9 株綿羊肺炎支原體內(nèi)蒙古分離株P(guān)113 基因克隆及蛋白序列分析

戴伶俐，王 娜，白 帆，張 帆，宋 越，張月梅，達來寶力格，李曉艷，王根云，趙世華

（1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2. 呼和浩特市動物疫病防控中心， 內(nèi)蒙古 呼和浩特010020）

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是重要的羊呼吸道病原體，能引起綿羊和山羊非典型性肺炎。 患病羊只出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、漸進性消瘦、腹瀉和滲出性間質(zhì)性肺炎［1］，給養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。MO 在我國廣泛存在，主要集中在肉羊、奶羊主產(chǎn)區(qū)，如內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、四川等地［2］。羊只一旦感染MO，即便未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和肺部病變， 也會嚴(yán)重影響生產(chǎn)性能， 如日增重下降、胴體質(zhì)量降低等［3］。 應(yīng)用抗生素治療并不能降低MO 在羊體內(nèi)的定植率［4］，通過抗生素治療無法達到有效的治療效果， 患病羊只常常出現(xiàn)反復(fù)發(fā)病的情況。 非典型性肺炎是影響?zhàn)B羊業(yè)健康發(fā)展的重要呼吸道疫病［5-6］，因此，急需開發(fā)高效的診斷方法和疫苗產(chǎn)品，用于該病的有效防控。目前對于MO 的重要功能蛋白研究較少， 嚴(yán)重影響了其分子致病機制的研究以及防控技術(shù)的開發(fā)。

肺炎支原體入侵宿主造成感染的第1 步是黏附，因此，確定支原體黏附因子是防治感染的有效途徑。 P97 蛋白是豬肺炎支原體的黏附因子，介導(dǎo)豬肺炎支原體與呼吸道纖毛黏附［7］，是重要的毒力因子［8］。 根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果推測MO 的P113 蛋白與豬肺炎支原體黏附蛋白P97 直系同源，可能與MO 的黏附相關(guān)［9］。P113 蛋白C 末端具有良好的免疫原性［10］，且含有與P97 蛋白類似的重復(fù)序列。 楊發(fā)龍等［11］對MO 的P113 蛋白C末端重復(fù)區(qū)域進行原核表達， 證明該區(qū)域具有良好的免疫原性。 根據(jù)序列及結(jié)構(gòu)分析推測，P113 蛋白可能是MO 的黏附因子， 是潛在的毒力因子，因此，對該蛋白進行深入分析有利于進一步驗證其生物學(xué)功能。 該研究對9 株MO 內(nèi)蒙古分離株P(guān)113 基因序列進行擴增測序，分析P113 蛋白C 末端序列重復(fù)區(qū)域在不同菌株之間的變化情況， 為研究MO 黏附因子分子機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 MO 菌株

MO 內(nèi)蒙古分離株9 株，由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所分離、 鑒定， 菌株信息見表1。MO 標(biāo)準(zhǔn)株Y98，由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

表1 MO 內(nèi)蒙古分離株信息

1.1.2 主要試劑

支原體培養(yǎng)基， 青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；馬血清，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；2×高保真PCR Mix 預(yù)混液、氨芐西林、瓊脂糖、PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

恒溫搖床（THZ-98AB，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），PCR 儀（Verit，ABI 公司），凝膠成像系統(tǒng)（Universal HoodⅡ，Bio-Rad 公司）， 電泳儀（DYCP-31DN，北京六一生物科技有限公司），生物安全柜（AirstreamRA2，Esco 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 MO 培養(yǎng)及基因組DNA 提取

按照支原體培養(yǎng)基說明書配制培養(yǎng)基， 按照1∶10 比例接種MO 菌液， 在37 ℃、150 r/min 恒溫搖床培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)至培養(yǎng)基顏色變?yōu)槌赛S色；收集培養(yǎng)產(chǎn)物，4 ℃、13 000 r/min 離心20 min，棄盡上清液， 菌體沉淀用于提取基因組DNA，操作過程按照細菌基因組DNA 提取試劑盒說明書。獲得的各菌株基因組DNA 保存于-20 ℃，備用。

1.2.2 P113 基因克隆與測序

根據(jù)GenBank 公布的支原體GZ-QX1 株P(guān)113 基因序列 （GenBank 登錄號：KR270152.1），使用Oligo 7.37 軟件設(shè)計P113 基因片段擴增引物，上游引物P113-F：5′-CGCGGATCCGCGGCAAA ACAAGATTACTAT-3′；下游引物P113-R：5′-CCGG AATTCCGGTTATTCAAACTCTTTTAG-3′。

以各MO 菌株基因組DNA 為模板， 擴增P113 基因片段。 PCR 反應(yīng)體系：2×高保真PCR Mix 預(yù) 混 液25 μL，P113-F （10 μmol/L）1 μL，P113-R（10 μmol/L）1 μL，基因組DNA 模板1 μL，用無菌無酶水補至50 μL。 PCR 擴增條件為：95℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，30 個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min；4 ℃保溫。 PCR 陽性對照模板為MO Y98 株基因組DNA，陰性對照模板為超純水。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳， 切下目的片段凝膠塊，用PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒回收目的片段， 純化PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 P113 蛋白序列分析

測序獲得的各菌株P(guān)113 基因序列用NCBI 在線BLSAT 軟件進行初步序列比對。 從NCBI 下 載3 株MO 菌 株ATCC 29419 （Gen-Bank 登錄號：KR021380.1）、GZ-QX1（GenBank登 錄 號：KR270152.1）、NCTC 10151 （GenBank登錄號：LR215028.1）的P113 基因DNA 序列，采用DNASTAR 和MEGA 7.0 軟件將各菌株P(guān)113 基因序列翻譯為氨基酸序列并分析其進化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 P113 基因片段擴增結(jié)果

以不同MO 分離株基因組DNA 為模板擴增P113 基因片段， 各菌株擴增產(chǎn)物大小不完全一致，片段長度介于1 100～1 300 bp（見圖1），提示P113 基因具有一定的多樣性。

圖1 MO 不同分離株P(guān)113 基因片段PCR 擴增結(jié)果

2.2 P113 蛋白序列比對結(jié)果

將測序獲得的不同菌株P(guān)113 基因片段序列翻譯為氨基酸序列進行比對，與NCBI 下載的3 株MO 菌 株ATCC 29419、GZ-QX1、NCTC 10151 的P113 蛋白序列相比，9 株MO 內(nèi)蒙古分離株P(guān)113蛋白序列存在缺失或者插入。 缺失或者插入的序列存在一定的規(guī)律，P113 蛋白序列內(nèi)部存在重復(fù)序列，以KKAEGA（S）QNQG 為主要重復(fù)序列單元（見圖2）。

圖2 截短P113 蛋白序列比對結(jié)果

不同菌株包含的KKAEGA （S）QNQG 重復(fù)序列單元數(shù)量不完全相同。 從NCBI 下載的3 株MO菌株P(guān)113 蛋白序列中， 該重復(fù)序列單元含有10個；MO 內(nèi)蒙古分離株NM01-MO、CK-MO、NM03-MO、DMQ-ZM-MO 所含重復(fù)序列單元數(shù)量均高于10 個， 其余分離株所含重復(fù)序列單元數(shù)量較少，出現(xiàn)序列缺失（見表2）。

表2 MO 內(nèi)蒙古分離株及參考菌株P(guān)113蛋白C 末端氨基酸重復(fù)序列單元數(shù)量 單位：個

2.3 P113 蛋白序列進化樹分析

MO 不同分離株P(guān)113 蛋白序列進化樹分析結(jié)果表明，ATCC 29419、GZ-QX1 和NCTC 10151的遺傳距離最近，內(nèi)蒙古分離株DMQ-ZM-MO 和LK-MO 與前述3 株菌的遺傳距離最近，同屬一個分支；D00188-MO、SZW03-MO 和DMQ-BT-MO與其他菌株遺傳距離較遠（見圖3）。

圖3 截短P113 蛋白序列遺傳進化樹

3 討論

黏附蛋白是支原體侵害宿主機體的關(guān)鍵毒力因子之一［12］。 目前已有MO 分子致病機制相關(guān)研究［13-16］，但通過探究MO 關(guān)鍵蛋白功能來解析其分子致病機制方面的研究還十分有限。

由于MO 的P113 蛋白與豬支原體黏附因子P97 蛋白存在較高的同源性， 且C 末端都具有重復(fù)序列，因此，推測P113 蛋白是MO 潛在的黏附因子，但是目前缺少其直接影響MO 黏附作用的證據(jù)。已有研究證明MO 的P113 蛋白具有良好的免疫原性，具有開發(fā)為亞單位疫苗的潛力［10，17］。 由于P113部分基因序列較為保守，屬于MO 特異性序列，研究者們已經(jīng)據(jù)此研發(fā)相應(yīng)的檢測方法，例如：制備P113 蛋白單克隆抗體，用于MO 間接免疫熒光檢測和血清抗體檢測［18］；建立基于P113 基因的常規(guī)PCR 檢測方法和熒光定量PCR 檢測方法［19-20］。

該研究通過對2017—2022 年在內(nèi)蒙古地區(qū)分離的MO 菌株P(guān)113 基因片段克隆測序，發(fā)現(xiàn)不同菌株P(guān)113 基因片段長度存在一定差異，這種差異主要是由于C 末端重復(fù)區(qū)域的長度不一致而引起。 該研究發(fā)現(xiàn)，MO 內(nèi)蒙古分離株P(guān)113 蛋白C末端重復(fù)序列單元為KKAEGA（S）QNQG，不同分離株的重復(fù)數(shù)量并不完全相同，但是這種差異與MO分離株分離的時間和地點沒有明顯的相關(guān)性，可能與菌株自身的生物學(xué)特性相關(guān)。由于P113 蛋白是潛在的毒力因子，因此，重復(fù)序列單元的數(shù)量可能與MO 的毒力強弱有關(guān)，這有待于進一步研究。

4 結(jié)論

成功擴增9 株MO 內(nèi)蒙古分離株的P113 基因片段，這些菌株的P113 蛋白C 末端重復(fù)序列單元數(shù)量存在一定差異，該結(jié)果可為后續(xù)研究MO P113蛋白生物學(xué)功能以及MO 致病機制提供參考。