點[1-3]， 富含多種礦質(zhì)營養(yǎng)元素(鐵、 鉀、 鋅、 硒等)和保健成分(蘆丁、 槲皮素、 不飽和脂肪酸、 抗性淀粉、 β-葡聚糖等)[4-5]， 是重要藥食兼用作物． 栽培種甜蕎花型為異型花(雌雄蕊不等長)， 分為2種類型， 雌蕊長于雄蕊(長柱花， pin)和雌蕊短于雄蕊(短柱花， thrin)[6]． 普通栽培種甜蕎自花授粉或同類型花植株之間相互授粉不結(jié)實， 具有自交不親和現(xiàn)象[7]；同型花雌雄蕊等長， 能夠自花授粉結(jié)實， 常見于野生種中． 近年來， 國內(nèi)外多個研究團隊利用自交可育野生蕎麥F.homotropicum[8]， 通過種間雜交的方式(F.esculentum和F.homotropicum)培育出自交可育甜蕎， 即雌雄蕊等長的同型花甜蕎[9-12]． Yasui等[13]指出蕎麥花的形態(tài)是thrum和pin兩種形式， 通過一個具有兩個等位基因狀態(tài)的基因(S和s)， 控制thrum(Ss)和pin(ss)形式． 與其他二態(tài)型作物一樣， 花的形態(tài)和種內(nèi)不親和性均由單個S位點決定， 且S-型植株為雜合子(S/s)， L-型植株在該位點為純合隱性(s/s)， 未發(fā)現(xiàn)S/S基因型[13]． 但隨后在中國云南省發(fā)現(xiàn)了花柱等長自交親和野生甜蕎． Woo等[14]發(fā)現(xiàn)自交親和性受單基因Sh控制， 甜蕎花型S基因的優(yōu)勢關(guān)系為S>Sh>s， 自交親和性等位基因Sh保留了異型性不親和性， 并認為Sh等位基因來源于S超基因復(fù)合體[15，12]． Yasui等[13]在S-Locus基因區(qū)注釋到32個預(yù)測基因， 并在這32個預(yù)測基因中發(fā)現(xiàn)2個與SI相關(guān)的候選基因， 編碼RING/U-box超家族蛋白． Mizuno等[16]利用GBS技術(shù)獲得甜蕎全基因組SNP標(biāo)記，S等位基因區(qū)域內(nèi)的SNP密度和遺傳多樣性分析表明該區(qū)域具有高度多樣性． 由于普通甜蕎屬于自交不親和的蟲媒傳粉作物， 花期遇陰雨天氣將嚴重影響結(jié)實率， 導(dǎo)致每667 m2產(chǎn)量低且十分不穩(wěn)定(全國平均單產(chǎn)量約為60 kg/667 m2)[11]， 而通過種間雜交培育的自交可育甜蕎， 因攜帶野生蕎麥的特性， 表現(xiàn)出結(jié)實率低、 產(chǎn)量低、 極易落粒， 自交衰退等特點[11，17]． 因此， 甜蕎產(chǎn)量與甜蕎育性息息相關(guān)， 對甜蕎育性及花柱發(fā)育的分子機理進行深入研究具有重要意義． 本研究以自交親和甜自21和自交不親和烏克蘭大粒蕎為材料， 分別對甜自21等柱花、 烏克蘭大粒蕎長柱花和短柱花雌雄蕊進行RNA-seq， 通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析解析甜蕎自交不親和信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)， 挖掘自交不親和相關(guān)基因， 闡明自交不親和的分子機理， 揭示甜蕎育性及花柱發(fā)育的分子機制．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年秋， 自交親和甜蕎品種甜自21和貴甜2號(來源于貴州師范大學(xué))， 自交不親和甜蕎品種烏克蘭大粒蕎和酉蕎2號分別隔離種植于重慶市北碚區(qū)西南大學(xué)校內(nèi)實驗基地， 常規(guī)田間管理， 待開花初期將烏克蘭大粒蕎和酉蕎2號長柱花(L-型)植株和短柱花(S-型)植株移栽后隔離種植． 盛花期分別對甜自21和貴甜2號等柱花， 烏克蘭大粒蕎和酉蕎2號長柱花和短柱花的花藥直徑、 花冠直徑、 雄蕊高、 花柱高和花柱到花藥的距離進行測量并統(tǒng)計分析． 于清晨7：00～9：00點， 分別取甜自21和貴甜2號等柱花， 烏克蘭大粒蕎和酉蕎2號長柱花和短柱花雌雄蕊， 并進行3次生物學(xué)重復(fù)， 樣品經(jīng)液氮速凍后-80 ℃保存， 用于RNA提?。?/p>

1.2 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測序

采用博日Bioflux的Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取各個花型雌雄蕊的總RNA． 通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的完整性， 使用Agilent Bioanalyzer 2100 System對RNA精確質(zhì)檢． 將檢測合格的甜自21等柱花(H)， 烏克蘭大粒蕎長柱花(L)和短柱花(S)雌雄蕊總RNA送至北京諾禾致源科技股份有限公司測序， 構(gòu)建cDNA 文庫， 在Illumina HiSeq 4000平臺上進行測序． 為了保證信息分析的質(zhì)量， 去除測序得到的原始測序序列(原始數(shù)據(jù))里面含有帶接頭的、 低質(zhì)量的讀長后， 得到有效數(shù)據(jù)， 然后采用Trinity軟件對有效數(shù)據(jù)進行拼接， 得到拼接的轉(zhuǎn)錄本． 然后利用Corset層次聚類軟件對轉(zhuǎn)錄本進行層次聚類， Corset層次聚類后得到最長的Cluster被確定為Unigene， 用于后續(xù)的分析． 得到的Unigene分別與NCBI(National Center for Biotechnology Information)中的NR和Nt數(shù)據(jù)庫、 KO(KEGG ortholog database)數(shù)據(jù)庫、 Swiss-Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、 Pfam蛋白數(shù)據(jù)庫、 GO數(shù)據(jù)庫、 KOG/COG數(shù)據(jù)庫進行比對， e-value值設(shè)置為小于1e-5． 然后， 對注釋到GO數(shù)據(jù)庫中的Unigene進行GO功能分類， 對注釋到COG/KOG數(shù)據(jù)庫中的Unigene進行COG/KOG功能分類分析， 對注釋到KO數(shù)據(jù)庫中的Unigene進行KEGG代謝途徑分析．

1.3 基因表達數(shù)據(jù)分析

以Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄組作為參考序列， 將每個樣品的有效數(shù)據(jù)在參考序列上做比對， 采用RSEM軟件， 設(shè)置bowtie2參數(shù)為mismatch 0， 對 bowtie的比對結(jié)果進行統(tǒng)計， 得到了每個樣品比對到每個基因上的讀長數(shù)目， 并對其進行FPKM轉(zhuǎn)換， 進而得到了所有基因的表達水平． 再用DEGseq進行差異分析， 篩選閾值為qvalue<0.005且|log2.Fold_change|>1． 然后， 分別對差異表達(上調(diào)和下調(diào))基因進行GO功能富集分析及KEGG代謝途徑富集分析．

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果， 篩選出可能與甜蕎育性和花柱發(fā)育相關(guān)的差異表達基因， 利用Primer-NCBI在線設(shè)計引物． 同時， 在自交親和甜自21和貴甜2號等柱花， 自交不親和烏克蘭大粒蕎和酉蕎2號長柱花和短柱花雌雄蕊總RNA中， 利用實時熒光定量PCR進一步驗證差異基因的表達特性． 將RNA 采用第1鏈cDNA合成試劑盒(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄為cDNA， 以cDNA為模板， FeActin為內(nèi)參， 采用TaKaRa(日本)公司的SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒， 在ABI 7500FAST熒光定量PCR儀(ABI 公司， 美國)進行熒光定量檢測． 每個樣品設(shè)3次技術(shù)重復(fù)， 依照2-ΔΔCT法計算相對表達量．

2 結(jié)果

2.1 甜蕎花表型分析及性狀測量

選取花柱異長型自交不親和甜蕎品種烏克蘭大粒蕎(UD)和花柱等長型自交親和甜蕎品種甜自21(TZ)作為實驗材料(圖1A)． 表型分析結(jié)果表明， 不同花柱類型花的花冠直徑差異不明顯， 短柱花柱頭到花藥的距離、 花藥直徑、 雄蕊高均大于長柱花， 花柱高則是長柱花高于短柱花． 等柱花的花藥直徑、 雄蕊高、 花柱高均在長柱花和短柱花之間， 且短柱花柱頭到花藥的距離最小(圖1)． 方差分析結(jié)果顯示， 除花藥直徑外， 花冠直徑、 雄蕊高、 花柱高、 花柱到花藥的距離在長柱花、 短柱花和等柱花之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p<5%)(圖1)．

B圖和C圖中不同小寫字母表示在p<5%水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義．圖1 甜蕎花表型分析及性狀測量

L表示烏克蘭大粒蕎長柱花， S表示烏克蘭大粒蕎短柱花， H表示甜自21等柱花． 下同．圖2 L vs H和S vs H差異表達基因分析

2.2 RNA-seq測序及差異基因篩選

甜自21等柱花(H)， 烏克蘭大粒蕎長柱花(L)和短柱花(S)雌雄蕊總RNA樣品經(jīng)轉(zhuǎn)錄組Illumina HiSeq 4000測序平臺測序后， 9個測序樣品得到的原始數(shù)據(jù)， 經(jīng)過嚴格的質(zhì)量評估和低質(zhì)量數(shù)據(jù)過濾， 使其得到高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)， Q30(堿基被測錯的概率為1‰)均在92%以上， GC含量均在45%左右(表1)， 說明得到的有效數(shù)據(jù)質(zhì)量和準確度較高， 滿足后續(xù)的數(shù)據(jù)分析需求．

高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)進行拼接后共得到326 245個轉(zhuǎn)錄本， 平均長度為1 209 bp， N50的長度為1 981 bp． 得到的轉(zhuǎn)錄本利用Corset軟件進行層次聚類， 通過層次聚類后得到Clusters， 這些Clusters中具有最長序列的被確定為Unigene， 最終得到283 170個平均長度為1 351 bp， N50為2 040 bp的Unigenes．

通過分析長柱花(L-型)烏克蘭大粒蕎、 短柱花(S-型)烏克蘭大粒蕎和等柱花(H-型)甜自21雌雄蕊中的基因差異表達， 以等柱花雌雄蕊(H-型)作為對照， 在長柱花(L-型)雌雄蕊中上調(diào)表達27 788個， 下調(diào)表達25 244個；在短柱花(S-型)雌雄蕊中上調(diào)表達29 929個， 下調(diào)表達25 963個；長(L-型)、 短柱花 (S-型)雌雄蕊同時上調(diào)基因20 466個， 同時下調(diào)基因19 753個． 通過對長柱花(L-型)烏克蘭大粒蕎和短柱花 (S-型)烏克蘭大粒蕎雌雄蕊中的基因進行差異表達分析， 共716個差異基因， 其中長柱花(L-型)雌雄蕊相對于短柱花(S-型)雌雄蕊上調(diào)表達357個， 下調(diào)表達359個(圖2)．

表1 不同花型雌雄蕊轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

2.3 差異表達基因GO功能分析

差異表達基因GO富集分析表明， 自交不親和甜蕎雌雄蕊(L-型和S-型)與自交親和甜蕎雌雄蕊(H-型)相比較(L vs H， S vs H)， 差異表達基因特異性富集到氧化還原過程(GO： 0055114， oxidation-reduction process)和氧化還原酶活性(GO： 0016491， oxidoreductase activity；GO： 0016705， oxidoreductase activity， acting on paired donors， with incorporation or reduction of molecular oxygen)最為顯著， 其次在血紅素結(jié)合(GO： 0020037， heme binding)、 鐵離子結(jié)合(GO： 0005506， iron ion binding)、 單個有機體代謝過程(GO： 0044710， single-organism metabolic process)、 轉(zhuǎn)移酶活性(GO： 0016758， transferase activity， transferring hexosyl groups)和四吡咯結(jié)合 (GO： 0046906， tetrapyrrole binding)等均有顯著富集(圖3)， 表明這些GO分類中的差異基因與甜蕎親和性有關(guān)． 在自交不親和甜蕎中， 長柱花(L-型)雌雄蕊與短柱花(S-型)雌雄蕊(L vs S)差異表達基因特異性富集到導(dǎo)管形成過程(GO： 0001525， angiogenesis)最為顯著， 其次為導(dǎo)管發(fā)育(GO： 0001568， blood vessel development)、 導(dǎo)管系統(tǒng)開發(fā)(GO： 0001944， vasculature development)、 導(dǎo)管生成調(diào)控(GO： 0045765， regulation of angiogenesis)和導(dǎo)管形態(tài)發(fā)生(GO： 0048514， blood vessel morphogenesis)(圖3)， 表明導(dǎo)管形成相關(guān)基因調(diào)控甜蕎花柱發(fā)育．

2.4 差異表達基因KEGG通路分析

差異表達基因KEGG富集分析表明， 自交不親和甜蕎與自交親和甜蕎雌雄蕊(L vs H， S vs H)差異表達基因均顯著富集到倍半萜和三萜生物合成途徑(ko00909， Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis)， 此外還有花色苷合成途徑(ko00942， Anthocyanin biosynthesis)， 二萜化合物合成過程(ko00904， Diterpenoid biosynthesis)， 角質(zhì)、 軟木脂和蠟質(zhì)合成(ko00073， Cutin， suberine and wax biosynthesis)， β-丙氨酸代謝(ko00410， beta-Alanine metabolism)， 精氨酸和脯氨酸代謝(ko00330， Arginine and proline metabolism)， 半胱氨酸和蛋氨酸代謝(ko00270， Cysteine and methionine metabolism)等(表2)， 表明萜類化合物可能與甜蕎親和性有關(guān)． 在自交不親和甜蕎中， 未檢測到長柱花和短柱花雌雄蕊(L vs S)差異基因顯著富集到某個代謝途徑， 但植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(ko04075， Plant hormone signal transduction)中的差異基因最多．

圖3 L vs H， S vs H和L vs S中差異表達基因GO分析

表2 差異表達基因KEGG通路分析_top20

續(xù)表2

2.5 萜類化合物合成途徑基因差異表達分析

在倍半萜和三萜化合物合成途徑(ko00909)中共檢測到77個差異基因， 與自交親和甜蕎雌雄蕊(H-型)相比， 40個DEGs在長柱花雌雄蕊(L-型)和短柱花雌雄蕊(S-型)中同時上調(diào)表達， 37個DEGs同時下調(diào)表達． 其中， 三萜化合物(Triterpenoid)合成途徑基因FDFT1(farnesyl-diphosphatefarnesyltransferase)和SQLE(squalenemonooxygenase)以下調(diào)表達基因為主． 倍半萜化合物有多個類型， 無環(huán)型類倍半萜(Acyclic sesquiterpenoid)合成途徑基因AFS1(alpha-farnesenesynthase)在自交不親和甜蕎長柱花(L)和短柱花(S)雌雄蕊中以下調(diào)表達為主；大根香葉烯(Germacren-type)和蛇麻烯(Humule-type)合成途徑相關(guān)基因SSTLE1(germacrene C synthase)，GERD((-)-germacrene D synthase)，TPS1(valencene/7-epi-alpha-selinene synthase)，HVS(vetispiradiene synthase)，TPS21(valencene/7-epi-alpha-selinene synthase)多數(shù)為上調(diào)表達基因(圖4)．

圖4 倍半萜和三萜化合物合成途徑差異表達分析

2.6 植物激素相關(guān)基因差異表達分析

植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對于激素觸發(fā)的生化變化非常重要[16]． 本研究發(fā)現(xiàn)， 長柱花雌雄蕊相對于等柱花雌雄蕊上調(diào)表達基因在“植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”途徑(Ko04075)中顯著富集． 而且， 在Ko04075途徑中發(fā)現(xiàn)， 與自交親和型等柱花雌雄蕊比較， 生長素、 茉莉酸和赤霉素信號通路中的差異表達基因在自交不親和型長、 短柱花雌雄蕊中均高表達(圖5)． 生長素(AUX/IAA)信號通路中， 相對于等柱花(H)雌雄蕊，AUX1，TIR1(transportinhibitorresponse1)，AUX/IAA，ARF在長柱花(L)和短柱花(S)雌雄蕊中上調(diào)表達；茉莉酸相關(guān)信號通路與α-亞麻酸代謝密切相關(guān)， 在茉莉酸信號通路中共發(fā)現(xiàn)13個基因， 分別為6個GOI1， 2個JAR1(jasmonicacid-aminosynthetase)和5個MYC2；在赤霉素(GA)信號通路中， 與自交親和型等柱花雌雄蕊比較， 自交不親和型長、 短柱花雌雄蕊中表達上調(diào)的基因為10個， 其中1個GID1(gibberellinreceptorGID1)， 3個DELLA和6個TF．

圖5 植物激素信號通路中相關(guān)基因差異表達分析

2.7 甜蕎花柱異型候選基因的qRT-PCR驗證

為消除品種特異性影響并驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性， 本研究分別提取自交不親和的兩個甜蕎品種烏克蘭大粒蕎(UD)和酉蕎2號(YQ)L-型雌雄蕊、 S-型雌雄蕊和自交親和的兩個甜蕎品種甜自21(TZ)和貴甜2號(GT) H-型雌雄蕊總RNA， 利用qRT-PCR技術(shù)， 根據(jù)已有參考文獻對MADS-box[19-20]、 MYB[21]及U-box超基因家族[22]等16個差異表達基因進行了qRT-PCR(表3)， 檢測其在不同品種、 不同花柱類型中的表達情況， 發(fā)現(xiàn)與通過轉(zhuǎn)錄組測序 FPKM方法計算讀長數(shù)得出的表達水平， 在不同花柱類型表現(xiàn)出一致的表達趨勢， 表明了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準確性(圖6)．

表3 與甜蕎育性和花柱發(fā)育相關(guān)的差異表達基因qRT-PCR引物

UD_L代表烏克蘭大粒蕎長柱花；YQ_L代表酉蕎2號長柱花；UD_S代表烏克蘭大粒蕎短柱花；YQ_S代表酉蕎2號短柱花；TZ_H代表甜自21等柱花；GT_H代表貴甜2號等柱花．圖6 與甜蕎育性和花柱發(fā)育相關(guān)的差異表達基因qRT-PCR驗證

此外， MADS-box轉(zhuǎn)錄因子家族AGAMOUS-likeprotein(AGL，Cluster-11933.108535)和糖代謝過程中的編碼多聚半乳糖醛酸酶基因(Polygalacturonases，PG，Cluster-11933.6467)在短柱花(S-型)雌雄蕊中高表達， 長柱花(L-型)雌雄蕊中低表達， 等柱花(H-型)中不表達， 表明這兩個基因可能與甜蕎花柱發(fā)育有關(guān)． 鋅指蛋白基因CCCH(Cluster-11933.183409)和U-box超基因家族基因SP11(Cluster-11933.98978)在自交不親和性甜蕎(S-型和L-型)雌雄蕊中表達量較低， 甚至不表達， 但在自交親和甜蕎(H-型)中均高表達． 相反， 轉(zhuǎn)錄因子ARF(Cluster-11933.100857，Cluster-11933.100857，Cluster-11933.94328)，MYC(Cluster-11933.187734)， U-box超基因家族基因SP11(Cluster-11933.123004，Cluster-11933.168503，Cluster-11933.66132，Cluster-11933.98978)， 轉(zhuǎn)錄抑制子SUI1(Cluster-11933.126825)在自交不親和甜蕎雌雄蕊中高表達， 在自交親和甜蕎雌雄蕊中低表達， 甚至不表達， 表明這些基因可能參與調(diào)控了甜蕎育性．

3 討論

甜蕎營養(yǎng)價值較高， 且耐旱耐瘠薄， 是高寒山區(qū)重要的經(jīng)濟和藥食兼用作物． 甜蕎的分子研究起步較晚， 研究基礎(chǔ)較薄弱． 高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)， 為非模式植物基因組學(xué)研究帶來了更多的新方法和新方案． 基于高通量測序的從頭(donovo)轉(zhuǎn)錄組分析可在非模式植物中有效地用于新基因的發(fā)現(xiàn)和新分子標(biāo)記的開發(fā)． 目前， 已有研究對甜蕎籽粒[23-24]、 根[25-26]、 根和葉[27]、 花序[28]、 花和子葉[29]進行了轉(zhuǎn)錄組測序， 并挖掘了相關(guān)基因， 但有關(guān)甜蕎自交不親和性及花柱發(fā)育相關(guān)的基因鮮有報道． 本研究分別對盛花期自交親和甜蕎品種甜自21等柱花雌雄蕊、 自交不親和甜蕎品種烏克蘭大粒蕎長柱花雌雄蕊和短柱花雌雄蕊進行轉(zhuǎn)錄組測序， 得到了283， 170個Unigenes， 其平均長度為1 351 bp， N50為2 040 bp， 獲得的高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組拼接結(jié)果及表達譜數(shù)據(jù)， 將對甜蕎育性和花柱發(fā)育相關(guān)遺傳研究提供非常有用的數(shù)據(jù)資源．

萜類化合物也稱類異戊二烯， 是由兩個異構(gòu)的5碳骨架(異戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP))組成的最大類別的天然化合物， 萜類化合物在自然界中普遍存在， 具有各種結(jié)構(gòu)和功能[30]． 萜烯通過參與植物的主要代謝， 例如植物激素(脫落酸， 細胞分裂素， 赤霉素和油菜素甾體)、 光合色素(葉綠素和類胡蘿卜素)、 電子載體(質(zhì)體醌和泛醌)和內(nèi)膜系統(tǒng)， 對植物的生長和發(fā)育至關(guān)重要[31-32]． 當(dāng)植物開花時， 一些低分子量的萜類化合物被釋放以吸引昆蟲進行授粉[33]． 在本研究中， 通過對差異基因進行KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)， 自交不親和甜蕎與自交親和甜蕎雌雄蕊(L vs H， S vs H)差異表達基因顯著富集到倍半萜和三萜生物合成途徑， 該途徑共檢測到79個差異表達基因， 42個DEGs在長柱花(L-型)雌雄蕊和短柱花(S-型)雌雄蕊中同時上調(diào)表達， 37個DEGs同時下調(diào)表達， 由此推斷萜類化合物可能參與調(diào)控了甜蕎育性發(fā)育．

植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對于激素觸發(fā)的生化變化非常重要[18]． 牽?；ㄊ诜壅T導(dǎo)多種植物激素， 引起生理和分子變異導(dǎo)致其衰老[34]． 植物生長調(diào)節(jié)劑生長素基本上參與細胞所有發(fā)育過程， 包括細胞分裂和擴增， 對所有植物發(fā)育過程都有影響[35]． 生長素可能直接或間接參與煙草花蕊識別和花粉管伸長[36]， 在可可[37]、 矮牽牛[38]和歐洲橄欖[39]等植物的自交不親和反應(yīng)中有重要作用． 在本研究中， 植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Ko04075)中的AUX/IAA與色氨酸合成密切相關(guān)， 該途徑中與自交親和甜蕎等柱花雌雄蕊相比，AUX1，TIR1，AUX/IAA，ARF，CH3和SAUR等基因在自交不親和甜蕎長柱花雌雄蕊中均上調(diào)表達， 推測AUX/IAA相關(guān)基因可能參與了甜蕎花柱發(fā)育．

茉莉酸(JA)在植物發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用， 如根的生長[40]、 雄蕊的發(fā)育[41]、 毛的形成[42]、 開花[43]、 葉片的衰老[44]和頂端細胞的形成[45]， 以及控制對非生物和生物脅迫的不同防御反應(yīng)． 在擬南芥中， JA誘導(dǎo)R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB21以及MYB24[46]， 與bHLH轉(zhuǎn)錄因子第二亞組(MYC2，MYC3，MYC4和MYC5)[40]來調(diào)節(jié)后期雄蕊發(fā)育[47]． Shi等[48]的研究結(jié)果表明， 自花授粉梨樹花柱中的JA濃度增加， 而異花授粉花柱中的JA濃度顯著降低． 結(jié)合外源JA處理， Shi等[48]認為S-RNase的表達水平降低與JA信號級聯(lián)有關(guān)． 本研究中α-亞麻酸代謝途徑在茉莉酸信號作用下， MYC2在自交不親和甜蕎長、 短柱花雌雄蕊中上調(diào)表達， 自交親和甜蕎、 雌雄蕊中下調(diào)表達． 結(jié)果表明JA信號對bHLH轉(zhuǎn)錄因子MYC2有影響， 從而參與調(diào)控甜蕎自交親和性．

赤霉素(GA)是植物中許多發(fā)育過程必不可少的植物激素， 包括種子發(fā)芽、 莖伸長、 葉片膨脹、 毛狀體發(fā)育、 花粉成熟和開花誘導(dǎo)[49]． 植物中存在的具有生物活性的GA較少， 主要包括GA1，GA3，GA4和GA7， 是堿性二萜類羧酸骨架的衍生物[50]． DELLA是GA反應(yīng)的關(guān)鍵細胞內(nèi)阻遏物， 抑制種子發(fā)芽、 生長和幾乎所有已知的GA依賴性過程， 而GA則減輕其抑制活性[49]． DELLA是植物特異性GRAS家族中假定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的子集， 擬南芥中有5個DELLA， 它們在抑制GA反應(yīng)中起著獨特或重疊的功能[51-52]， 其中RGA和GAI抑制營養(yǎng)生長和花誘導(dǎo)[53]，RGA，RGL1和RGL2共同調(diào)節(jié)花的發(fā)育[52]． 本研究的Ko04075途徑， 在GA作用下二萜化合物生物合成通路中， 與自交親和甜蕎相比TF，DELLA和GID1基因在自交不親和甜蕎長、 短柱花雌雄蕊中均上調(diào)表達． 因此， 本研究推測赤霉素通過影響萜類化合物的合成， 進而參與調(diào)控甜蕎自交不親和性．

4 結(jié)論

本研究獲得了自交不親和甜蕎長、 短柱花和自交親和甜蕎等柱花雌雄蕊的基因表達譜數(shù)據(jù)， 共獲得283 170條Unigenes， 其中有68 813個差異表達基因(DEGs)． 自交不親和甜蕎中長、 短柱花雌雄蕊中的差異基因主要富集在導(dǎo)管形成和導(dǎo)管發(fā)育過程中；自交不親和甜蕎(S-型和L-型)與自交親和甜蕎(H-型)雌雄蕊中差異基因主要富集在倍半萜和三萜化合物合成途徑中；自交不親和甜蕎長、 短柱花雌雄蕊中差異基因(L vs S)主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中， 生長素、 茉莉酸和赤霉素信號通路中的差異表達基因在自交不親和型長、 短柱花雌雄蕊中均高表達；ARF，MYC，MADS和U-box超基因家族中某些基因參與了甜蕎育性發(fā)育．