新疆部分地區(qū)規(guī)?；i場豬囊等孢球蟲的套式PCR 檢測及感染情況分析

彭 霞，趙乾明，王凌云，信璐瑤，趙愛云，余復昌，齊 萌

（塔里木大學動物科學與技術學院/新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

豬囊等孢球蟲（Cystoisospora suis）是一種常見的寄生于豬腸道的原蟲，主要引起豬只消瘦、腹瀉等臨床癥狀［1］。 通常豬囊等孢球蟲對成年豬無明顯致病性，但可導致仔豬腹瀉甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成一定的經(jīng)濟損失［2-3］。 De Araújo 等［4］報道巴西養(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染率為3.74%（7/187）；Pettersson 等［5］報道瑞典養(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染率為5.20%（84/1 615）；Johnson 等［6］報道澳大利亞養(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染率為10.38%（30/289）；Gong 等［7］報道我國22 個省養(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染率為8.96%（1 834/20 470）；劉文婷等［8］報道我國華北地區(qū)養(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染率為34.43%（313/909）。

對于豬囊等孢球蟲， 傳統(tǒng)的檢查方法主要是普通光學顯微鏡觀察法。 隨著分子生物學技術的發(fā)展，PCR 法因具有較高的敏感性和準確性，目前已廣泛應用于豬囊等孢球蟲的檢測［9-10］。 盛祖勛等［11］采用顯微鏡觀察法與PCR 法檢測安徽省7個規(guī)?；B(yǎng)殖場豬糞便樣本， 發(fā)現(xiàn)豬囊等孢球蟲的感染率分別為4.20%（21/500） 和13.20%（66/500）；Joachim 等［12］采 用 顯 微 鏡 觀 察 法 與PCR 法檢測豬糞便樣本， 發(fā)現(xiàn)豬囊等孢球蟲的感染率分別為52.27%（23/44）和70.45%（31/44），結(jié)果均提示PCR 法具有較高的特異性和敏感性。 該研究以SSU rDNA 基因為靶序列， 采用套式PCR 法對采集自新疆部分地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場的豬新鮮糞便DNA 樣本進行檢測，對不同養(yǎng)殖場、不同年齡段豬的豬囊等孢球蟲感染率進行比較， 并對獲得的SSU rDNA 基因片段進行序列比對分析，以期為該地區(qū)豬囊等孢球蟲病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 糞便樣本

分別于新疆維吾爾自治區(qū)巴楚縣、阿拉爾市、莎車縣、拜城縣、沙雅縣、昌吉回族自治州和若羌縣的7 個規(guī)?；B(yǎng)殖場收集801 份豬新鮮糞便樣本，其中，未斷奶仔豬（<20 d）、斷奶仔豬（21～70 d）、育肥豬（71～180 d）和成年母豬（>180 d）的糞便樣本分別為169、225、173、234 份。 每份糞便樣本采用一次性無菌手套經(jīng)直腸采集5～30 g，放置于干凈的采樣袋內(nèi)，編號并記錄相關信息，放入有冰袋的泡沫箱送至實驗室， 置于4 ℃冷藏箱保存，待檢。

1.1.2 主要試劑

E.Z.N.A.RD4015-02 糞便全基因組DNA 提取試劑盒，OMEGA Bio-Tek 公司產(chǎn)品；2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye），北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000，寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設備

PCR 儀為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品； 瓊脂糖凝膠電泳儀為北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為美國ProteinSimple 公司產(chǎn)品； 微量移液器為德國Eppendorf 公司產(chǎn)品；臺式高速離心機為湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 糞便樣本DNA 提取

每份糞便樣本挑取200 μg 左右， 按照E.Z.N.A.RD4015-02 糞便全基因組DNA 提取試劑盒操作流程，收集DNA 提取液并標記，-20 ℃保存。

1.2.2 豬囊等孢球蟲的套式PCR 檢測

基于豬囊等孢球蟲SSU rDNA 基因位點，參照盛祖勛等［11］報道的文獻設計引物，由蘇州金維智生物科技有限公司合成。 引物信息見表1。

表1 套式PCR 引物信息

套式PCR 擴增反應體系為25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix （+dye）12.5 μL， 上、 下游引物（20 μmol/L） 各0.3 μL，DNA 模 板1 μL，ddH2O 10.9 μL。 第1 輪PCR 反應以豬糞便基因組DNA 為模板， 第2 輪PCR 反應以第1 輪PCR 產(chǎn)物為模板。第1 輪PCR 反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。 第2 輪PCR 反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。 每輪套式PCR 擴增均設置陽性對照和陰性對照，陽性對照為塔里木大學獸醫(yī)寄生蟲學實驗室鑒定保存的豬囊等孢球蟲DNA 樣本，陰性對照為滅菌雙蒸水。 擴增結(jié)束后， 取5 μL 第2 輪PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察并拍照保存。

1.2.3 序列分析及種系發(fā)育進化樹構(gòu)建

將所有擴增成功的PCR 陽性產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行雙向測序。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對所獲序列進行BLAST 搜索，下載相似參考序列，用Clustal X 2.1 軟件對所獲序列進行比對分析，根據(jù)比對結(jié)果鑒定種屬。 采用MEGA 7.0軟件選擇鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建種系發(fā)育進化樹，其可靠性用Bootstrap 分析檢測，進行1 000 個重復。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

計算豬囊等孢球蟲感染率的優(yōu)勢比 （OR）和95%置信區(qū)間（95%CI）；采用χ2檢驗比較不同采樣豬場以及不同年齡段豬的感染率差異，P<0.05表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同養(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染情況

采用套式PCR 法對7 個規(guī)?；i場801 份糞便DNA 樣本進行檢測， 發(fā)現(xiàn)46 份呈豬囊等孢球蟲陽性，感染率為5.74%（46/801）（見表2）。7 個養(yǎng)殖場的糞便樣本中均檢測到豬囊等孢球蟲，以沙雅縣豬場感染率最高，為14.00%（14/100）；巴楚縣、拜城縣、莎車縣、若羌縣、昌吉回族自治州和阿拉爾市豬場的感染率分別為10.20%（10/98）、8.08%（8/99）、4.62%（6/130）、3.36%（5/149）、1.54%（2/130）和1.05%（1/95）。 不同養(yǎng)殖場之間豬囊等孢球蟲感染率統(tǒng)計學差異極顯著 （χ2=27.081，df=6，P<0.01）。

表2 不同養(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染情況

2.2 不同年齡段豬的豬囊等孢球蟲感染情況

由表3 可知， 未斷奶仔豬的豬囊等孢球蟲感染率最高，為14.79%（25/169）；斷奶仔豬、育肥豬和母豬的豬囊等孢球蟲感染率分別為5.78%（13/225）、2.31%（4/173）和1.71%（4/234）。 不同年齡段豬的豬囊等孢球蟲感染率隨著年齡增長呈下降趨勢，統(tǒng)計學差異極顯著（χ2=36.366，df=3，P<0.01）。

表3 不同年齡段豬的豬囊等孢球蟲感染情況

2.3 豬囊等孢球蟲SSU rDNA序列比對和種系發(fā)育分析

46 份豬囊等孢球蟲SSU rDNA 序列陽性套式PCR 產(chǎn)物送測序公司進行雙向測序， 均成功獲得序列。 序列比對結(jié)果顯示，46 條豬囊等孢球蟲SSU rDNA 序列與安徽省鳳陽縣豬源豬囊等孢球蟲分離株（GenBank 登錄號：KX808495）SSU rDNA序列的同源性均為100%， 鑒定為豬囊等孢球蟲。該研究獲得的豬囊等孢球蟲SSU rDNA 序列與日本人源貝氏囊等孢球蟲 （Cystoisospora belli）的SSU rDNA 序列（GenBank 登錄號：AB268326）同源性為99.8%， 第446 核苷酸位置處存在1 個堿基替換C→T。 基于囊等孢球蟲SSU rDNA 序列構(gòu)建的種系發(fā)育進化樹顯示， 該研究中的豬源豬囊等孢球蟲與加拿大豬源豬囊等孢球蟲形成1 個亞群，與人源貝氏囊等孢球蟲、犬源俄亥俄囊等孢球蟲（Cystoisospora ohioensis）形成1 個大分支；與犬囊等孢球蟲（Cystoisospora canis）、 貓囊等孢球蟲（Cystoisospora felis）形成不同的分支（見圖1）。

圖1 基于囊等孢球蟲SSU rDNA 序列構(gòu)建的種系發(fā)育進化樹

3 討論

世界范圍內(nèi)，仔豬感染豬囊等孢球蟲較常見，往往引起腹瀉、脫水等癥狀［13］。 該研究發(fā)現(xiàn)，新疆部分地區(qū)的7 個規(guī)?；B(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染率為（5.74%，46/801），高于De Araújo 等［4］等報道的巴西51 個規(guī)模化養(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染率（3.74%，7/187）；低于Symeonidou 等［14］報道的希臘8 個規(guī)?；B(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染率 （6.00%，69/1 150）、Karamon 等［15］報 道 的 波 蘭104 個 規(guī) 模化養(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染率 （27.82%，217/780）、盛祖勛等［11］報道的我國安徽省7 個規(guī)?；B(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染率（13.20%，66/500）、黃儀娟［16］報道的我國廣東省6 個規(guī)?；B(yǎng)殖場豬囊等孢球蟲感染率（26.48%，116/438）。 不同國家、地區(qū)、養(yǎng)殖場之間豬囊等孢球蟲感染率存在差異，與地理環(huán)境、養(yǎng)殖規(guī)模、飼養(yǎng)方式、用藥情況和檢測方法等多種因素具有較大的相關性。

豬囊等孢球蟲感染率與豬的年齡具有一定的相關性。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未斷奶仔豬的豬囊等孢球蟲感染率最高，為14.79%（25/169），且隨年齡的增長豬囊等孢球蟲感染率呈下降趨勢， 這與國內(nèi)外的多數(shù)報道結(jié)果一致。 Schubnell 等［17］報道瑞士農(nóng)場中未斷奶仔豬的豬囊等孢球蟲感染率為13.33%（4/30）， 高于斷奶仔豬 ［10.00%（4/40）］；Symeonidou 等［14］報道希臘8 個規(guī)模化養(yǎng)殖場未斷奶仔豬的豬囊等孢球蟲感染率為19.13%（44/230），斷奶仔豬為9.13%（21/230），而在育肥豬中未發(fā)現(xiàn)感染。 在國內(nèi)，Gong 等［7］報道我國養(yǎng)殖場未斷奶仔豬的豬囊等孢球蟲感染率為15.07%（1 066/7 072），高于斷奶仔豬［6.09%（200/3 286）］。上述研究結(jié)果顯示， 未斷奶仔豬更易感染豬囊等孢球蟲。

豬囊等孢球蟲的鑒定方法主要為形態(tài)學觀察法和分子生物學方法， 形態(tài)學觀察法對研究者的技術要求較高，檢測結(jié)果易存在主觀判斷錯誤；基于豬囊等孢球蟲特異性基因位點的分子生物學檢測技術能準確鑒定豬囊等孢球蟲， 還可進行系統(tǒng)進化分析［18-19］。 臧傳佼［20］基于豬囊等孢 球蟲SSU rDNA 基因位點， 采用PCR 法成功擴增出豬囊等孢球蟲揚州株的序列， 與其他哺乳動物等孢屬球蟲的同源性均在98%以上；盛祖勛等［11］基于豬囊等孢球蟲SSU rDNA 基因位點， 采用PCR 法檢測出66 個豬囊等孢球蟲陽性樣本，其SSU rDNA 基因序列均一致， 與其他等孢屬球蟲的同源性在99%～100%。 該研究基于豬囊等孢球蟲SSU rDNA基因位點，采用套式PCR 法擴增獲得的豬源豬囊等孢球蟲序列均與安徽省鳳陽縣豬源豬囊等孢球蟲分離株同源性為100%，提示在SSU rDNA 基因位點，豬囊等孢球蟲的序列遺傳變異較小，存在穩(wěn)定遺傳特征。

該研究結(jié)果顯示， 新疆部分地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場以未斷奶仔豬的豬囊等孢球蟲感染較為常見，在今后養(yǎng)殖過程中， 應采取進一步提高飼養(yǎng)管理水平， 注意控制圈舍環(huán)境衛(wèi)生， 適度調(diào)整飼養(yǎng)密度，及時檢測和藥物治療等措施，以降低豬囊等孢球蟲病的發(fā)生率。

4 結(jié)論

該研究采用套式PCR 方法調(diào)查了新疆部分地區(qū)規(guī)?；i場豬囊等孢球蟲的感染情況， 發(fā)現(xiàn)該地區(qū)豬的豬囊等孢球蟲感染率較低，為5.74%；7 個豬場均呈豬囊等孢球蟲陽性， 以未斷奶仔豬的豬囊等孢球蟲感染率較高，為14.79%。 調(diào)查結(jié)果為該地區(qū)規(guī)?；i場豬囊等孢球蟲的檢測和豬囊等孢球蟲病的防治工作提供了基礎數(shù)據(jù)。