環(huán)狀RNA在卵巢癌中的研究進(jìn)展

王冠 張惠晶 王爽 段麗 邢焱玲 王莉莉 李佩玲

作者單位：1 黑龍江省醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江 哈爾濱 150000；2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江 哈爾濱 150000

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是婦科惡性腫瘤中病死率最高的疾病，每年有超過20 萬例的新增診斷病例。據(jù)報(bào)道，中國卵巢癌患者的5 年生存率在2005—2014 年變化甚微，低至30%，60%的患者在最初診斷時(shí)已處于卵巢癌Ⅲ期至卵巢癌Ⅳ期，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，難以在疾病早期進(jìn)行診斷[1]。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和輔以鉑類為主的聯(lián)合化療，是目前OC 標(biāo)準(zhǔn)化治療的主要方法。缺少有效的預(yù)防措施、早期治療的困難和化療耐藥而引起的復(fù)發(fā)都是造成低水平總生存期（overall survival，OS）的主要因素。OC 的發(fā)生與組織中基因的表達(dá)改變有關(guān)，這些基因調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，是腫瘤惡性進(jìn)展的關(guān)鍵因子。上述原因，使得尋找用于OC 診斷與預(yù)后預(yù)測的潛在生物標(biāo)記，以及發(fā)現(xiàn)新的醫(yī)學(xué)治療靶點(diǎn)的任務(wù)越來越緊迫。文章主要就環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）的分子特征、在惡性腫瘤中發(fā)揮的作用、其作為OC 生物標(biāo)志物的可行性，以及其作為內(nèi)源性RNA 吸附微小RNA（microRNA，miRNA），上調(diào)miRNA 靶基因的表達(dá)，間接參與OC 的發(fā)生、發(fā)展過程作一綜述。

1 circRNA 分子概述

人類基因組計(jì)劃顯示，約3 萬條人類基因組能夠完成蛋白質(zhì)的編碼。此比例在人類基因組序列的總數(shù)中不超過3%。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）一直被認(rèn)為是不能編碼蛋白質(zhì)的“垃圾區(qū)域”。事實(shí)上，非編碼RNA 與人類疾病關(guān)系密切，在正常生理水平和病理狀態(tài)下進(jìn)行非編碼RNA 機(jī)制的研究。在正常生理水平和病理狀態(tài)下進(jìn)行ncRNA 機(jī)制的研究，能夠?yàn)閺V大醫(yī)務(wù)工作者在疾病早期診斷和治療中，提供新的思路和理論依據(jù)。

研究結(jié)果表明，ncRNA 中的circRNA 并不具有直接編碼蛋白質(zhì)的功能，在人身體的不同組織中廣泛表達(dá)。其在惡性腫瘤組織與細(xì)胞中異常表現(xiàn)，同惡性腫瘤的產(chǎn)生和進(jìn)展之間也存在著聯(lián)系，已被證實(shí)在臨床中具有潛在的應(yīng)用前景。科研人員們希望通過對circRNA 作用機(jī)制的深入研究，能夠進(jìn)一步揭開惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的潛在機(jī)制，進(jìn)而給惡性腫瘤的預(yù)防與治療帶來全新的思考。早在20 世紀(jì)70 年代，circRNA 就已第一次在電子顯微鏡下觀察病毒時(shí)被發(fā)現(xiàn)了。circRNA 是非編碼RNA 族中最晚發(fā)現(xiàn)的RNA，主要來自前體信使RNA（precursor messenger RNA，pre-mRNA），是廣泛分布于所有真核生物中的新型內(nèi)源性RNA。和傳統(tǒng)的線性RNA 結(jié)構(gòu)不同，它一般是在進(jìn)行蛋白質(zhì)編碼外顯子時(shí)，因經(jīng)過相反方向的剪接，形成了連結(jié)于3’和5’末端上的共價(jià)鍵結(jié)構(gòu)。如與Alu 元件或RNA的結(jié)合蛋白（RNA binding proteins，RBPs），比如震動蛋白（quaking protein，QKI Protein），即可產(chǎn)生circRNA[2]。

2 circRNA 的生物學(xué)特性

按照circRNA 的小分子、亞細(xì)胞定位構(gòu)造及其他的環(huán)化共價(jià)鍵等化學(xué)結(jié)構(gòu)的特征，circRNA 主要包括以下4 個(gè)類型：（1）外顯子circRNA（exonic circular RNAs，ecircRNA），是通過外顯子的反向拼接而成的。通過其上的內(nèi)含子連接而形成的環(huán)化，或通過套索結(jié)構(gòu)而進(jìn)行環(huán)化以及外顯子的跳躍，如具有互補(bǔ)序列，就可以直接進(jìn)行堿基配對成環(huán)，并進(jìn)行剪接生成circRNA，最終形成外顯子來源circRNA。外顯子來源的circRNA 主要分布在細(xì)胞胞漿中，并具備與miRNA 結(jié)合的化學(xué)元件，已被證實(shí)在被轉(zhuǎn)錄后，調(diào)控基因表達(dá)，并在惡性腫瘤組織中發(fā)揮重要功能。（2）內(nèi)含子來源的circRNA（intronic RNA，ciRNA），可分為Ⅰ類和Ⅱ類。線性內(nèi)含子通過與其末端的鳥苷酸2'羥基健融合，從而接近了3’末端的磷酸二酯鍵，最終取而代之，環(huán)化成RNA。（3）外顯子-內(nèi)含子circRNA（exon-intron circular RNA，EIciRNA），其形成機(jī)制類似于ecircRNA。不同之處在于，RBP 能夠?qū)Σ糠諩IciRNA 進(jìn)行調(diào)控。RBP 還能夠通過結(jié)合上下游附近的ciRNA，進(jìn)而使內(nèi)含子間距大大縮短，以實(shí)現(xiàn)對EIciRNA 的調(diào)節(jié)?？赡軈⑴c了基因的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄以及選擇性剪切。（4）通讀環(huán)狀RNA （read- through circRNA，rtcircRNA）。circRNA 有如下生物學(xué)特性：（1）表達(dá)的豐度差別很大：在人組織、血液及外泌體中均能檢測到circRNA 的表達(dá)。有研究團(tuán)隊(duì)曾報(bào)道，circRNA 在人體的成纖維細(xì)胞中，已出現(xiàn)過25 000 種之多，在人腦組織中，超過65 731 種circRNA通過高通量檢測被發(fā)現(xiàn)[3]。某些circRNA 的表達(dá)量是一般線性RNA 的10～20 倍以上，circRNA 可能是比mRNA 更加主要的轉(zhuǎn)錄本。（2）結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性：由于所有circRNA 都具有共價(jià)的閉合環(huán)構(gòu)造，而無5’端帽子結(jié)構(gòu)和3’端多聚體A 尾構(gòu)造，使之可以有效抵抗核糖核酸酶的分解，而不宜被核酸外切酶所剪切。而與之相對應(yīng)的線性RNA 的半衰期一般少于20 h。（3）保守特征：circRNA 在不同類型的生物種類間，也表現(xiàn)出了高度進(jìn)化的保守特性。有學(xué)者在對人與老鼠circRNA 的比較研究表明，circRNA 的表達(dá)僅占直系同源基因的4%。表明circRNA可能在轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生主要影響[4]。因此它可被認(rèn)為是疾病診斷的理想生物標(biāo)記物之一，需要進(jìn)一步的科學(xué)研究來證實(shí)。（4）特異性：比如在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 中，發(fā)現(xiàn)circ-DOCK1 呈現(xiàn)相對高表達(dá)水平，但是它在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 中，卻未發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)[5]。

3 circRNA 的功能

近年來，有關(guān)于circRNA 作用功能的研究成果較多。circRNA 能夠調(diào)控其他類型RNA，通過基因互作網(wǎng)絡(luò)的建立，來調(diào)控靶基因的表達(dá)。多數(shù)研究結(jié)果證明它主要在以下幾個(gè)方面發(fā)揮了生物學(xué)功能：（1）作為競爭內(nèi)源性RNA 結(jié)合miRNA，以調(diào)控靶基因的表達(dá)[6]。由于circRNA 分子富含與miRNA 相結(jié)合的堿基互補(bǔ)位點(diǎn)，因此通過與相應(yīng)的miRNA 結(jié)合，能夠消除miRNA 對其相應(yīng)的靶基因mRNA 的調(diào)控，此過程使靶基因mRNA 的表達(dá)水平提高，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了在轉(zhuǎn)錄水平上對靶基因的控制。另外，根據(jù)既往報(bào)道，大部分的circRNA 分布于細(xì)胞胞漿中。這為circRNA 能夠吸附于miRNA 家族，并作為miRNA 的海綿，提供了理論基礎(chǔ)。（2）circRNA 可以調(diào)節(jié)premRNA 的剪接。ecircRNA 可以調(diào)節(jié)pre-mRNA 選擇性剪接或能夠經(jīng)與其對應(yīng)的線性RNA 相互競爭，而抑制其親本基因的表達(dá)，兩者之間呈現(xiàn)出負(fù)性相關(guān)。（3）circRNA 能夠?qū)τH本基因進(jìn)行調(diào)控。近期的科學(xué)研究也證實(shí)，circRNA 能在RNA 聚合酶Ⅱ的作用下調(diào)節(jié)親本基因[7]?？梢栽谂cRNA 聚合酶Ⅱ復(fù)合體進(jìn)行連接后，加速基因轉(zhuǎn)錄，由此達(dá)到對自身編碼基因轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行調(diào)節(jié)的目的。（4）circRNA 與蛋白質(zhì)的相互作用：研究表明，circRNA 能夠與RBP 形成RNA-蛋白復(fù)合物，從而調(diào)控RBP，作用于靶基因發(fā)揮的生物效能[8]?；蛘遚ircRNA 可以通過與部分堿基互補(bǔ)匹配的方法，間接完成了對靶基因的控制。另外，circRNA 也可以通過與其相關(guān)的蛋白質(zhì)形成關(guān)系，對蛋白質(zhì)的功能形成影響，但此過程需要通過RNA 介導(dǎo)。（5）翻譯功能：大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，circRNA 不具備翻譯功能。但是，它可以通過與mRNA 競爭性地結(jié)合RBP 堿基互補(bǔ)位點(diǎn)來調(diào)節(jié)翻譯的過程。另外，部分環(huán)狀RNA，可以通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)結(jié)合到核糖體上，插入并合成circRNA 之后，就可以翻譯蛋白。

4 circRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

二十年來，高通量測序、RNA 提取、PCR 及蛋白印跡等技術(shù)手段，推動了分子生物學(xué)的快速進(jìn)展。研究者們對關(guān)于circRNA 在人類腫瘤中的產(chǎn)生和進(jìn)展，及對其功能的認(rèn)識，也正是通過對被鑒定識別的circRNA 數(shù)量的提高和對其功能方面的深入研究，才能完成。有許多研究人員通過上述分子生物技術(shù)都檢測到了circRNA 的異常表達(dá)。如在乳腺癌、肺癌、膠質(zhì)瘤及胰腺癌等的惡性組織中的circRNA 和相對應(yīng)的正常組織和/或癌旁組織，均具有不同表現(xiàn)。有關(guān)研究的論文報(bào)道量也在逐漸遞增，其功能機(jī)理也越來越清晰。circRNA 的相對穩(wěn)定性強(qiáng)，高特異率，含量豐富，在癌癥組織與正常組織中具有顯著的表達(dá)差異等特點(diǎn)，是未來作為惡性腫瘤早期診斷的較為理想的生物標(biāo)記物。目前的研究成果已經(jīng)證明，circ-0000190 可能是一個(gè)全新的無創(chuàng)胃癌檢測生物標(biāo)記物，其敏感度和特異性程度都高于臨床上用于常規(guī)腫瘤檢測的CEA、CA-199 等[9]。circ-0013958 可作為無創(chuàng)生物標(biāo)記物，對肺腺癌進(jìn)行早期檢測和篩查。有研究人員證明了circRNA 與miRNA 之間的主要作用方式是由于circRNA 中具有許多與miRNA 家族堿基序列互補(bǔ)匹配的結(jié)合位點(diǎn)，可成為miRNA 的分子內(nèi)“海綿”[10]。當(dāng)miRNA 分子像“海綿”那樣被circRNA 所吸收后，miRNA 失去對靶基因作用，從而使得miRNA 的靶基因表達(dá)水平顯著提高，間接地參與了許多惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展等過程。研究表明circRNA 可能是與miRNA 競爭的ceRNAs，以調(diào)控基因表達(dá)和變異[11]。例如，circABCC2 通過浸潤miR-665 促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[12]。circHECTD1 通過靶向miR-1256 和激活catenin/MYC 通路促進(jìn)胃癌發(fā)展[13]。在惡性腫瘤產(chǎn)生與發(fā)展的過程中，circRNA 主要是通過影響惡性腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)育、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等步驟控制惡性腫瘤細(xì)胞的發(fā)育生物學(xué)活動[14]。其中，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一種轉(zhuǎn)化過程，是腫瘤形成中的關(guān)鍵步驟，可將上皮來源的細(xì)胞驅(qū)動為惡性腫瘤。circRNA 可以通過影響MAPK/ERK 通道、影響PI3K/AKT 通道，以及影響周期的調(diào)控點(diǎn)等來控制腫瘤細(xì)胞生長。如在PI3K/AKT 途徑中，配體通過和接受器酪氨酸激酶的結(jié)合，活化了PI3K，從而使得AKT 被磷酸化，以促使細(xì)胞的正常生長。在這一過程中，CDR1as 和circNT5E通過促進(jìn)PI3K 的表達(dá)，來控制肝癌細(xì)胞的正常生長進(jìn)程[15]。ciRS-7 消除miR-135a-5p 對胃癌的抑瘤作用，也是通過該信號通路[16]。根據(jù)Shuai 等[17]的報(bào)告研究成果，circ-0000285 很可能會是鼻咽癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立因素，提示了circ-0000285或許是鼻咽癌的一個(gè)新的生物標(biāo)記物，并和鼻咽癌對放療的效果是否敏感有重要關(guān)系。類似的，也有研究報(bào)告指出，circ-HIPK3 分泌量，同時(shí)還能作為鼻咽癌患者預(yù)后的1 個(gè)指標(biāo)[18]。

5 circRNA 在OC 中研究進(jìn)展

近年來，有關(guān)circRNA 在婦科惡性腫瘤中的研究也越來越多，現(xiàn)將circRNA 在OC 中的相關(guān)研究匯總?cè)缦隆?/p>

目前在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)了較多異常表達(dá)的circRNAs。Ahmed等[19]運(yùn)用高通量測序的方法，對3 例晚期OC 原發(fā)病灶組織、腹膜轉(zhuǎn)移病灶組織以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶組織進(jìn)行了全面的circRNA 測定。結(jié)果顯示，在OC 中，可檢測和鑒定出數(shù)萬種circRNA 的表達(dá)異常。在OC 原發(fā)癌灶小組中，circRNA的相對表達(dá)水平也遠(yuǎn)高于其所對應(yīng)的線性mRNA。相關(guān)文章報(bào)道，對于那些和腫瘤相關(guān)的生物信號通道，例如TGF-β、NF-κB 等。因?yàn)榫€性mRNA 及circRNA 有共同表達(dá)的趨勢，產(chǎn)生了完全相悖的表現(xiàn)形式。而circRNA 的高穩(wěn)定表達(dá)，為腫瘤診斷、治療和預(yù)后，提出了高效的、完整的候選分子。為了探討OC 中circRNA 的表達(dá)譜，Ning 等[20]共收集54 例卵巢癌標(biāo)本和54 例正常卵巢組織。與正常婦女卵巢組相比，共4 000 多個(gè)circRNA 在EOC 組中的表達(dá)升高，差異明顯。另外，有兩千多個(gè)circRNA 在EOC 組中的表達(dá)上升，另有1 800多個(gè)circRNA 表達(dá)下降。Guan 等[21]證實(shí)，circ-ANKRD12 在SKOV3 中的表達(dá)高于卵巢正常上皮細(xì)胞。在SKOV3 和A2780細(xì)胞中，ANKRD12 沉默后，細(xì)胞的侵襲和遷移過程被抑制。Zhao 等[22]研究成果表明，circRNA-MYLK 的低表達(dá)與卵巢癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。此外，circ-ITCH 與EOC 的TNM 分級、卵巢癌病灶大小以及FIGO 的分期呈負(fù)性相關(guān)，而與OS 呈正性相關(guān)，起到抑癌效果[23]。研究表明，circ-HIPK3 在卵巢癌組織中，表達(dá)異常升高，與卵巢癌的預(yù)后不良相關(guān)[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，circ-0051240 在卵巢癌組織中，表達(dá)異常升高，體內(nèi)移植腫瘤的發(fā)育也受到很大程度的抑制[25]。Chen 等[26]的研究結(jié)果顯示，在沉默circ-NOLC1 后，卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力受到明顯的遏制。Gan 等[27]的研究則表明，circRNA-MYLK 在OC 組織的表達(dá)明顯高于癌旁組織。與circRNA-MYLK 低表達(dá)患者相比，circRNA-MYLK 高表達(dá)患者的病理分期更高，總生存率更低。沉默circRNA-MYLK，OC 細(xì)胞增殖能力明顯減弱。這樣的研究方式還有很多，但由于腫瘤的產(chǎn)生與發(fā)展都是多個(gè)因素影響和多環(huán)節(jié)調(diào)控的復(fù)雜過程，因此circRNA 具體的調(diào)節(jié)機(jī)理還需逐步明確。

上述研究表明，circRNA 在OC 組織與細(xì)胞系中存在表達(dá)差異。由于它具有共價(jià)閉合結(jié)構(gòu)且不易被外切酶所消化，表達(dá)水平穩(wěn)定。circRNA 可能在OC 的進(jìn)展中產(chǎn)生重要影響，并發(fā)揮了癌基因和抑制癌基因的重要功能，circRNA 還能夠作為分子標(biāo)記輔助檢測與治療OC，為研究OC 發(fā)病過程和惡性發(fā)展提出了新的潛在靶點(diǎn)，對治療包括癌癥在內(nèi)的許多慢性病具有著重大的意義。circRNA 作為miRNA 的ceRNA，在OC 的發(fā)生及惡性發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。在癌癥組織中，特異性表達(dá)的circRNA 可作為小分子誘餌吸附于miRNA 網(wǎng)絡(luò)中。而miRNA可通過對靶基因表達(dá)的抑制而調(diào)整circRNA 的表達(dá)水平。而對circRNA 來說，其最主要的調(diào)節(jié)機(jī)制便是成為miRNA 的海綿，這樣才能上調(diào)miRNA 家族以及下游靶基因的功能。而circRNA、miRNA 及其被控制的靶基因組，在OC 的調(diào)節(jié)中可能發(fā)生著相互協(xié)調(diào)、相互制約的關(guān)系。研究可以說明三者的相互關(guān)聯(lián)，在癌癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制中意義非凡，也豐富了癌癥篩查、治療的思路與方向。探索在OC 發(fā)生進(jìn)展過程中的重要基因和調(diào)控通路，能提高OC 的早期治療效果和改變治療現(xiàn)狀，進(jìn)而改善OC 患者的生存率。研究circRNA 對OC 惡性生物活動的控制效果并闡述其機(jī)理，以期為OC 的防治提出全新的思想。

OC 是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，同時(shí)還是女性惡性腫瘤中死亡率最高疾病。早期診斷困難，且后期發(fā)展迅速。目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)circRNA，如circRNA-UBAP2、circ-CELSR1、circ-TNPO 等均可能參與了OC 細(xì)胞增殖、侵襲、血管生成和淋巴管生成、自噬以及紫杉醇耐藥等多種生物學(xué)過程[28-30]。在正常生理水平和病理狀態(tài)下進(jìn)行circRNA機(jī)制的研究，能夠?yàn)閺V大醫(yī)務(wù)工作者在腫瘤早期診斷和治療中，提供新的思路和理論依據(jù)，為卵巢癌開發(fā)新的藥物靶點(diǎn)，開拓新的方向，以提高OC 的早期治療效果和改變治療現(xiàn)狀，進(jìn)而改善OC 患者的生存率。但是，由于circRNA 數(shù)量眾多，其具體的細(xì)胞學(xué)功能及在癌癥發(fā)生和進(jìn)展中詳細(xì)的分子機(jī)制尚未完全清楚，特別是circRNA-miRNA-mRNA 構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有些下游靶基因的作用廣泛。有關(guān)circRNAs 與OC 之間發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究，仍有相當(dāng)多的問題有待探討和發(fā)現(xiàn)，大部分circRNA 的功能仍未被研究。對circRNA 在各種疾病的進(jìn)展中的生物學(xué)和分子機(jī)理還沒有被充分認(rèn)識。但是，隨著現(xiàn)代生物工程技術(shù)和研究的進(jìn)展，我們將識別更多的circRNA。circRNA 作為分子標(biāo)記輔助檢測與治療OC，為研究OC 發(fā)病過程和惡性發(fā)展提出了新的潛在靶點(diǎn)，對治療包括癌癥在內(nèi)的許多慢性病具有著重大的意義。