解淀粉芽孢桿菌β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的克隆表達(dá)及其酶學(xué)表征

陳寶莉，秦 臻，趙黎明

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，發(fā)酵工業(yè)分離提取技術(shù)研發(fā)中心，生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

幾丁質(zhì)是一種由N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，GlcNAc）通過β-1,4-糖苷鍵連接形成的天然聚糖，在自然界中來源廣泛，其年儲(chǔ)量僅次于纖維素[1-2]。以GlcNAc為代表的幾丁質(zhì)水解產(chǎn)物具有促進(jìn)骨損愈合、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)腸道和改善皮膚保水性等生理功能，且易溶于水、生物相容性好[3]，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等多個(gè)領(lǐng)域[4]。通過降解幾丁質(zhì)制備GlcNAc的方法主要有化學(xué)、物理和酶法，酶法由于較前兩者成本低、環(huán)境污染小、操作簡單，因而成為研究熱點(diǎn)[5-6]。

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.52）作為一類糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH），可作用于幾丁寡糖的非還原端，將其降解為GlcNAc。該酶是生物體降解幾丁質(zhì)和肽聚糖的關(guān)鍵酶，可替代化學(xué)水解方法，用于GlcNAc的工業(yè)制備，實(shí)現(xiàn)綠色高效生產(chǎn)。除此之外，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶也是真菌和昆蟲形成細(xì)胞壁的重要參與者，且與糖尿病、腎病有緊密的聯(lián)系，所以該酶被作為害蟲綠色防控技術(shù)中的分子靶標(biāo)[7]與上述疾病診療中的重要檢測(cè)指標(biāo)[8]。β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶因其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品和水產(chǎn)[9]等各方面都有重要的應(yīng)用價(jià)值，受到了越來越多的關(guān)注。

根據(jù)碳水化合物代謝酶CAZy數(shù)據(jù)庫（http://www.cazy.org）的分類，目前β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶分布在GH3、GH20、GH84、GH73和GH116家族中。該酶的來源多樣，存在于多種動(dòng)物組織、植物、細(xì)菌和真菌中[10-12]。例如Serratia marcescens和Aspergillus oryzae等來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶由于其具有酶活力高、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可用于酶法水解幾丁質(zhì)制備N-乙酰氨基葡萄糖[13-14]。但相對(duì)于其他類型的糖苷酶，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的研究仍較少，大部分已有報(bào)道的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活力較低，對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理之間的關(guān)系也有待深入研究。

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種革蘭氏陽性菌，其基因組中含有豐富的幾丁質(zhì)代謝酶系，其中殼聚糖酶[15]、內(nèi)切幾丁質(zhì)酶[16]都已被研究報(bào)道，也具有發(fā)掘高效β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的潛力。本研究從B. amyloliquefaciens中克隆得到一個(gè)新型β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因BaNagase，在大腸桿菌（Escherichia coli）中異源表達(dá)，通過對(duì)其蛋白質(zhì)序列分析、酶學(xué)性質(zhì)和水解歷程的研究，旨在為進(jìn)一步分子改造和實(shí)現(xiàn)β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在高效降解幾丁質(zhì)的應(yīng)用中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

B. amyloliquefaciensYX-01和pET-28a（＋）載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存；E. coliDH5α、BL21（DE3） 上?？禐槭兰o(jì)生物科技有限公司；DNA Marker DL2000、蛋白Marker、限制性內(nèi)切酶NheI和XhoI 寶生物工程（大連）有限公司；TaqDNA聚合酶 南京Vazyme生物科技有限公司；T4連接酶 美國New England Biolabs公司；對(duì)硝基苯基-β-D-乙酰氨基葡萄糖苷（4-nitrophenyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside，pNPGlcNAc）、幾丁二糖 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MyCycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀、Power Pac Basic電泳儀美國Bio-Rad公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；UV765紫外-可見分光光度計(jì)上海佑科儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1BaNagase序列分析與結(jié)構(gòu)模擬

根據(jù)NCBI提供的B. amyloliquefaciens來源潛在的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因BaNagase的編碼序列（GenBank登錄號(hào)：CBI41296.1），用SighnalP 4.0 sever（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對(duì)其核苷酸序列中的信號(hào)肽進(jìn)行分析；使用DNAMAN軟件對(duì)其核酸序列進(jìn)行分析；用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫提供的GH3家族中已有報(bào)道的糖苷酶基因序列，使用軟件MEGA7按照Neighbor-Joining運(yùn)算方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[17]；利用ClustalX2軟件進(jìn)行多重基因序列比對(duì)，并利用ESPrit3.0在線軟件（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[18-19]。利用ExPASy（https://web.expasy.org）在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量進(jìn)行預(yù)測(cè)。

基于Swiss-Model在線建模服務(wù)器（https://www.swissmodel.expasy.org/），進(jìn)行BaNagase蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，篩選與其氨基酸序列一致性高于30%的模板蛋白，利用Swiss-Model的自動(dòng)模式建立模型[20]。利用SwissDock系統(tǒng)進(jìn)行β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶與幾丁二糖對(duì)接構(gòu)象的預(yù)測(cè)；利用PyMOL作圖軟件繪制蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)和對(duì)接構(gòu)象。

1.3.2BaNagase基因擴(kuò)增與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以B. amyloliquefaciensYX-01菌株為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于PCR擴(kuò)增的引物分別為BaNagase-For（ATTCTA GCTAGCTCGACAAAACCGGACATTCC）和BaNagase-Rev（ATTCCGCTCGAGTTAAAGCGGTTTTCCGTTTT TTAGAT）（下劃線部分別為NheI和XhoI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)）。PCR體系：菌液模板1.0 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL、2×TaqMaster Mix 25 μL，用雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，按SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒說明進(jìn)行膠回收。凝膠回收片段經(jīng)NheI和XhoI雙酶切后，在T4連接酶作用下與經(jīng)NheI和XhoI雙酶切的表達(dá)載體pET-28a（＋）連接。將其熱激轉(zhuǎn)化至E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性菌落，并在菌落PCR測(cè)序鑒定后，成功構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒命名為pET-28a-BaNagase。

1.3.3 BaNagase誘導(dǎo)表達(dá)與分離純化

將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化至E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取轉(zhuǎn)化子接入LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.6～0.8，加入1‰ 1 mol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG），30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h。菌液離心后收集細(xì)胞棄上清液，用平衡緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑）吹打沉淀至懸浮，超聲波破碎細(xì)胞。10 000 r/min離心5 min，收集上清液，使用Ni-IDA親和層析柱進(jìn)行蛋白純化。Ni-IDA親和層析柱在經(jīng)5 倍柱體積的平衡緩沖液預(yù)平衡后上樣，用平衡緩沖液沖洗至OD280nm小于0.05，用含有40 mmol/L咪唑的Tris-HCl緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，40 mmol/L咪唑）進(jìn)一步除去非特異性結(jié)合蛋白，至OD280nm小于0.05。最后用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，200 mmol/L咪唑）洗脫并收集目的蛋白。分別取上清液和目的蛋白洗脫液加入蛋白電泳緩沖液，沸水浴煮沸10 min，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE，分離膠12.5%，濃縮膠4%）對(duì)蛋白分子質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。使用低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)，其中含有磷酸化酶B（97.2 kDa）、牛血清白蛋白（66.4 kDa）、卵清蛋白（44.3 kDa）、碳酸酐酶（29.0 kDa）和胰蛋白酶抑制劑（20.1 kDa）。

1.3.4 酶活力的測(cè)定

蛋白含量測(cè)定[21]：以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。取100 μL適當(dāng)稀釋的蛋白溶液，加入1 mL Bradford工作液，迅速混勻。室溫反應(yīng)3 min后，以加入等量蒸餾水為空白對(duì)照，使用分光光度計(jì)檢測(cè)595 nm波長下的吸光度。

參照Yang Shaoqing等[22]的比色法測(cè)定β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活力，取100 μL 2mmol/L pNP-GlcNAG為底物，加入50 μL 200 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），混勻，65 ℃預(yù)熱1 min，然后加入50 μL適當(dāng)稀釋的酶液，反應(yīng)10 min后，加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。待冷卻后，以等量蒸餾水為空白對(duì)照，使用分光光度計(jì)檢測(cè)410 nm波長下的吸光度。酶活力單位（U）定義：在上述條件下，每分鐘生成1 μmoL對(duì)硝基苯酚所需的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶量為1 個(gè)酶活力單位。酶比活力為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力（U/mg）。

1.3.5 重組酶BaNagase的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.5.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

將BaNagase溶液適當(dāng)稀釋于200 mmol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中，在不同溫度（40～75 ℃）條件下按1.3.4節(jié)標(biāo)準(zhǔn)酶活力方法測(cè)定其酶活力，以酶活力的最高點(diǎn)為100%，確定其最適反應(yīng)溫度。

將BaNagase溶液適當(dāng)稀釋于200 mmol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中，分別在不同溫度下（40～80 ℃）孵育30 min，然后于冰水浴中冷卻10 min后，按1.3.4節(jié)標(biāo)準(zhǔn)酶活力方法測(cè)定殘余酶活力，以未經(jīng)處理酶液的酶活力為100%，確定其溫度穩(wěn)定性。

1.3.5.2 最適pH值及pH值穩(wěn)定性的測(cè)定

將BaNagase溶液適當(dāng)稀釋于不同緩沖體系（檸檬酸鹽緩沖液：pH 4.0～6.5；磷酸鹽緩沖液：pH 5.5～8.0；Tris-HCl：pH 7.5～9.0；甘氨酸-NaOH：pH 9.0～10.5）中，在65 ℃條件下按1.3.4節(jié)標(biāo)準(zhǔn)酶活力方法測(cè)定其酶活力，以酶活力的最高點(diǎn)為100%，確定其最適反應(yīng)pH值。

將BaNagase溶液分別稀釋于以上不同pH值的緩沖體系中，置于65 ℃水浴中孵育30 min，然后于冰水浴中冷卻10 min后，按1.3.4節(jié)標(biāo)準(zhǔn)酶活力方法測(cè)定殘余酶活力，以未經(jīng)處理酶液的酶活力為100%，確定pH值穩(wěn)定性。

1.3.5.3 BaNagase底物特異性分析

分別以天然聚/寡糖（殼二糖、殼聚糖、幾丁二糖和幾丁質(zhì)）和人工合成的對(duì)硝基苯基糖苷（對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、pNP-GlcNAc）為底物，聚/寡糖與酶液按一定比例混合后于50 ℃孵育24 h。通過薄層層析法（展開劑為異丙醇-水-氨水15∶1∶7.5）對(duì)產(chǎn)物組成進(jìn)行分析。對(duì)硝基苯基糖苷水解酶活力按照1.3.4節(jié)標(biāo)準(zhǔn)酶活力方法進(jìn)行測(cè)定，以水解釋放出對(duì)硝基苯酚速率計(jì)算酶活力。

1.3.5.4 BaNagase動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

用50 mmol/L pH 6.0磷酸緩沖液配制10 個(gè)不同濃度（0.015、0.03、0.045、0.06、0.075、0.09、0.105、0.12、0.135、0.15 mmol/L）的pNP-GlcNAc作為酶水解的底物，然后加入適量的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在65 ℃反應(yīng)5 min，通過Sigma Plot軟件計(jì)算出Vmax、Km值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

酶學(xué)性質(zhì)表征中，運(yùn)用軟件Origin 9.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖形繪制，數(shù)據(jù)用 ±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 BaNagase的序列分析與結(jié)構(gòu)模擬

NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST結(jié)果顯示，BaNagase氨基酸序列與GH3家族中B. subtilis（AIY91451.1）來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶序列相似度最高，達(dá)76.97%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果（圖1）顯示BaNagase與GH3家族Clostridium paraputrificum（BAC56177.1）[23]、Rhizomucor miehei（AGC24356.1）[22]、Cellulomonas fimi（AAQ05801.1）[24]等來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶屬于同一分支，其中BaNagase與B. subtilis（AAA64351.1）[25]來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的進(jìn)化關(guān)系最近；而與GH3家族中β-D-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。BaNagase與GH3家族中其他基因來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶多重序列比對(duì)結(jié)果（圖2）顯示，有多處高度保守的氨基酸序列重合，如底物結(jié)合位點(diǎn)氨基酸Asp118、Arg126和Arg186以及活性位點(diǎn)氨基酸Asp227、His229和Asp313，尤其是與GH3家族β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因序列中高度保守的KHFPGHGDTxxDSH序列（KHFPGHGDTDVDSH）也完全一致[26]。從蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)看，其含有的α-螺旋和β-折疊在數(shù)量和位置上也與GH3家族中其他來源的蛋白序列保持一致。綜合以上，判斷BaNagase應(yīng)歸屬于GH3家族。

圖 1 BaNagase氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig. 1 Phylogenetic analysis of β-N-acetylglucosaminidase from B. amyloliquefaciens YX-01 based on amino acid sequence

通過Swiss-Model在線建模服務(wù)器對(duì)BaNagase的一級(jí)氨基酸序列進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)模型蛋白4gyk.1與目的蛋白的序列甄別率最高75.48%，序列相似度為53%，覆蓋率達(dá)98%，故選取其為模板蛋白[25]。通過SwissDock預(yù)測(cè)BaNagase與幾丁二糖對(duì)接構(gòu)象，結(jié)果如圖3所示。通過序列比對(duì)及同源建模結(jié)果預(yù)測(cè)BaNagase的蛋白結(jié)構(gòu)由雙結(jié)構(gòu)域組成，N端是GH3家族催化結(jié)構(gòu)域，為典型的（β/α）8TIM桶結(jié)構(gòu)；C端是α/β/α三明治構(gòu)造，為非催化結(jié)構(gòu)域。結(jié)合目前已有的研究發(fā)現(xiàn)，GH3家族中的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶為保留型GH，采用雙置換機(jī)制催化水解反應(yīng)[27]。BaNagase中參與催化反應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)預(yù)測(cè)為作為催化親核體的Asp313，以及保守序列KHFPGHGDTxxDSH中作為廣義酸/堿對(duì)的Asp227（加粗）和His229（加粗）[28]，且底物結(jié)合位點(diǎn)Asp118、Arg126、Arg186、Asp227、His229和Asp313都位于N端TIM桶催化結(jié)構(gòu)域中。

圖 2 BaNagase與GH3家族其他來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶氨基酸序列比對(duì)圖Fig. 2 Partial multiple sequence alignment of β-N-acetylglucosaminidase cloned from B. amyloliquefaciens and other sources in GH3 family

圖 3 BaNagase結(jié)合幾丁二糖的結(jié)構(gòu)模擬Fig. 3 Structural simulation of BaNagase binding to chitin disaccharides

2.2 基因克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以B. amyloliquefaciensYX-01基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得目的片段，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示在2 000 bp左右有一條特異的DNA擴(kuò)增條帶，大小與預(yù)期結(jié)果一致。經(jīng)過雙酶切和連接反應(yīng)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pET-28a-BaNagase。測(cè)序結(jié)果顯示B. amyloliquefaciens來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的核氨酸序列長度為1 851 bp，編碼616 個(gè)氨基酸殘基，N端帶有組氨酸標(biāo)簽。通過軟件預(yù)測(cè)其等電點(diǎn)為9.33，分子質(zhì)量為67.50 kDa。

2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a-BaNagase轉(zhuǎn)入E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中。在30 ℃、200 r/min的條件下，經(jīng)1‰ 1 mol/L的IPTG溶液誘導(dǎo)培養(yǎng)10 h，成功獲得可溶性表達(dá)的目的蛋白。超聲波細(xì)胞破壁后的上清液經(jīng)Ni-IDA親和層析柱分離純化后，得到高純度的目的蛋白。通過SDS-PAGE檢測(cè)分析（圖4），結(jié)果顯示純化后得到了單一的目的蛋白條帶，分子質(zhì)量約為67 kDa，與BaNagase的理論分子質(zhì)量大小一致。該重組蛋白以pNPGlcNAG為底物，比活力為16.42 U/mg。

圖 4 SDS-PAGE分析重組蛋白BaNagase的表達(dá)和純化Fig. 4 Expression and purification of BaNagase as shown by SDS-PAGE

2.4 BaNagase酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

測(cè)定BaNagase在不同溫度下（40～75 ℃）的酶活力，在65 ℃時(shí)酶活力最高（圖5A），β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的最適溫度多在37～60 ℃之間，BaNagase的最適反應(yīng)溫度相較其他來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶而言更高[29]。將酶液在40～75 ℃的條件下分別孵育30 min，在溫度低于55 ℃的條件下BaNagase較穩(wěn)定，殘余酶活力保持在70%以上；在60 ℃條件孵育30 min后仍保持50%的酶活力（圖5B）。研究發(fā)現(xiàn)大部分β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在不高于40 ℃的條件下穩(wěn)定性較高；在45～60 ℃時(shí)其熱穩(wěn)定性都較差，Microbacteriumsp.和Shinellasp.來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在45 ℃時(shí)半衰期分別只有3 min和2 min[14,30-31]；目前已有報(bào)道的穩(wěn)定性最高的是Trichoderma reesei來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，在60 ℃時(shí)半衰期可長達(dá)8 h[32]，而其他來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在60 ℃條件下半衰期都普遍低于15 min[29,33]。相較于其他來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，BaNagase展現(xiàn)出了更高的熱穩(wěn)定性，在較高溫度反應(yīng)條件的工業(yè)生產(chǎn)中具有應(yīng)用潛力。

圖 5 重組蛋白BaNagase的最適溫度（A）、溫度穩(wěn)定性（B）、最適pH值（C）及pH值穩(wěn)定性（D）Fig. 5 Optimum temperature (A), thermostablity (B), optimum pH (C)and pH stability (D) of the purified recombinant BaNagase

2.4.2 最適pH值和pH值穩(wěn)定性

測(cè)定在pH 4.0～10.5不同緩沖液體系中BaNagase活力，在pH 6.0時(shí)BaNagase催化活力最高（圖5C）。將酶液在不同pH值的緩沖液中孵育30 min，BaNagase在較廣的pH值范圍內(nèi)（pH 4.5～11.0）都展現(xiàn)出了很高的穩(wěn)定性，殘余酶活力均保持在70%以上（圖5D）。BaNagase具有良好的pH值穩(wěn)定性，適用于大部分食品、化學(xué)和醫(yī)藥工業(yè)的生產(chǎn)條件。

2.4.3 重組蛋白BaNagase的底物特異性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)

實(shí)驗(yàn)分別以天然糖類（殼二糖、殼聚糖、幾丁二糖和幾丁質(zhì)）和人工合成的pNP-糖苷（對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、pNP-GlcNAc）為底物。結(jié)果顯示，BaNagase對(duì)幾丁二糖（圖6）和pNP-GlcNAc表現(xiàn)出最高的水解活性，在4 h內(nèi)可將1%的幾丁二糖基本水解為GlcNAc。薄層層析檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白BaNagase對(duì)天然聚糖幾丁質(zhì)的水解率很低，且不能水解殼二糖、殼聚糖及其他人工合成的pNP底物。結(jié)果顯示BaNagase對(duì)幾丁二糖和pNP-GlcNAc有較高的催化活性，而對(duì)氨基葡萄糖類底物沒有催化活性。表明BaNagase具有嚴(yán)格的底物特異性，與已報(bào)道的大部分β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶底物特異性類似[32,34]。以pNP-GlcNAc為底物研究BaNagase的Vmax及Km分別為20.02 μmol/（min·mg）和0.055 mmol/L。

圖 6 薄層層析檢測(cè)BaNagase水解幾丁二糖的反應(yīng)歷程Fig. 6 TLC analysis of the time course of chitin disaccharide hydrolyzed by the purified recombinant β-N-acetylglucosaminidase

3 結(jié) 論

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶是生物降解法制備GlcNAc的工業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義的一類水解酶。本研究發(fā)掘得到了一種B. amyloliquefaciens來源的新型β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因（BaNagase）。BaNagase屬于GH3家族，基因序列長度為1 851 bp，共編碼616 個(gè)氨基酸殘基，與GH3家族β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶分支的親緣關(guān)系最近，與GH3家族B. subtilis來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶具有最高的序列相似度；同源建模結(jié)果顯示BaNagase為雙結(jié)構(gòu)域蛋白，3 個(gè)催化殘基（親核體Asp313和廣義酸/堿對(duì)Asp227/His229）以及底物結(jié)合位點(diǎn)Asp118、Arg126、Arg186、Asp227、His229和Asp313都位于N端TIM桶結(jié)構(gòu)域中。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，BaNagase以pNP-GlcNAc為底物的比活力為16.42 U/mg，對(duì)pNP-GlcNAc和幾丁二糖有較高的催化活性。該酶在4 h內(nèi)可將幾丁二糖基本水解得到GlcNAc；在溫度低于55 ℃的條件下，BaNagase能保持相對(duì)酶活力高于70%，相比其他來源的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶具有更高的熱穩(wěn)定性，適用于對(duì)熱穩(wěn)定性要求較高的生產(chǎn)應(yīng)用。研究結(jié)果拓展了β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶酶庫資源，為GlcNAc酶法制備及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基礎(chǔ)研究提供了理論支持。