亞甲基藍(lán)類似物抗谷氨酸誘導(dǎo)HT22細(xì)胞氧化損傷及其機(jī)制

陳紫微，陳秋荷，蔡瑜，侯?yuàn)檴?，劉福?/p>

1.浙江藥科職業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 寧波 315000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

氧化應(yīng)激（oxidative stress, OS）是指機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species, ROS）與機(jī)體抗氧化防御功能失衡。機(jī)體內(nèi)過(guò)多的ROS通過(guò)氧化損傷多種重要的生物分子如脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)，進(jìn)一步損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能[1]。目前研究認(rèn)為多數(shù)老年相關(guān)的慢性疾病，如阿爾茨海默病 （Alzheimer’s disease, AD）、帕金森病（Parkinson’s disease, PD）、亨廷頓病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、糖尿病、心血管病等都與機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷直接相關(guān)[2-3]。

亞甲基藍(lán)（methylene blue, MB）具有廣泛的生物活性、良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及較低的毒性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。目前，MB主要用于高鐵血紅蛋白血癥、瘧疾、環(huán)磷酰胺神經(jīng)毒性等疾病的治 療[4]。MB類似物是一類與MB具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，基于廣泛的研究發(fā)現(xiàn)：MB類似物與MB相似，具有廣泛的生物活性，包括抗菌作用、抑制單胺氧化酶活性產(chǎn)生抗抑郁作用、抗氧化損傷作用等[4-8]。然而，目前關(guān)于MB結(jié)構(gòu)類似物的抗氧化損傷及其機(jī)制研究鮮有報(bào)道，深入研究MB類似物的作用及其機(jī)制，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析，對(duì)該類相關(guān)藥物的研發(fā)、應(yīng)用具有重要意義。本研究篩選出4種與MB結(jié)構(gòu)類似的化合物：2-氯吩噻嗪（2-chlorophenothiazine,2-C）、天青A（azure A, A-A）、天青B（azure B, A-B）、中性紅（neutral red, NR），見(jiàn)圖1。通過(guò)毒性分析、抗氧化活性分析及機(jī)制研究，闡明以上4種化合物抗谷氨酸（glutamate, Glu）誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞毒性作用及機(jī)制，并進(jìn)一步分析化合物結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系。

圖1 MB、NR、A-B、A-A及2-C的化學(xué)結(jié)構(gòu)

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（myocyte enhancer factor 2, MEF2）在機(jī)體生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，它們還與哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元存活、發(fā)育、分化和神經(jīng)元可塑性密切相關(guān)[9]。 MEF2D是MEF2轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族的成員，在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[10]。SALMA等[11]研究發(fā)現(xiàn)抑制MEF2D活性可引起胚胎海馬神經(jīng)元的凋亡。此外，研究發(fā)現(xiàn)OS可通過(guò)破壞MEF2D功能，參與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā) 展[12-13]，如GAO等[14]研究表明：OS可通過(guò)氧化MEF2D使其失活，進(jìn)一步誘導(dǎo)DA神經(jīng)元死亡。因此，研究認(rèn)為MEF2D可能成為抗OS損傷的重要作用靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：本研究所使用的細(xì)胞株為HT22細(xì)胞，來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 試劑：MB、2-C、A-B、A-A、NR購(gòu)買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胎牛血清，DMEM干粉由購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；H2DCF-DA、DMSO、Glu、MTT、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）檢測(cè)試劑盒購(gòu)買于南京建成生物科技有限公司。T-糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase, GSK3β）、pSer9-GSK3β、pSer473-Akt、NADH脫氫酶6（NADH dehydrogenase, ND6）、TAkt一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司（稀釋：1:500），MEF2D一抗購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司（稀釋：1:5 000），β-actin一抗購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司（稀釋：1:10 000）；山羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司（稀釋：1:1 000），兔抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Promega公司（稀釋：1:10 000）。其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器：恒溫震蕩箱（SHELLAB，美國(guó)），濾器（0.22 μm，Millipore，德國(guó)），多功能酶標(biāo)儀工作站（Floxo，美國(guó)），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Themo-fisher，美國(guó)），生物凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠），臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），-80 ℃超低溫冰箱（Sanyo，日本），光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本），酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)），垂直板蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)移（BioRad，美國(guó)），發(fā)光分子生物成影儀（Image Quant LAS 4000 mini，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 HT22細(xì)胞培養(yǎng)：從液氮罐中取出HT22細(xì)胞，迅速放置于37 ℃水浴鍋內(nèi)復(fù)蘇，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，并加入3 mL 10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，混勻，隨后將離心管放入離心機(jī) 1 000 r/min離心5 min，離心后用移液槍小心吸去上層培養(yǎng)基，加入3 mL新鮮培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移至中皿，放置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)傳代。

1.2.2 建立細(xì)胞模型：HT22細(xì)胞是一種永生化的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系，其細(xì)胞缺少Glu受體[15]，因此該細(xì)胞暴露在高濃度Glu下能夠產(chǎn)生明顯的OS損傷。該模型是研究OS的一種經(jīng)典模型。通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)研究和相關(guān)文獻(xiàn)檢索，采用2 mmol/L的Glu處理HT22細(xì)胞24 h，造成氧化損傷細(xì)胞模型。

1.2.3 MTT法檢測(cè)化合物對(duì)HT22細(xì)胞毒性：當(dāng)HT22細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用胰酶將細(xì)胞消化，離心，棄去舊培養(yǎng)基，加入適量新培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度，吸取100 μL細(xì)胞液于96孔板中使細(xì)胞密度達(dá)到1×104/孔。培養(yǎng)24 h棄去舊培養(yǎng)基加入各濃度化合物100 μL，使各化合物濃度分別為 1 μmol/L、3 μmol/L、10 μmol/L，以加DMSO為對(duì)照組（CT組）。24 h后，加入10 μL MTT試劑，置于孵箱中孵育2 h；吸去上清液，每孔加入DMSO 100 μL， 置于孵箱，孵育15 min。在多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)孔在570 nm處的吸光度。細(xì)胞存活率計(jì)算公式： （OD樣品-OD空白）/（OD對(duì)照-OD空白）×100%?；衔锇霐?shù)致死量（median lethal dose, LD50）檢測(cè)時(shí)各個(gè)化合物濃度分別為0.3 μmol/L、1 μmol/L、 3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L、1 mmol/L；以含相同濃度DMSO為對(duì)照組，其余操作與MTT檢測(cè)相同。

1.2.4 MTT法檢測(cè)化合物對(duì)Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷的保護(hù)作用：當(dāng)HT22細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用胰酶將細(xì)胞消化、離心，棄去舊培養(yǎng)基，加入適量新培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度，吸取100 μL細(xì)胞液于96孔板中使細(xì)胞密度達(dá)到1×104/孔。培養(yǎng)24 h 棄去舊培養(yǎng)基加入各濃度MB及其類似物100 μL，使各化合物濃度分別為30 nmol/L、100 nmol/L、 300 nmol/L，上述藥物孵育30 min后，均加入終濃度為2 mmol/L的Glu。同時(shí)設(shè)置DMSO對(duì)照組（CT組）及Glu組，每組6個(gè)復(fù)孔，孵育12 h后，每孔加入10 μL 的MTT儲(chǔ)備液，于37 ℃避光孵育2 h；吸去上清液，加入DMSO 100 μL，置于孵箱中15 min，在多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)孔在570 nm處的吸光度。細(xì)胞存活率計(jì)算公式： （OD樣品-OD空白）/（OD對(duì)照-OD空白）×100%。半數(shù)有效量（50% effective dose,ED50）檢測(cè)時(shí)各個(gè)化合物濃度分別為10 nmol/L、 20 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、300 nmol/L；以含相同濃度DMSO為對(duì)照組，其余操作與MTT檢測(cè)相同。

1.2.5 LDH法檢測(cè)化合物對(duì)Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷的保護(hù)作用：當(dāng)HT22細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用胰酶將細(xì)胞消化，離心，棄去舊培養(yǎng)基，加入適量新培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度，吸取100 μL細(xì)胞液于96孔板中使細(xì)胞密度達(dá)到1×104/孔。24 h后棄舊液，加入各濃度MB及其類似物100 μL，使各化合物濃度為100 nmol/L。細(xì)胞分為對(duì)照（CT）組、Glu組、藥物處理組，測(cè)定時(shí)以上分組分別測(cè)定樣品對(duì)照OD值（不加輔酶I）和樣品測(cè)定OD值（加輔酶I），各組LDH釋放百分率計(jì)算公式為： （樣品測(cè)定OD值-樣品對(duì)照OD值）/（正常組測(cè)定OD值-正常組對(duì)照OD值）×100，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 H2DCF-DA染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS：H2DCF-DA染色用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量的常用方法。當(dāng)HT22細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用胰酶將細(xì)胞消化，離心，棄去舊培養(yǎng)基，加入適量新培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度，吸取500 μL細(xì)胞液于24孔板中使細(xì)胞密度達(dá)到1×104/孔。24 h后棄上清液，加入各濃度MB及其類似物500 μL，使各化合物濃度為 100 nmol/L，化合物預(yù)處理30 min后，均加入終濃度為2 mmol/L的Glu，孵育12 h，同時(shí)設(shè)置DMSO對(duì)照組（CT組）和Glu組。細(xì)胞處理結(jié)束后吸走培養(yǎng)基，用預(yù)溫PBS輕輕洗細(xì)胞2次，吸干PBS，每孔加入500 μL含10 μmol/L H2DCF-DA的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，37 ℃孵育30 min，吸走培養(yǎng)基，用預(yù)溫PBS輕輕洗細(xì)胞兩次，以0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，1 000×g離心5 min，棄上清液，每管加入200 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入到96孔黑板中，熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度，H2DCF-DA的激發(fā)光波長(zhǎng)為490 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為525 nm。

1.2.7 Western blot檢測(cè)蛋白水平：細(xì)胞處理后，棄去培養(yǎng)基，PBS輕洗細(xì)胞2次，使用三去污裂解細(xì)胞，置于冰上裂解30 min，離心取上清液；使用BCA法檢測(cè)各組細(xì)胞總蛋白量。調(diào)整各組細(xì)胞濃度到同一濃度。在沸水中煮7 min使蛋白變性。使用8%～10%的SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)（60 min，300 mA）。使用脫脂牛奶封閉液孵育PVDF膜，在搖床上使用TBST溶液洗PVDF膜，共3次，每次5 min。在4 ℃冰箱中孵育一抗12 h；在常溫下孵育二抗1～2 h，在搖床上使用TBST溶液洗PVDF膜，共3次，每次5 min。顯影時(shí)在每張膜上滴加發(fā)光液，顯影成像。

1.2.8 siRNA干擾：細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度為40%～60%開始轉(zhuǎn)染。配制轉(zhuǎn)染溶液：A：10 μL siRNA+250 μL Opti-MEM，混勻；B：5 μL lipofectamine 3000+250 μL Opti-MEM，混勻，室溫靜置5 min；配制A液和B液期間將細(xì)胞用PBS洗2次，加入1.5 mL Opti-MEM；20 min后，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入500 μL的A、B混合液，混合混勻；將細(xì)胞放回37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后將轉(zhuǎn)染液換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，用于Western blot實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理。數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t法。根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果使用Graphpad prism 7.0制作柱狀圖，使用Adobe Photoshop作Western blot條帶圖。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MB及類似物對(duì)HT22細(xì)胞活力的影響 與CT組相比，Glu組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01）。1～10 μmol/L的2-C、A-A、A-B分別處理HT22細(xì)胞24 h，均未見(jiàn)明顯毒性（P＞0.05）。10 μmol/L NR與MB能夠明顯降低細(xì)胞活力（P＜0.01）。2-C在10 μmol/L 濃度下能夠提高細(xì)胞活力（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。LD50計(jì)算結(jié)果顯示，MB：LD50=（50.66±5.87）μmol/L， 2-C：LD50=（175.90±16.53）μmol/L，A-A：LD50=（152.40±18.36）μmol/L，A-B：LD50=（140.40± 12.48）μmol/L，NR：LD50=（73.19±8.49）μmol/L，結(jié)果表明化合物2-C、A-A、A-B及NR對(duì)HT22細(xì)胞的細(xì)胞毒性均低于MB。

圖2 MB及類似物對(duì)HT22細(xì)胞活力的影響

2.2 MB類似物抗Glu誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷作用 NR 在30～300 nmol/L濃度范圍對(duì)Glu誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷沒(méi)有明顯保護(hù)作用（P＞0.05）；30 nmol/L濃度的2-C、MB、A-B能夠明顯提高HT22細(xì)胞存活率（P＜0.01），其保護(hù)作用呈劑量依賴性。A-A在30 nmol/L 濃度下未顯示明顯保護(hù)作用，但在100 nmol/L和300 nmol/L濃度時(shí)均能明顯提高細(xì)胞存活率（P＜ 0.01），見(jiàn)圖3。EC50計(jì)算結(jié)果顯示，2-C[EC50=（34.32± 4.93）nmol/L]抗Glu誘導(dǎo)細(xì)胞損傷活性高于MB [EC50=（42.13±5.21）nmol/L]。A-A EC50=（48.96± 4.64）nmol/L，A-B EC50=（44.42±2.76）nmol/L。 LDH實(shí)驗(yàn)結(jié)果與MTT結(jié)果一致：2-C、A-B、A-A在 100 nmol/L濃度下均能顯著降低Glu誘導(dǎo)的LDH釋放（P＜0.01），而NR對(duì)Glu誘導(dǎo)的LDH釋放無(wú)明顯作用，見(jiàn)圖4。

圖3 MB類似物對(duì)Glu誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞的保護(hù)作用

圖4 MB類似物對(duì)Glu誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞中LDH釋放的影響

2.3 MB類似物減少Glu誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞內(nèi)ROS Glu組細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯升高，在100 nmol/L濃度下，NR處理組對(duì)Glu誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS沒(méi)有明顯改善；2-C，A-B、A-A均能夠明顯降低Glu誘導(dǎo)的ROS水平。見(jiàn)圖5。

圖5 MB及類似物減少HT22細(xì)胞中Glu誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS水平

2.4 MB類似物對(duì)MEF2D蛋白表達(dá)的影響 采用Western blot法檢測(cè)化合物對(duì)HT22細(xì)胞內(nèi)MEF2D 蛋白水平的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6，Glu可顯著降低HT22細(xì)胞內(nèi)MEF2D蛋白水平（P＜0.05），而化合物2-C、A-B、A-A和MB在100 nmol/L濃度下即能夠明顯升高HT22細(xì)胞內(nèi)MEF2D水平（P＜0.05或P＜0.01），NR對(duì)HT22細(xì)胞中MEF2D蛋白水平?jīng)]有明顯影響（P＞0.05）。

圖6 MB類似物提高HT22細(xì)胞中的MEF2D蛋白水平

2.5 干擾MEF2D對(duì)MB類似物抗Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷作用的影響 采用siRNA干擾序列，抑制細(xì)胞中MEF2D表達(dá)，進(jìn)一步檢測(cè)MB類似物抗Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷作用，結(jié)果顯示干擾MEF2D后，化合物2-C、A-B、A-A對(duì)HT22細(xì)胞的保護(hù)作用明顯降低（P＜ 0.01），這一結(jié)果提示MEF2D至少部分參與了化合物2-C、A-B、A-A抗Glu誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷作用。見(jiàn)圖7。

圖7 siRNA干擾MEF2D后對(duì)MB類似物抗Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷作用的影響

2.6 MB類似物激活A(yù)kt/GSK-3β/MED2D通路 采用Western blot法檢測(cè)MB類似物對(duì)T-Akt、p-Akt、T-GSK-3β、p-GSK-3β蛋白水平的影響。100 nmol/L 2-C、A-B、A-A處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)p-Akt/T-Akt比值顯著提高，p-GSK-3β/T-GSK-3β比值同樣明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖8。

圖8 MB類似物激活A(yù)kt/GSK-3β通路

2.7 Glu細(xì)胞模型中MB類似物激活A(yù)kt/GSK-3β/MED2D/ND6通路 在Glu誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞氧化損傷模型中發(fā)現(xiàn)2-C、A-B、A-A能夠激活A(yù)kt，增加GSK-3β磷酸化來(lái)抑制GSK-3β活性，提高M(jìn)EF2D蛋白水平，同時(shí)能夠提高線粒體編碼蛋白ND6的蛋白水平（P＜0.05），見(jiàn)圖9。這一結(jié)果進(jìn)一步證明Akt/GSK-3β/MEF2D/ND6可能與2-C、A-B、A-A的抗氧化損傷作用密切相關(guān)。

圖9 Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞氧化損傷模型中MB類似物激活A(yù)kt/GSK-3β/MEF2D/ND6通路

3 討論

MB是首個(gè)全人工合成的吩噻嗪結(jié)構(gòu)藥物，具有廣泛的生物活性。近年來(lái)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MB類似物具有MB相似的生物活性，包括抗菌作用、調(diào)控NO/cGMP信號(hào)通路、抑制單胺氧化酶活性產(chǎn)生抗抑郁作用、抗氧化損傷作用等[5-8]。然而，目前MB類似物抗氧化作用及其作用機(jī)制研究鮮有報(bào)道，深入研究MB類似物的抗氧化作用及其機(jī)制，將為該類藥物的研發(fā)、結(jié)構(gòu)改造及臨床應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本次研究發(fā)現(xiàn)具有酚噻嗪結(jié)構(gòu)的化合物2-C、A-B、A-A具有顯著的抗Glu誘導(dǎo)的氧化損傷作用，均在nmol/L濃度水平發(fā)揮明顯的抗氧化作用，而不具有酚噻嗪結(jié)構(gòu)的NR未顯示抗氧化損傷作用。此外，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與MB比較，2-C具有更強(qiáng)的抗氧化損傷作用及更低的細(xì)胞毒性。

目前，研究證明MEF2D能夠參與神經(jīng)元的分化并促進(jìn)神經(jīng)元存活[16]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MEF2D蛋白水平下調(diào)與多種神經(jīng)退行性疾病有關(guān)包括PD、 AD[14，17-19]。如：GUO等[20]研究發(fā)現(xiàn)羥黃酮抑制神經(jīng)元凋亡等神經(jīng)保護(hù)作用與其激活MEF2D有關(guān)。YAO等[21]研究認(rèn)為B3C可通過(guò)激活MEF2D，產(chǎn)生保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元，改善PD運(yùn)動(dòng)缺陷。

機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)Akt/GSK-3β參與調(diào)節(jié)MEF2D表 達(dá)[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)MEF2D受到GSK-3β的磷酸化修飾，MEF2D磷酸化后通過(guò)Caspase途徑介導(dǎo)降解[18，24]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MEF2D不僅在細(xì)胞核中作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)，MEF2D也定位于線粒體，并參與調(diào)控線粒體基因表達(dá)。ND6是線粒體復(fù)合體I的重要組成成分。研究發(fā)現(xiàn)ND6基因突變或者ND6蛋白水平下降，可引起線粒體復(fù)合體I結(jié)構(gòu)改變進(jìn)而引起線粒體功能障礙[25-26]。前期研究證明MEF2D可促進(jìn)線粒體編碼蛋白ND6的轉(zhuǎn)錄翻譯，提高線粒體復(fù)合物I活性，從而提高線粒體功能，降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平[27]。此外，研究結(jié)果表明：ND6基因中MEF2結(jié)合位點(diǎn)突變則會(huì)干擾線粒體復(fù)合體I的形成，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

前期研究發(fā)現(xiàn)MEF2D參與MB抗Glu誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷作用，且這一作用可能與MB的中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用密切相關(guān)[28]。因此，本研究在發(fā)現(xiàn)2-C、A-B、A-A具有抗氧化作用的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究了MEF2D與其作用的相關(guān)性。我們檢測(cè)了2-C、A-B、A-A對(duì)HT22細(xì)胞中MEF2D蛋白水平的影響，并檢測(cè)了敲低MEF2D后對(duì)2-C、A-B、A-A抗氧化損傷作用的影響，結(jié)果顯示siRNA敲低MEF2D后部分取消2-C、A-B、A-A抗氧化損傷作用，以上結(jié)果表明MEF2D參與了2-C、A-B、A-A抗氧化損傷作用。此外，我們采用Western blot法檢測(cè)2-C、A-B、A-A對(duì)Akt/GSK-3β/MEF2D/ND6通路的作用，結(jié)果顯示2-C、A-B、A-A顯著激活A(yù)kt，促進(jìn)GSK-3β磷酸化使其失活，這一作用可能與化合物升高HT22細(xì)胞內(nèi)MEF2D、ND6蛋白水平有關(guān)。

綜上所述：本次研究通過(guò)對(duì)2-C、A-B、A-A、NR四種MB類似物的抗氧化作用及其機(jī)制進(jìn)行研究結(jié)果進(jìn)行分析得出：①吩噻嗪結(jié)構(gòu)可能對(duì)該類化合物的抗氧化損傷活性起到重要作用；具有吩噻嗪結(jié)構(gòu)的化合物2-C、A-B、A-A與MB具有非常顯著的抗氧化損傷活性；②2-C與MB相比具有更低的細(xì)胞毒性，且其抗Glu誘導(dǎo)細(xì)胞損傷作用效價(jià)強(qiáng)于MB；③2-C、A-B、A-A的抗氧化損傷作用可能與其調(diào)節(jié)Akt/GSK-3β通路，提高M(jìn)EF2D、ND6蛋白水平，促進(jìn)線粒體功能有關(guān)；以上結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步開展MB類似物在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病中的研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為MB類似物的合成、結(jié)構(gòu)改造等領(lǐng)域研究提供參考。