花菜病害病原菌分離純化及鑒定

彭能勝，鄧思怡，常 威，劉 軍*，陳富華

(1.來鳳縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，湖北 來鳳 445700；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所/華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064；3.襄陽市樊城區(qū)牛首鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，湖北 襄陽 441100)

花菜別名花椰菜，是十字花科蕓薹屬的一年生或二年生的草本植物，是甘藍(lán)的變種，十字花科最著名的蔬菜之一[1]?；ú巳~大，花黃白色，球形，喜溫和氣候，耐寒力較弱，常在我國溫暖地區(qū)種植[2]。因其味美、營養(yǎng)豐富且種植經(jīng)濟(jì)較低而廣受消費(fèi)者和農(nóng)民的喜愛[3]。近年來，花菜的種植面積逐年增大，在湖北省天門、孝感、襄陽等地都有較大面積種植，規(guī)模位居全國前列，具有良好的社會、經(jīng)濟(jì)效益[4-6]。然而，在荊州市江陵縣普濟(jì)鎮(zhèn)的種植中發(fā)現(xiàn)一種導(dǎo)致花菜花球腐爛的病害，病重年份發(fā)病率可達(dá)40%～60%，嚴(yán)重影響了花菜的商品性，給當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶帶來巨大損失。本研究對荊州市江陵縣普濟(jì)鎮(zhèn)采集的花菜樣品上的病原進(jìn)行了分離培養(yǎng)，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法對病原進(jìn)行了鑒定，根據(jù)柯赫氏法則測定其致病性，為花菜病害在生產(chǎn)上的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2021年12月24日由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所尹延旭博士送來的荊州市江陵縣普濟(jì)鎮(zhèn)采集的感染病害的花菜植株，在實(shí)驗(yàn)室對引起花菜樣品發(fā)病的病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)儀器

PDA固體培養(yǎng)基(馬鈴薯(200 g)煮提液，葡萄糖20 g，瓊脂粉15～20 g，水1 000 mL)；光學(xué)顯微鏡；植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.3 病原菌的分離[7]

1.3.1 病樣組織塊初步培養(yǎng)

采用組織分離法[8]對花菜病葉的病健交界處進(jìn)行分離，用無菌手術(shù)刀切取0.5～1 cm大小的組織塊，用15%雙氧水清洗15 s，75%酒精清洗30 s，再用無菌水清洗三次，用滅菌濾紙吸干組織塊表面的水分，病部朝上置于PDA培養(yǎng)基中。于室溫下平放培養(yǎng)1 d，待表面生長出菌絲后再倒置培養(yǎng)2～3 d。

1.3.2 病樣菌絲及菌絲團(tuán)初步培養(yǎng)

滅菌牙簽挑取不同部位的菌絲，接種到PDA培養(yǎng)基中。于室溫下平放培養(yǎng)1 d，待表面生長出菌絲后再倒置培養(yǎng)2～3 d。

1.4 分離菌的純化[7]

用滅菌牙簽挑取疑似病原菌進(jìn)行純化培養(yǎng)。選取菌落外圍的菌絲，接種于PDA培養(yǎng)基種。于室溫下倒置培養(yǎng)3～5 d，置于4℃保存。

1.5 分子學(xué)鑒定[7]

按照植物基因組DNA提取試劑盒說明書提取病原菌DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物為ITS(ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，30個循環(huán)；72℃再延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1%瓊脂凝膠電泳檢驗(yàn)。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對。

1.6 致病性測定

將菌株在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)7 d，用直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌絲塊。把菌絲塊接種于有傷口的離體花菜葉片上，接種無菌PDA培養(yǎng)基塊作為對照，置于25℃恒溫箱中。待葉片發(fā)病后再進(jìn)行分離培養(yǎng)和鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀鑒別

葉片感染病后，初呈水漬狀，淡綠色，濕度大時長出少量白霉，病斑呈灰褐色，蔓延速度快，致葉片枯死；花球發(fā)病，多始于花球表面凹陷處，初呈水漬狀，淡綠色，濕度大時長出少量白霉，后形成菌核，嚴(yán)重時導(dǎo)致花球腐爛[9]。病樣為成株期發(fā)病，在近地面的莖、葉片上出現(xiàn)淡褐色不規(guī)則的病斑，病組織軟腐，病部表面長出白色至灰白色絮狀菌絲體，與花菜菌核病危害癥狀一致(圖1)。

圖1 感病的花菜植株

2.2 菌落形態(tài)學(xué)鑒別

純化的單菌落的菌絲為白色，培養(yǎng)期間PDA無變色現(xiàn)象。培養(yǎng)5 d后，白色菌絲平鋪在培養(yǎng)基上(如圖2左側(cè)兩個皿)；培養(yǎng)10 d后，有明顯黑色菌核(如圖2右側(cè)四個皿)。與核盤菌的菌落形態(tài)學(xué)一致。

圖2 分離出的單菌落

2.3 病原菌分子學(xué)鑒別

ITS1/4引物對提取的病原菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一清晰，大小約500 bp，滿足序列測序要求(圖3)，擴(kuò)增產(chǎn)物測序后在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BlastN序列分析，序列比對結(jié)果為核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)。

圖3 引物ITS1/4對提取DNA的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果M：DL2000; 1-3：發(fā)病花菜樣品DNA

2.4 致病性測定

菌株離體接種的致病性測定結(jié)果顯示，接種菌絲塊的葉片上的發(fā)病癥狀與田間一致；對照的PDA培養(yǎng)基塊接種沒有出現(xiàn)病斑。對接種發(fā)病的花菜植株再次分離鑒定，均鑒定為核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)。

3 結(jié)論

花菜菌核病是近年來威脅花菜花球和種子生產(chǎn)的一種流行病害，是花菜上最重要的病害之一?？梢郧秩净ú藥缀跛械慕M織器官，發(fā)病嚴(yán)重時，發(fā)病率高達(dá)50～60%，嚴(yán)重影響花菜的品質(zhì)和產(chǎn)量，限制了花菜生產(chǎn)以及制種業(yè)的發(fā)展[10-12]。本試驗(yàn)通過發(fā)病癥狀、菌落形態(tài)以及ITS序列分析，認(rèn)為樣品病害為花菜菌核病，其病原菌為核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)，為生產(chǎn)中的病害防治提供了理論依據(jù)，為之后病原的致病機(jī)理以及預(yù)防策略等方面的研究打下基礎(chǔ)。