GeXP多重PCR技術(shù)對老年呼吸道感染患者常見呼吸道病毒的檢測及病毒流行特征分析

曾勇軍，黃歡歡，歐陽雨晴，曾勇彬

呼吸道病毒是通過呼吸道傳播、在呼吸道黏膜上皮細(xì)胞中增殖、導(dǎo)致呼吸道感染或呼吸道以外組織病變的一類病毒。老年人由于年齡增長，生理及免疫功能減退，再加上各種基礎(chǔ)性疾病，出現(xiàn)呼吸道病毒感染(respiratory tract infection, RTI)的機(jī)會(huì)和死亡率均比年輕人群高[1-2]。呼吸道感染可由細(xì)菌、支原體、衣原體和病毒等病原體引起，其中常見的病毒有流感病毒(influenza virus, IFV)、副流感病毒(human parainfluenza virus, HPIV)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)和人鼻病毒(human rhinovirus, HRV)等[3]。由于不同病毒感染的臨床癥狀和體征較為相似，因此，及時(shí)、準(zhǔn)確檢測和鑒別呼吸道病毒對輔助臨床醫(yī)生的診斷和治療具有重要意義。

目前，RTI的檢測方法包括病毒培養(yǎng)、免疫學(xué)技術(shù)、PCR技術(shù)等[4]。病毒培養(yǎng)是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法操作步驟復(fù)雜、耗時(shí)耗力、對技術(shù)、設(shè)備要求高，不適宜在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用；免疫學(xué)技術(shù)相對簡單，但病毒感染至少6 d才可產(chǎn)生IgM抗體，患者既往感染產(chǎn)生的抗體可導(dǎo)致檢測出現(xiàn)假陽性，其檢測敏感度和特異性仍有待提高；PCR方法對病毒檢測靈敏、特異，但一般情況下常規(guī)PCR 1次反應(yīng)只能檢測到1～3種病毒，通量較低。對于老年患者而言，由于呼吸道病原體診斷不明確、不及時(shí)，臨床醫(yī)生多采用經(jīng)驗(yàn)性治療，易導(dǎo)致藥物的不科學(xué)使用及治療的延誤。因此，尋找一種準(zhǔn)確、快速、通量大、靈敏度高、特異性強(qiáng)的呼吸道病毒檢測方法尤為重要。

GenomeLab GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)是一種新的基因表達(dá)譜分析平臺(tái)，能在一個(gè)反應(yīng)中對多達(dá)30種靶基因進(jìn)行分析，巧妙地將多重 PCR技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)結(jié)合，采用通用引物與特異引物相結(jié)合的方法實(shí)現(xiàn)多重、靈敏、特異、快捷檢測的目的[4-5]。筆者采用GeXP多重PCR技術(shù)檢測11種呼吸道病毒核酸，包括甲型流感病毒(influenza A virus, IFVA)、甲型流感病毒H1N1(influenza A virus H1N1, H1N1)、甲型流感病毒H3N2(influenza A virus H3N2, H3N2)、乙型流感病毒(influenza B virus, IFVB)、腺病毒(human adenovirus, HADV)、博卡病毒(bocavirus, BOCA)、HRV、HPIV、冠狀病毒(human coronavirus, HCOV)、RSV、偏肺病毒(human metapneumovirus, HMPV)等，探討其應(yīng)用價(jià)值，并進(jìn)一步分析老年呼吸道感染患者呼吸道病毒的流行特征，為臨床診治提供幫助。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2020年1月—2021年12月就診筆者醫(yī)院年齡、性別相匹配的老年(≥60歲)呼吸道感染患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《內(nèi)科學(xué)》(第9版)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[6]。上呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)包括普通感冒、急性病毒性咽炎和喉炎、急性皰疹性咽峽炎、急性咽扁桃體炎相關(guān)病史；(2)典型癥狀如發(fā)熱、頭痛、鼻塞、咽痛等表現(xiàn)；(3)胸部X射線檢查陰性。下呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)包括急/慢性支氣管炎、氣管-支氣管炎、肺炎、支氣管肺炎、支氣管擴(kuò)張相關(guān)病史；(2)咳嗽、咳痰等癥狀；(3)肺部出現(xiàn)干、濕啰音；(4)X射線胸片多為肺紋理增強(qiáng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院前已使用抗生素、抗病毒藥物等。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(閩醫(yī)大附一倫理醫(yī)技審[2015]084-1)，患者均知情同意。

1.2 試劑與儀器 病毒核酸提取試劑盒(寧波市重鼎生物技術(shù)有限公司)、呼吸道病原體多重檢測試劑盒(寧波海爾施基因科技股份有限公司)、GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)及毛細(xì)管電泳相關(guān)試劑(如DNA標(biāo)準(zhǔn)分子片段-400、礦物油、分離膠等)(美國貝克曼庫爾特有限公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國Life Technologies公司)。

1.3 標(biāo)本采集和核酸提取 按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第4版)》[7]留取患者標(biāo)本(鼻咽拭子、痰、支氣管肺泡灌洗液)及判斷標(biāo)本留取質(zhì)量。痰液標(biāo)本：平均每低倍鏡視野鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)<10個(gè)；肺泡灌洗液：鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)<細(xì)胞數(shù)的1%。采用商品化病毒核酸提取試劑盒提取標(biāo)本中的核酸。

1.4 核酸擴(kuò)增 病毒的核酸擴(kuò)增包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：(1)25 ℃退火5 min。(2)50 ℃逆轉(zhuǎn)錄15 min。(3)95 ℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶2 min。PCR反應(yīng)條件為：(1)94 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，重復(fù)6個(gè)循環(huán)。(2)94 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，重復(fù)29個(gè)循環(huán)。(3)72 ℃ 10 min。(4)反應(yīng)產(chǎn)物4 ℃ 保存。

1.5 GeXP平臺(tái)檢測 (1)制備電泳樣品。上樣緩沖液28.7 μL，標(biāo)準(zhǔn)分子片段(SizeStandard-400)0.3 μL，PCR產(chǎn)物1 μL，礦物油1滴。(2)準(zhǔn)備分離液。將200 μL分離液加入96孔板上適當(dāng)數(shù)目的孔中。(3)利用GeXP多重基因遺傳分析系統(tǒng)毛細(xì)電泳分離樣品。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 共納入老年呼吸道感染患者694例，其中男性496例，女性198例，其人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征見表1。本研究所測標(biāo)本的總體陽性率為14.99%(104/694)，不同種類病毒陽性檢出率差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=156.26，P=0.00)，最常見的病毒為HRV(6.05%，42/694)；其次為HADV(3.60%，25/694)和IFVA(2.31%，16/694)；其他病毒為HCOV(1.44%，10/694)、H1N1(1.15%，8/694)、HRSV(0.86%，6/694)、IFVB(0.58%，4/694)、HMPV(0.58%，4/694)和HPIV(0.29%，2/694)。呼吸道病毒在不同性別、不同呼吸道感染部位及不同標(biāo)本類型的檢出率差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 694例老年呼吸道感染患者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息及病毒總體檢測情況

2.2 GeXP多重PCR技術(shù)檢測結(jié)果的確認(rèn) 分別采用無RNA酶水和攜帶相應(yīng)病毒核酸的質(zhì)粒作為無模板對照(no-template control, NTC)和陽性對照(positive control, PC)。在NTC中只出現(xiàn)人DNA內(nèi)參(huDNA)峰和RT-PCR內(nèi)參(internal control, IC)峰，且2個(gè)內(nèi)參峰的峰高均高于標(biāo)準(zhǔn)品峰高，未觀察到除內(nèi)部參考外的峰；在PC中出現(xiàn)11個(gè)病毒峰，且病毒峰區(qū)分良好，高度均高于標(biāo)準(zhǔn)品峰高度，表明GeXP多重PCR技術(shù)的檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠(圖1)。

A：無模板對照；B：陽性對照。

2.3 單一病毒檢出陽性率與混合病毒檢出陽性率情況 檢出單一病毒91例(13.11%，91/694)，占陽性標(biāo)本的87.50%(91/104)；檢出混合病毒13例(1.87%，13/694)，占陽性標(biāo)本的12.50%(13/104)。單一病毒檢出率高于混合病毒檢出率(87.50%vs12.50%，χ2=117.00，P<0.001)?；旌喜《緳z出主要是IFVA與其他病毒的共同檢出，占混合病毒檢出的61.54%(8/13)，其中IFVA與H1N1合并檢出占混合病毒檢出的46.15%(6/13)(表2)。

表2 老年呼吸道感染患者單一病毒檢出陽性率與混合病毒檢出陽性率情況

2.4 不同年齡組呼吸道病毒檢出陽性率情況 將老年呼吸道感染患者按年齡分成3組：60～69歲組、70～79歲組、≥80歲組。≥80歲組陽性檢出率最高(21.62%，40/185)，其次是70～79歲組(陽性檢出率15.92%，39/245)和60～69歲組(陽性檢出率14.39%，38/264)。不同年齡組病毒檢出陽性率比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.29，P=0.12，表3)。

表3 不同年齡組呼吸道病毒檢出陽性率分布情況

2.5 不同季節(jié)呼吸道病毒檢測情況 根據(jù)季節(jié)分為4組：春季(3—5月)147例，夏季(6—8月)216例，秋季(9—11月)182例，冬季(12、1、2月)149例。不同季節(jié)病毒檢出情況見表4?？傮w而言，在春、冬季病毒檢出陽性率較高，分別為29.25%(43/147)和20.13%(30/149)。病毒在冬、春季節(jié)的檢出陽性率更高(χ2=28.04，P<0.001)。不同病毒檢出情況各不相同，H1N1、HMPV有明顯的季節(jié)分布特征，冬季和春季均有較高的檢出率。HRV、HADV多為散發(fā)，四季均有檢出，無明顯季節(jié)差別。

表4 不同季節(jié)呼吸道病毒檢出陽性率分布情況

3 討 論

RTI是引起老年患者死亡的原因之一，給家庭和社會(huì)帶來較大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[2]?？焖佟?zhǔn)確、高通量檢測老年人呼吸道感染的病原體，了解其流行特征，對老年人呼吸道感染的預(yù)防和治療具有重要的意義。GeXP多重基因表達(dá)遺傳分析系統(tǒng)是將毛細(xì)管電泳分離技術(shù)、多重PCR技術(shù)和熒光標(biāo)記相結(jié)合的一種檢測分析系統(tǒng)。與普通PCR技術(shù)相比，該技術(shù)具有快速、靈敏、高通量等優(yōu)勢，已應(yīng)用于呼吸道感染性病原體的檢測[4, 8]。本研究中采用的GeXP多重PCR技術(shù)能在4 h內(nèi)完成13種呼吸道病原體(包括11種病毒、肺炎支原體和肺炎衣原體)的檢測，可幫助臨床醫(yī)生及時(shí)地進(jìn)行呼吸道感染的早期干預(yù)。

本研究中，呼吸道病毒檢測陽性率為14.99%，與魏菁菁等[9]的報(bào)道類似，但低于前期(2020年之前)上海、河北等地區(qū)的研究[10-11]，可能的原因之一是，隨著新型冠狀病毒肺炎的流行，人們加強(qiáng)自我防護(hù)意識(shí)，如戴口罩、保持適當(dāng)?shù)纳缃痪嚯x、減少聚集等，從而減少了呼吸道病毒的傳播，降低了呼吸道病毒檢測的陽性率。研究[12]表明，老年人感染HRV的風(fēng)險(xiǎn)是年輕人的10倍，感染IFV的風(fēng)險(xiǎn)是年輕人的5倍。本研究中，老年呼吸道感染患者病毒感染陽性率檢出最高的是HRV，其次是INFA和HADV，與其他報(bào)道[13]一致，且男女之間的病毒檢出陽性率無明顯區(qū)別。

通過年齡分組分析發(fā)現(xiàn)，呼吸道病毒的檢出率隨著年齡的增加而增加，≥80歲組檢出率最高，與文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致，可能的原因是隨著年齡的增長，老年人患基礎(chǔ)性疾病的概率增加，免疫力下降，從而增加了患呼吸道感染的風(fēng)險(xiǎn)。呼吸道感染可存在多種混合感染，一種病毒可引起多種臨床癥狀，一種癥狀也可由多種病毒引起。在本研究中，混合感染13例，陽性率為1.87%，占陽性標(biāo)本的12.50%；其中INFA與H1N1合并感染最多，與其他研究[11]有所差別，可能是由于不同地區(qū)病毒感染的流行情況不一所導(dǎo)致。RTI具有明顯的季節(jié)性差別，本研究呼吸道病毒在春、冬季節(jié)的檢出率明顯高于夏、秋季節(jié)，考慮氣候變化是導(dǎo)致病毒檢出率呈季節(jié)性變化的重要因素，寒冷天氣易引起鼻黏膜血管收縮，降低抵抗力；另外寒冷天氣老年人戶外活動(dòng)顯著減少，室內(nèi)聚集增加，空氣不流通，從而增加呼吸道感染的風(fēng)險(xiǎn)。IFV包括IFVA、H1N1、IFVB、H3N2，是引起老年人RTI死亡的一個(gè)重要原因，并且通常發(fā)生在冬、春季[14]。在本研究中，IFV是第二常見的病毒，其中IFVA占57.14%，IFVB占10.71%,與其他報(bào)道相符[15]，人HMPV感染也有明顯的季節(jié)特征，同樣在冬、春季節(jié)有較高的檢出率。然而，HRV、HADV多為散發(fā)，四季均有檢出，無明顯季節(jié)差別。

綜上所述，GeXP多重PCR技術(shù)簡便、快速、靈敏，可同時(shí)檢測多種呼吸道病毒核酸，輔助臨床的呼吸道感染診斷和治療。本研究還分析了老年患者RTI的流行病學(xué)特征，可為老年人呼吸道感染的預(yù)防和治療提供幫助。本研究的局限在于研究為單中心，今后有必要通過多中心進(jìn)一步證實(shí)；另外，本研究旨在了解老年呼吸道感染患者病毒的流行特征，尚未對其他呼吸道病原體如細(xì)菌性病原體、肺炎支原體、肺炎衣原體等進(jìn)行分析，后續(xù)計(jì)劃進(jìn)行其他病原體的檢測及分析，為臨床診療提供更多有用的信息。除此之外，今后如能結(jié)合呼吸道病毒特征和患者的診療數(shù)據(jù)(如基礎(chǔ)性疾病、住院時(shí)長、影像學(xué)數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)等)，進(jìn)行深入、全面地分析，將會(huì)獲得更有價(jià)值的結(jié)果。