NRG2通過(guò)調(diào)控PI3K-AKT 通路促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)巨噬細(xì)胞的M2 極化

彭友華，李婧林，張予晉，周蓉，潘 意，高貴云

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，湖南長(zhǎng)沙，410005；2 .湖南航天醫(yī)院皮膚科，湖南長(zhǎng)沙，410221)

皮膚是人體表面積最大的器官，也是保護(hù)機(jī)體內(nèi)部組織免受機(jī)械損傷、微生物感染和紫外線輻射等外部傷害的屏障。皮膚損傷后，過(guò)度的炎癥反應(yīng)、機(jī)體狀況差、并發(fā)糖尿病等原因往往阻止創(chuàng)面的修復(fù)過(guò)程，導(dǎo)致創(chuàng)面愈合延遲甚至創(chuàng)面不愈[1]，給患者心理和生理帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。神經(jīng)調(diào)節(jié)因子（neuregulins,NRGs ）是一個(gè)由4種基因編碼的家族，是一種生長(zhǎng)因子，具有協(xié)調(diào)細(xì)胞分化、軸突生長(zhǎng)、髓鞘形成和突觸形成等重要功能，還可通過(guò)直接調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性、神經(jīng)傳遞和突觸可塑性，促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，對(duì)成人大腦的功能起著至關(guān)重要的作用[2]，在多種心血管疾病中也扮演保護(hù)性和修復(fù)性生長(zhǎng)因子的角色，在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程同樣存在有利作用[3]。

已有研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞是創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞。循環(huán)單核細(xì)胞可遷移至創(chuàng)面損傷部位分化為巨噬細(xì)胞，促進(jìn)血管生成、膠原沉積及細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)進(jìn)展[4]。巨噬細(xì)胞的表型及功能還可通過(guò)創(chuàng)面微環(huán)境的變化發(fā)生改變，與中性粒細(xì)胞為主的其他細(xì)胞共同作用，完成創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程[5]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析獲得巨噬細(xì)胞相關(guān)的創(chuàng)面修復(fù)關(guān)鍵因子，驗(yàn)證NRG2在創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)基因芯片的表達(dá)情況，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討其在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用的具體機(jī)制，為創(chuàng)傷修復(fù)提供新的科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 生物信息分析

在GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)基因芯片GSE157291，比較皮膚創(chuàng)面愈合早期和晚期傷口巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。檢測(cè)平臺(tái)為GPL18480。將normalized counts 標(biāo)準(zhǔn)化后的矩陣進(jìn)行l(wèi)imma 差異分析，篩選出差異表達(dá)基因（log2FC >0.4,FDR<0.05）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞

6只SPF清潔級(jí)8～12周齡雄鼠，體重25～30g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)公司。嚴(yán)格按照國(guó)家動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

人THP-1細(xì)胞購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；CD80、CD86、CD163、CD206抗體購(gòu)

自聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成；BCA 試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL 發(fā)光液購(gòu)于杭州弗德生物科技有限公司。

1.4 構(gòu)建小鼠皮膚創(chuàng)面模型

在腹腔中注射10%的水合氯醛對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，剃去小鼠背部的毛發(fā)，面積約為3cm×3cm 。使用無(wú)菌手術(shù)剪將去直徑約為5mm 的圓形皮膚，傷口深至筋膜，觀察造模后、造模后第3d、造模后第6d及造模后第13d 的創(chuàng)面情況，并將觀察造模后、造模后第3d 定義為創(chuàng)面修復(fù)早期組，造模后第6d及造模后第13 d定義為創(chuàng)面修復(fù)晚期組。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

5% CO2，37℃條件下，使用RPMI-1640（10%FBS0.05mM β‐mercaptoethanol1% P/S ）培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1細(xì)胞。

1.7 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由GraphPad 處理，最終數(shù)據(jù)由三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)顯著性采用LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)GEO芯片篩選DEGs

基于數(shù)據(jù)集GSE157291，分析比較皮膚創(chuàng)面修復(fù)早期和晚期巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，獲得663個(gè)在創(chuàng)面修復(fù)晚期上調(diào)的DEGs及444個(gè)在創(chuàng)面修復(fù)晚期下調(diào)的DEGs，NRG2在創(chuàng)面修復(fù)晚期顯著上調(diào)。見(jiàn)圖1。

圖1 創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)GEO 芯片篩選DEGs A: DEGs 熱圖 B：基因芯片中NRG2 的表達(dá)水平

2.2 NRG2在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)水平

構(gòu)建小鼠皮膚創(chuàng)面模型，觀察小鼠皮膚外觀形態(tài)。qPCR及western blot 檢測(cè)NRG2在小鼠不同創(chuàng)面修復(fù)階段中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，創(chuàng)面修復(fù)早期，小鼠創(chuàng)面存在膿性分泌物，表皮修復(fù)不明顯；創(chuàng)面修復(fù)晚期，小鼠創(chuàng)面無(wú)膿性分泌物，創(chuàng)面面積明顯縮小，出現(xiàn)明顯的愈合趨勢(shì)。與創(chuàng)面修復(fù)早期比較，創(chuàng)面修復(fù)晚期小鼠NRG2 mRNA 及蛋白水平顯著上調(diào)。見(jiàn)圖2。

圖2 NRG2 在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的表達(dá)水平 A：小鼠創(chuàng)面外觀形態(tài)；B：qPCR 檢測(cè) NRG2 在小鼠中的表達(dá)水平；C:western blot 檢測(cè) NRG2 在小鼠中的表達(dá)水平

2.3 NRG2促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化

構(gòu)建NRG2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，將NRG2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（NRG2組）及對(duì)照質(zhì)粒（vector-NC 組轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞，通過(guò)qPCR及western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NRG2對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。結(jié)果顯示，NRG2過(guò)表達(dá)質(zhì)?？稍诩?xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)NRG2的過(guò)表達(dá)。見(jiàn)圖3。與vector-NC 組相比，NRG2組的CD80、86標(biāo)記的M1巨噬細(xì)胞百分率顯著降低，CD163、CD206標(biāo)記的M2巨噬細(xì)胞百分率顯著升高，即NRG2促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化。見(jiàn)圖4。

圖4 NRG2 過(guò)表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞 CD80（M1 型）、CD86（M1 型）、CD1636（M2 型）、CD206（M2 型）的影響

2.4 NRG2通過(guò)介導(dǎo)PI3K-AKT 通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化

將NRG2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（NRG2組）及對(duì)照質(zhì)粒（vector-NC 組）轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞，并使用PI3KAKT 抑制劑LY294002進(jìn)行干預(yù)。使用Western blot 法檢測(cè)p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 蛋白表達(dá)水平；并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表型。結(jié)果顯示，與vector-NChibitor-NC 組相比，NRG2組細(xì)胞p-PI3K、p-AKT 表達(dá)水平及，CD163、CD206標(biāo)記的M2巨噬細(xì)胞百分率均顯著上調(diào)，CD80、86標(biāo)記的M1巨噬細(xì)胞百分率顯著降低。PI3K-AKT 抑制劑LY294002抵消了NRG2的促進(jìn)作用，即NRG2通過(guò)介導(dǎo)PI3K-AKT 通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化。見(jiàn)圖5、6。

圖5 NRG2 調(diào)控 PI3K/PI3K-AKT 通路

圖6 NRG2 通過(guò)介導(dǎo)PI3K-AKT 通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2 極化

3 結(jié)論

NRGs是由四個(gè)亞型組成的表皮生長(zhǎng)因子（epidremai growth factor,EGF ）家族，在人體各組織中廣泛表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),NRGs 可通過(guò)旁分泌、近分泌等方式激活下游通路，參與脊髓、心肌等組織受損的修復(fù)過(guò)程[3,6]，在皮膚創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中，也發(fā)揮重要作用[7]。創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)涉及細(xì)胞、細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的復(fù)雜動(dòng)態(tài)過(guò)程，在影響創(chuàng)面修復(fù)的免疫細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是促進(jìn)炎癥增殖階段的關(guān)鍵因素，通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和遷移以及血管的生成過(guò)程對(duì)傷口修復(fù)至關(guān)重要[8]。因此，本研究通過(guò)生物信息分析與創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)的巨噬細(xì)胞中的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)NRGs家族中的NRG2表達(dá)存在顯著差異，因此，選擇NRG2進(jìn)行后續(xù)研究，以期探究其在創(chuàng)面修復(fù)中發(fā)揮作用的具體機(jī)制。

創(chuàng)面修復(fù)相關(guān)的巨噬細(xì)胞可分為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌炎癥因子促進(jìn)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，阻礙創(chuàng)面修復(fù)進(jìn)展，而M2型巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌抑炎因子以抑制創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的炎癥反應(yīng)，且其還可以分泌生長(zhǎng)因子，利于創(chuàng)面修復(fù)進(jìn)程[9]。本研究通過(guò)構(gòu)建NRG2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至THP-1細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化情況，發(fā)現(xiàn)NRG2能夠顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型極化，證實(shí)NRG2通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞M2極化在創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，PⅠ3K/Akt 通路可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的存活、遷移和增殖，還可協(xié)調(diào)巨噬細(xì)胞對(duì)不同代謝和炎癥信號(hào)的反應(yīng)[10]，此外，PI3K/AKT 通路在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M2極化方面也發(fā)揮重要作用[11]。而NRG激活后可進(jìn)一步激活PI3K，進(jìn)而介導(dǎo)PⅠ3K/Akt 通路[12]。本實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染NRG2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的THP-1細(xì)胞與PI3K-AKT抑制劑LY294002共同干預(yù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究一致。證實(shí)了NRG2通過(guò)介導(dǎo)PI3K-AKT 通路調(diào)控巨噬細(xì)胞M2極化，在創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮作用。

綜上所述，NRG2可通過(guò)介導(dǎo)PI3K-AKT 通路調(diào)控巨噬細(xì)胞M2極化，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程。