豌豆蚜可溶型海藻糖酶基因克隆及RNA干擾效應(yīng)

許靜靜，常永梅，任夢(mèng)圓，董艷玲，李永強(qiáng)

西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100

海藻糖是一種非還原性雙糖， 廣泛存在于細(xì)菌、 真菌、 昆蟲(chóng)和植物等許多生物體內(nèi)[1]． 海藻糖酶能將一分子海藻糖水解為兩分子葡萄糖， 通過(guò)糖酵解為各個(gè)組織器官提供能量， 或?yàn)閹锥≠|(zhì)合成提供原料， 因而海藻糖酶在昆蟲(chóng)體內(nèi)起著非常重要的作用[2]． 根據(jù)是否含有跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)⒗ハx(chóng)海藻糖酶基因分為兩類： ① 可溶型海藻糖酶(Tre1)， 主要分解細(xì)胞內(nèi)的海藻糖；② 膜結(jié)合型海藻糖酶(Tre2)， 主要水解食物中的海藻糖[3-4]． 海藻糖酶是海藻糖分解代謝的關(guān)鍵酶， 廣泛參與并調(diào)控昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、 非生物脅迫以及激素反應(yīng)等， 與昆蟲(chóng)能量代謝、 幾丁質(zhì)合成和誘導(dǎo)滯育密切相關(guān)． 目前， 已經(jīng)在甜菜夜蛾Spodopteraexigua[5]、 赤擬谷盜Triboliumcastaneum[6]、 飛蝗Locustamigratoria[7]和灰飛虱Laodelphaxstriatellus[8]等昆蟲(chóng)中， 通過(guò)RNAi技術(shù)證實(shí)了海藻糖酶基因在能量代謝和幾丁質(zhì)合成方面發(fā)揮著重要作用． Chen等[5]通過(guò)顯微注射法對(duì)甜菜夜蛾海藻糖酶基因SeTre1和SeTre2進(jìn)行RNAi研究發(fā)現(xiàn)， 基因轉(zhuǎn)錄水平及幾丁質(zhì)含量均顯著降低， 且SeTre1和SeTre2分別在昆蟲(chóng)的表皮和中腸的幾丁質(zhì)合成中起重要作用． 張倩等[8]通過(guò)飼喂法干擾灰飛虱海藻糖酶基因LSTre1和LSTre2， 發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄水平分別降低49%和41%， 并導(dǎo)致昆蟲(chóng)體質(zhì)量減輕、 死亡率顯著升高． 由于哺乳動(dòng)物沒(méi)有海藻糖代謝系統(tǒng)， 以海藻糖酶為靶標(biāo)的新農(nóng)藥對(duì)人畜等非靶標(biāo)生物可能不存在毒害作用[8-9]， 因此海藻糖酶便成為新型高效殺蟲(chóng)劑設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)的潛在優(yōu)良靶標(biāo)．

豌豆蚜Acyrthosiphonpisum是影響糧食生產(chǎn)的重要害蟲(chóng)之一， 主要通過(guò)取食植物汁液、 誘發(fā)煤污病和傳播植物病毒的方式[10-12]為害農(nóng)作物． 目前， 關(guān)于豌豆蚜海藻糖酶的RNA干擾研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道． 本研究以豌豆蚜為試蟲(chóng)， 通過(guò)基因克隆得到可溶型海藻糖酶基因ApTre-1的全長(zhǎng)編碼序列， 運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)ApTre-1基因和蛋白氨基酸序列進(jìn)行序列特征分析， 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析豌豆蚜海藻糖酶ApTre-1的進(jìn)化關(guān)系， 利用熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)明確ApTre-1基因在豌豆蚜不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)水平；在上述基礎(chǔ)上， 進(jìn)一步通過(guò)顯微注射法和飼喂法測(cè)定兩種dsRNA片段對(duì)海藻糖酶ApTre-1基因的干擾效率， 以及對(duì)試蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育的影響和致死效應(yīng)． 本研究對(duì)基于RNAi技術(shù)的海藻糖酶基因在害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用進(jìn)行了初步探索， 可為今后深入研究提供有價(jià)值的前期參考．

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

豌豆蚜由西北農(nóng)林科技大學(xué)應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供， 飼養(yǎng)于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)的盆栽蠶豆(“晉農(nóng)”精選蠶豆)上， 飼養(yǎng)條件： 溫度(21±1) ℃， 相對(duì)濕度70%～75%， 光照周期L(光照)∶D(黑暗)=16∶8．

1.2 豌豆蚜海藻糖酶基因的克隆

按照TRNzol Universal Reagent試劑盒(天根)說(shuō)明書(shū)， 對(duì)豌豆蚜3齡若蟲(chóng)進(jìn)行總RNA提?。?取1 μg總RNA作為模板， 按照HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit試劑盒(康為世紀(jì))說(shuō)明書(shū)， 去除基因組DNA后， 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈．

基于NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù)中豌豆蚜的基因組序列， 本研究利用大豆蚜Aphisglycines海藻糖酶基因(GeneBank登錄號(hào)： JQ246351.1)進(jìn)行BLAST搜索， 獲得豌豆蚜全基因組數(shù)據(jù)中編號(hào)為Contig13577的序列(GeneBank登錄號(hào)： ABLF02013269.1)． 通過(guò)軟件進(jìn)一步分析找到豌豆蚜海藻糖酶編碼基因閱讀框后， 利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)， 以豌豆蚜cDAN第一鏈為模板， 擴(kuò)增豌豆蚜的海藻糖酶編碼基因． PCR反應(yīng)條件： 98 ℃預(yù)變性1 min， 98 ℃變性10 s、 55 ℃退火30 s、 72 ℃延伸3 min， 共35個(gè)循環(huán)． 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后， 進(jìn)行回收純化． 純化后的DNA通過(guò)DNA A-Tailing Kit(TaKaRa)加“A”反應(yīng)后， 與pMD 19-T Vector(TaKaRa)連接， 構(gòu)建重組質(zhì)粒． 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞EscherichiacoliDH5α， 菌落PCR鑒定正確后， 送至生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon Biotech)測(cè)序．

表1 引物名稱與序列

1.3 豌豆蚜海藻糖酶蛋白ApTre-1生物信息學(xué)分析

利用在線軟件Softberry(http： //www.softberry.com)分析豌豆蚜基因組中海藻糖酶基因的內(nèi)含子和外顯子組成；利用在線軟件ExPASy(https： //web.expasy.org/protparam)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)；通過(guò)在線軟件Signal P(https： //services.healthtech.dtu.dk/)和TMHMM(https： //services.healthtech.dtu.dk/)分別對(duì)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽和跨膜區(qū)域進(jìn)行分析；通過(guò)NCBI在線工具BLAST(https： //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行蛋白質(zhì)同源搜索， 應(yīng)用MEGA 6軟件中的Clustal W進(jìn)行多重序列比對(duì)， 采用鄰位相連法(Neighbor-joining)進(jìn)行聚類分析， 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)． 重復(fù)次數(shù)為1 000次， 樹(shù)枝上的數(shù)字表示bootstrap驗(yàn)證中該樹(shù)枝可信度百分比大于50%的數(shù)值(圖1)．

圖1 豌豆蚜ApTre-1蛋白與其他昆蟲(chóng)海藻糖酶系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ApTre-1基因在不同齡期的表達(dá)水平

采用qPCR技術(shù)分析ApTre-1基因在豌豆蚜不同齡期(1齡、 2齡、 3齡、 4齡若蚜和無(wú)翅成蚜)的表達(dá)水平． 根據(jù)獲得的豌豆蚜ApTre基因序列設(shè)計(jì)qRCP特異性引物(表1)， 選擇EF-1a和RPS-20作為雙內(nèi)參基因[13]． 以豌豆蚜1齡若蟲(chóng)的相對(duì)表達(dá)量為基準(zhǔn)， 以無(wú)核酸酶水代替cDNA為陰性對(duì)照， 以不加反轉(zhuǎn)錄酶的核酸代替cDNA排除核酸樣品中基因組DNA污染的可能性． qPCR反應(yīng)體系(20 μL)為： 5倍稀釋的cDNA模板2 μL， 上、 下游引物各0.8 μL(10 mmol/L)， 2×TB GreenPremixExTaqII 10 μL， 無(wú)核酸酶水6.4 μL． 反應(yīng)于Roche Light Cycler 480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)Roche Diagnostics GmbH)上進(jìn)行． qPCR反應(yīng)條件為： 95 ℃ 5 min， 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 1 min， 共40個(gè)循環(huán)． 根據(jù)熔解曲線， 確定引物及擴(kuò)增特異性． 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)， 每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)． 采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[14]．

1.5 體外合成dsRNA

以序列驗(yàn)證無(wú)誤的ApTre為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 引物見(jiàn)表1． 使用Gel Extraction Kit試劑盒(天根)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收． 根據(jù)T7 RiboMAXTM Express RNAi System試劑盒(Promega)說(shuō)明書(shū)， 進(jìn)行體外dsRNA合成． 取2 μL dsRNA稀釋10倍后， 使用分光光度計(jì)測(cè)定dsRNA的濃度， 并通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)， 置于-80 ℃冰箱保存．

1.6 顯微注射法測(cè)定ApTre-1基因不同dsRNA片段的RNAi效率

參照葉超[15]的方法， 選擇生長(zhǎng)健康、 狀態(tài)一致的4齡若蚜， 使用顯微注射器分別注射2種不同的dsApTre-1片段， 以dsGFP為對(duì)照． 每只蚜蟲(chóng)注射dsRNA(1 μg/μL)60 nL， 每個(gè)處理10只蚜蟲(chóng)， 設(shè)6個(gè)生物學(xué)重復(fù)． 注射完成后， 將豌豆蚜放入培養(yǎng)皿中新鮮的蠶豆葉片上飼養(yǎng)． 采用qPCR技術(shù)檢測(cè)注射試蟲(chóng)2 d后的ApTre-1基因相對(duì)表達(dá)水平．

1.7 飼喂法測(cè)定ApTre-1基因dsRNA片段的RNAi效應(yīng)檢測(cè)

根據(jù)Auclair等[16]蚜蟲(chóng)人工飼料配方配置豌豆蚜的人工飼料， 采用飼蚜器進(jìn)行飼喂． 飼蚜器為兩端開(kāi)口的玻璃管， 將封口膜(美國(guó)Parafilm)拉至最薄， 附于玻璃管的一端， 使用移液槍將40 μL的人工飼料滴加至封口膜中央(dsRNA的濃度為1 μg/μL)， 然后再拉伸一張封口膜蓋在人工飼料上， 使人工飼料均勻平鋪于兩膜之間． 將飼蚜器置于智能人工光照氣候培養(yǎng)箱中， 每2 d更換1次人工飼料． 每個(gè)處理10頭若蚜， 重復(fù)6次． 每天觀察并統(tǒng)計(jì)存活數(shù)， 每2 d稱質(zhì)量記錄1次豌豆蚜體質(zhì)量． 采用qPCR技術(shù)檢測(cè)飼喂2 d后ApTre-1基因的相對(duì)表達(dá)水平．

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆蚜海藻糖酶基因ApTre-1克隆及序列分析

利用特異性引物對(duì)豌豆蚜海藻糖酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 獲得1條大小約為2 300 bp的電泳條帶(圖2)． 將目的條帶回收純化后， 經(jīng)連接、 轉(zhuǎn)化和測(cè)序， 篩選陽(yáng)性克隆， 得到海藻糖酶基因(ApTre-1)的cDNA序列． 通過(guò)Vector NT 軟件對(duì)PCR擴(kuò)增序列進(jìn)行分析， 確定了豌豆蚜海藻糖酶基因的開(kāi)放閱讀框． 該基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)為1 770 bp， 編碼589個(gè)氨基酸． 在基因組中DNA水平上該基因由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成(圖3)． 其編碼的氨基酸序列與NCBI中注釋和預(yù)測(cè)的豌豆蚜海藻糖酶氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)： XM001950229.4)完全一致．

使用在線軟件ExPASy預(yù)測(cè)豌豆蚜海藻糖酶ApTre-1蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為6.83×104；理論等電點(diǎn)(PI)為6.10． 利用Signal P在線預(yù)測(cè)該蛋白的信號(hào)肽， 結(jié)果表明ApTre-1蛋白的N段含有一段長(zhǎng)為20 aa的信號(hào)肽序列． 利用TMHMM預(yù)測(cè)該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域， 結(jié)果表明ApTre-1蛋白同其他已知昆蟲(chóng)的可溶型海藻糖酶一樣無(wú)跨膜區(qū)域． 通過(guò)NetNGlyc軟件預(yù)測(cè)， 發(fā)現(xiàn)ApTre蛋白含有4個(gè)糖基化位點(diǎn)， 分別位于124，234，346和473位氨基酸． 通過(guò)GeneDoc軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)同源序列比對(duì)， 發(fā)現(xiàn)ApTre-1蛋白含有“PGGRFRELYYWDTY” “QWDFPNAWPP”2個(gè)標(biāo)簽序列和一個(gè)富甘氨酸區(qū)域“GGGGEY”． 并且， 發(fā)現(xiàn)在蚜蟲(chóng)等半翅目昆蟲(chóng)中還含有“YYLNRSQPP” “PRPESYREDY” “IIPVDLN” “MFEKYD”和“GFGWXNG”共5個(gè)高度保守區(qū)域(圖4)．

圖2 ApTre-1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖A中實(shí)心矩形框表示ApTre-1基因的外顯子， 矩形框之間的短線段表示ApTre-1基因的內(nèi)含子；圖B表示ApTre-1基因轉(zhuǎn)錄后不含內(nèi)含子的編碼序列．圖3 ApTre-1基因DNA結(jié)構(gòu)圖

半翅目昆蟲(chóng)可溶型海藻糖酶GeneBank登錄號(hào)： 大豆蚜AgTre-1(AFJ00065.1)、 綠盲蝽AlTre-1(AGK89798.1)、 煙粉虱BtTre-1(JX024261.1)、 灰飛虱LsTre-1(AFL03409.1)、 褐飛虱NlTre-1(ACN85420.1)、 白背飛虱SfTre-1(AQS60672.1)． 標(biāo)簽序列用紅色方框標(biāo)注， 高度保守區(qū)域用藍(lán)色方框標(biāo)注， 富甘氨酸區(qū)域用下劃線標(biāo)注， 信號(hào)肽用紫色矩形框標(biāo)注， 糖基化位點(diǎn)用黑色三角形標(biāo)注．圖4 ApTre-1蛋白與其他半翅目昆蟲(chóng)Tre-1氨基酸序列多重比較結(jié)果

2.2 豌豆蚜ApTre-1蛋白的分子進(jìn)化分析

通過(guò)ClustalW軟件將豌豆蚜ApTre-1蛋白與其他已知的13種昆蟲(chóng)海藻糖酶蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)， 利用MEGA 6 軟件中的Neighbor-Joining方法進(jìn)行分子系統(tǒng)進(jìn)化分析， 得到昆蟲(chóng)海藻糖酶蛋白分子進(jìn)化樹(shù)(圖1)． 從該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出， 海藻糖酶分為可溶型海藻糖酶和膜結(jié)合型海藻糖酶兩大類， 在分類上屬于同一目的昆蟲(chóng)均單獨(dú)形成一個(gè)亞分支， 這與傳統(tǒng)的分類結(jié)果一致． 本實(shí)驗(yàn)克隆得到的豌豆蚜ApTre-1蛋白與大豆蚜、 飛虱等可溶型海藻糖酶歸為一個(gè)亞分支， 其中豌豆蚜ApTre-1蛋白與大豆蚜Aphisglycines的可溶型海藻糖酶(AgTre-1)聚在更小的一個(gè)分支內(nèi)， 表明其氨基酸序列相似性較高， 與煙粉虱Bemisiatabaci、 褐飛虱Nilaparvatalugens及白背飛虱Sogatellafurcifera可溶型海藻糖酶的氨基酸序列相似性則相對(duì)較低．

2.3 豌豆蚜海藻糖酶基因ApTre-1在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

通過(guò)qPCR技術(shù)， 對(duì)ApTre-1基因在豌豆蚜1～4齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)分析(圖5)． 結(jié)果表明：ApTre-1基因在豌豆蚜整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期間均有表達(dá)， 但不同發(fā)育階段表達(dá)量具有明顯差異， 其mRNA在1齡若蚜中表達(dá)水平最高， 顯著高于其他各階段， 約為2齡若蚜的5倍、 成蟲(chóng)的12倍．

2.4 豌豆蚜海藻糖酶基因ApTre-1的RNA干擾效率

對(duì)4齡若蚜進(jìn)行顯微注射dsRNA后， 放入培養(yǎng)皿中用新鮮蠶豆葉片進(jìn)行飼喂， 2 d后采用qPCR技術(shù)檢測(cè)蚜蟲(chóng)體內(nèi)ApTre-1基因表達(dá)量的變化(圖6)， 以綠色熒光蛋白(GFP)的dsGFP為對(duì)照． 由圖6可見(jiàn)， 經(jīng)過(guò)顯微注射兩種dsRNA后， 蚜蟲(chóng)體內(nèi)ApTre-1基因轉(zhuǎn)錄水平均受到不同程度的抑制． 在分別注射dsApTre-1-1和dsApTre-1-2片段2 d后，ApTre-1基因的相對(duì)表達(dá)量分別降低了48.0%和30.3%．

N1，N2，N3，N4和M分別代表1，2，3，4齡若蚜和成蚜；不同小寫(xiě)字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．圖5 ApTre-1基因在豌豆蚜不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量

不同小寫(xiě)字母表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．圖6 不同dsRNA注射2 d后豌豆蚜ApTre-1基因的相對(duì)表達(dá)量

2.5 飼喂dsApTre-1-1片段對(duì)豌豆蚜RNA干擾效率及生長(zhǎng)的影響

2.5.1 飼喂dsApTre-1-1片段對(duì)豌豆蚜ApTre-1基因的RNA干擾效率

根據(jù)以上結(jié)果， 選擇其中干擾效率較高的dsApTre-1-1片段與人工飼料混合， 進(jìn)一步采用飼喂法測(cè)定其對(duì)靶基因ApTre-1的RNA干擾效率． 以取食含dsGFP飼料的蚜蟲(chóng)為對(duì)照， 檢測(cè)取食含dsApTre-1-1飼料2 d后的蚜蟲(chóng)體內(nèi)可溶型海藻糖酶基因表達(dá)量的變化(圖7)． 從圖7中可以看出， 蚜蟲(chóng)取食含dsApTre-1-1的飼料后與對(duì)照組(含dsGFP飼料)試蟲(chóng)相比，ApTre-1基因表達(dá)量降低了27.3%， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.5%)．

2.5.2 飼喂dsApTre-1-1片段對(duì)豌豆蚜生長(zhǎng)的影響

以飼喂含有質(zhì)量濃度為1 μg/μLdsGFP和dsApTre-1-1的飼料分別作為非靶標(biāo)對(duì)照組和處理組， 統(tǒng)計(jì)第0，2，4，6 d存活豌豆蚜的平均體質(zhì)量(圖8)． 從圖8中可以看出， 連續(xù)飼喂含有dsApTre-1的飼料2 d后， 試蟲(chóng)平均體質(zhì)量與對(duì)照組相比開(kāi)始顯著降低． 到第6 d時(shí)， 蚜蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)組平均體質(zhì)量為0.88 mg， 與對(duì)照組的平均體質(zhì)量(1.13 mg)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<1%)， 表明試蟲(chóng)取食dsApTre-1-1片段后， 生長(zhǎng)發(fā)育受到明顯抑制．

*表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．圖7 dsApTre-1-1飼喂2 d后豌豆蚜ApTre-1基因的相對(duì)表達(dá)量

*表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p<0.05， **表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p<0.01．圖8 dsApTre-1-1飼喂后豌豆蚜平均體質(zhì)量

*表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p<0.05．圖9 dsApTre-1-1飼喂后豌豆蚜ApTre-1基因的存活率

2.5.3 飼喂dsApTre-1-1片段對(duì)豌豆蚜的致死率

以飼喂含有質(zhì)量濃度為1 μg/μLdsGFP和dsApTre-1-1的飼料分別作為非靶標(biāo)對(duì)照組和處理組， 統(tǒng)計(jì)2齡若蚜取食dsRNA后1～6 d的存活率(圖9)． 由圖9可以看出， 連續(xù)飼喂含有dsApTre-1-1飼料3 d后， 蚜蟲(chóng)的存活率開(kāi)始降低， 到第6 d時(shí)蚜蟲(chóng)的存活率為82.5%， 與對(duì)照組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．

3 討論與結(jié)論

海藻糖酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)重要的調(diào)控酶， 自從1992年和2005年分別鑒定出黃粉蟲(chóng)Tenebriomolitor的可溶型海藻糖酶[17]和家蠶的膜結(jié)合型海藻糖酶[3]后， 學(xué)者們很快就發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)普遍具有這兩種類型的海藻糖酶． 本研究基于已公布的豌豆蚜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)， 擴(kuò)增獲得了豌豆蚜可溶型海藻糖酶基因ApTre-1， 其全長(zhǎng)為1 770 bp， 編碼589個(gè)氨基酸， 與NCBI中預(yù)測(cè)的豌豆蚜海藻糖酶基因(GenBank登錄號(hào)： XM001950229.4)氨基酸序列完全一致， 揭示了海藻糖酶氨基酸序列在不同地域豌豆蚜中的高度保守性． 序列分析表明ApTre-1氨基酸序列具有典型的標(biāo)簽序列和富甘氨酸序列， 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)揭示其與大豆蚜海藻糖酶基因序列相似性最高， 并且與其他半翅目昆蟲(chóng)， 包括褐飛虱、 白背飛虱以及煙粉虱的可溶型海藻糖酶聚為一類．

海藻糖酶基因在豌豆蚜體內(nèi)的表達(dá)水平處于動(dòng)態(tài)變化過(guò)程． Bansal等[18]研究發(fā)現(xiàn)， 海藻糖酶基因在大豆蚜1，2齡若蚜期的表達(dá)水平較高， 隨后其表達(dá)水平持續(xù)降低， 在成蚜中表達(dá)水平最低． 本研究中， 可溶型海藻糖酶基因ApTre-1在豌豆蚜不同齡期表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 其在1齡若蚜期的表達(dá)量最高， 且顯著高于其他各生長(zhǎng)發(fā)育階段． 與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相比， 本研究中ApTre-1基因在豌豆蚜不同齡期的表達(dá)模式與其在大豆蚜不同齡期的表達(dá)模式較為一致， 均在1，2齡若蚜期表達(dá)水平最高． 此外， 在飛蝗研究中發(fā)現(xiàn)， 海藻糖酶基因LmTre-1在卵發(fā)育前期和中期表達(dá)量極低， 在末期表達(dá)量顯著增加， 在卵期最后1天表達(dá)量最高且顯著高于其他時(shí)期[7]． 結(jié)合本研究， 推測(cè)ApTre-1基因在豌豆蚜1齡若蟲(chóng)中的高表達(dá)， 可能是因?yàn)?齡若蚜剛開(kāi)始取食且處于快速生長(zhǎng)發(fā)育階段， 與需要大量的能量有關(guān)． 但是， 該推測(cè)尚需進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)研究工作去證實(shí)．

RNAi的效率與試蟲(chóng)體內(nèi)靶基因的選擇密切相關(guān)， 因此在利用RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)的研究中需要從害蟲(chóng)體內(nèi)篩選和鑒定高效靶標(biāo)基因[19-20]． 目前研究較多的靶基因主要包括致死基因、 抗性和免疫基因、 生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因和產(chǎn)卵相關(guān)基因等[21]． 例如， Terenius等[22]通過(guò)對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)RNAi研究結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)， 免疫相關(guān)基因的干擾效率顯著高于其他類型的基因． 此外， 基于已發(fā)現(xiàn)的害蟲(chóng)體內(nèi)的高效靶基因， 學(xué)者們利用植物表達(dá)這些靶基因的dsRNA來(lái)防治害蟲(chóng)已經(jīng)取得了較大進(jìn)展． 例如， 植物介導(dǎo)針對(duì)幾丁質(zhì)合成酶基因(CHS)的RNA干擾技術(shù)已經(jīng)在麥長(zhǎng)管蚜Sitobionavanae[23]中進(jìn)行了較為深入的研究， 發(fā)現(xiàn)試蟲(chóng)取食表達(dá)dsRNA的第3代轉(zhuǎn)基因小麥后， 其體內(nèi)的靶基因CHS1表達(dá)水平下降了45%～50%， 試蟲(chóng)總蛻皮率也顯著下降． 在褐色橘蚜Toxopteracitricida[24]的研究中， 也發(fā)現(xiàn)取食植物傳導(dǎo)的dsRNA后， 試蟲(chóng)體內(nèi)CHS的表達(dá)水平下降了48%， 且多數(shù)試蟲(chóng)不能蛻皮進(jìn)入到下一個(gè)齡期． Mao等[25]研究發(fā)現(xiàn)， 桃蚜Myzuspersicae連續(xù)取食植物表達(dá)的間隙基因(Mphb)dsRNA后， 降低了靶基因的表達(dá)量， 抑制了桃蚜的繁殖．

針對(duì)靶基因不同區(qū)域設(shè)計(jì)的dsRNA片段也會(huì)導(dǎo)致干擾效率的顯著差異性． 本研究首先采用顯微注射法針對(duì)靶標(biāo)基因ApTre-1不同區(qū)域進(jìn)行RNAi效率分析， 發(fā)現(xiàn)dsApTre-1-1，dsApTre-1-2對(duì)靶基因ApTre-1沉默效率分別為47.7%和30.3%． Chen等[5]針對(duì)甜菜夜蛾2種海藻糖酶的RNAi研究發(fā)現(xiàn)，dsSeTre-1和dsSeTre-2片段注射試蟲(chóng)24 h后， 2種海藻糖酶靶基因的沉默效率從50%逐漸上升， 至72 h時(shí)達(dá)到最高(近80%)． 相較而言， 本研究中針對(duì)豌豆蚜海藻糖酶基因ApTre-1的RNAi效率相對(duì)較低， 主要原因可能是本研究中所設(shè)計(jì)的2種dsRNA片段長(zhǎng)度或位置不是最佳所致， 其他原因尚需進(jìn)一步分析研究．

目前， 實(shí)驗(yàn)室研究中dsRNA導(dǎo)入昆蟲(chóng)體內(nèi)的方法主要為顯微注射法和飼喂法． 由于顯微注射法過(guò)程較為繁瑣、 處理樣本量少， 較適用于昆蟲(chóng)基因功能的研究；而飼喂法過(guò)程較為簡(jiǎn)單， 更接近昆蟲(chóng)的自然取食過(guò)程， 有助于最終在實(shí)踐生產(chǎn)中應(yīng)用． 因此， 飼喂法的應(yīng)用實(shí)踐性顯著優(yōu)于顯微注射法． 在采用顯微注射法分析的基礎(chǔ)上， 本研究選用其中RNA干擾效率較高的片段dsApTre-1-1進(jìn)一步通過(guò)飼喂法測(cè)定其對(duì)豌豆蚜的RNA干擾效應(yīng)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)dsApTre-1-1對(duì)靶基因ApTre-1的沉默效率較注射法有較明顯下降， 靶基因的表達(dá)水平下降了27.3%， 試蟲(chóng)第6 d時(shí)死亡率為17.5%． 張倩等[8]采用飼喂法對(duì)灰飛虱的2種海藻糖酶基因(LSTre-1和LSTre-2)進(jìn)行RNA干擾效應(yīng)研究， 發(fā)現(xiàn)dsTre-1和dsTre-2對(duì)靶基因的干擾效率分別為49.1%和41.5%， 在第2 d時(shí)致死率為10%～15%， 以后逐漸上升， 到第5 d時(shí)試蟲(chóng)死亡率為20%～40%． 二者相比， 采用飼喂法測(cè)定的dsRNA干擾效率及致死率略高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 但總體上致死率也相對(duì)較低． 上述研究結(jié)果說(shuō)明在不同種類的試蟲(chóng)中， 與顯微注射法相比， 昆蟲(chóng)取食dsRNA后對(duì)靶基因的干擾效率及致死率均相對(duì)較低很可能是一種普遍現(xiàn)象． 已有諸多研究表明， 昆蟲(chóng)腸道中含有豐富的核酸酶， 能夠降解dsRNA， 從而影響RNAi效率， 并對(duì)通過(guò)飼喂方式讓dsRAN進(jìn)入試蟲(chóng)體內(nèi)后保持穩(wěn)定和傳遞極為不利[26-27]， 這可能是導(dǎo)致上述研究中通過(guò)飼喂法測(cè)定dsRNA的RNAi效率降低和致死率較低的重要原因之一． 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道， 針對(duì)靶基因不同長(zhǎng)度的dsRNA片段也可能導(dǎo)致不同的RNA干擾效應(yīng)， 包括靶基因沉默效率、 試蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育、 死亡與繁殖率等． 因此， 在本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)研究中， 仍需針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)合成更多不同類型的dsRNA片段， 以便能篩選出對(duì)靶基因干擾效率更高的dsRNA片段， 為針對(duì)海藻糖酶的RNAi技術(shù)應(yīng)用于害蟲(chóng)防治提供有價(jià)值的參考．

本研究獲得了豌豆蚜可溶型海藻糖酶基因(ApTre-1)序列， 明確了其基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及在豌豆蚜不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)差異， 探索了顯微注射和飼喂ApTre-1基因的dsRNA片段對(duì)豌豆蚜RNA的干擾效應(yīng)， 為今后以ApTre-1基因?yàn)榘袠?biāo)的RNA干擾技術(shù)在害蟲(chóng)綜合防治中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)．