基于TSPO的芍藥內(nèi)酯苷抗抑郁作用及機制初探

王玉露，賈 銣，陳 燕，張淑玲，周小如，王 濤

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2. 福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院藥學(xué)部，福建 福州 350001)

情緒障礙是最普遍的精神疾病之一，本世紀(jì)人類已進入“精神病時代”，二十一世紀(jì)也被稱為“抑郁癥的世紀(jì)”。抑郁癥是一種嚴(yán)重的情緒障礙，對全球健康造成重大負(fù)擔(dān)。抑郁癥具有高發(fā)病、高自殺、高復(fù)發(fā)、高致殘的特點，而識別率、就診率、治療率卻較低，它作為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題和突出社會問題已成為我國和國際社會的共識。目前臨床應(yīng)用的有效抗抑郁藥物多數(shù)為化學(xué)制品，盡管可以改善抑郁癥狀，但由于藥物的不良反應(yīng)嚴(yán)重(例如自殺傾向，性功能障礙和睡眠障礙)，約30%的抑郁癥患者對目前市面上的抗抑郁藥不能耐受[1]，許多患者被迫停止治療。因此，現(xiàn)急需研究出新靶點且毒副作用小的新型天然抗抑郁藥。

抑郁癥發(fā)病機制復(fù)雜，目前研究表明，抑郁癥的發(fā)病可能與腦內(nèi)單胺類神經(jīng)功能失衡、下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸過度活化、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)低下等因素有關(guān)，而HPA軸過度活化可導(dǎo)致腦內(nèi)海馬神經(jīng)元壞死、減少。臨床的抗抑郁藥多數(shù)是通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)單胺類神經(jīng)功能、抑制HPA軸并增加神經(jīng)營養(yǎng)與可塑性等機制來發(fā)揮治療抑郁癥的作用。

TSPO(translocator protein 18 ku，TSPO)是由5個位于線粒體外膜的跨膜蛋白組成的，在大腦主要存在于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，與配體結(jié)合后可促進膽固醇轉(zhuǎn)運入線粒體膜內(nèi)，從而促進腦內(nèi)神經(jīng)類固醇(neurosteroids，NSTs)合成。激活TSPO促進膽固醇從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運進入線粒體是NSTs合成的限速步驟，在線粒體內(nèi)，膽固醇被側(cè)鏈清除細(xì)胞色素P450酶轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮，然后孕烯醇酮轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)，在系列酶作用下合成其他NSTs。例如，在3β-羥基類固醇脫氫酶催化孕烯醇酮轉(zhuǎn)變?yōu)樵型⑦M一步在5α-還原酶等作用下代謝為別孕烯醇酮等(即四氫孕酮)。NSTs在人類情緒和應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，在抑郁、焦慮等精神系統(tǒng)疾病的治療中表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價值。TSPO為基于膠質(zhì)細(xì)胞的新生物標(biāo)志物，是近年來發(fā)現(xiàn)的新抗抑郁作用靶點[2]。在一些新藥研究中也發(fā)現(xiàn)TSPO與抑郁癥有密切的相關(guān)性[3]。

目前，傳統(tǒng)中藥為抑郁癥的治療提供了一種潛在的選擇。尉強[4]對大葉蒟進行修飾，得到的衍生物3-(3,4-甲基二氧基-5-三氟甲基苯基)-2-丙烯酸異丁基酰胺(G11-5)具有顯著的抗抑郁活性且脂溶性高，在社會失敗應(yīng)激模型的抑郁癥小鼠中發(fā)現(xiàn)G11-5能在一定程度地上調(diào)TSPO表達(dá)，表明G11-5可能介導(dǎo)線粒體自噬信號通路而實現(xiàn)抗抑郁作用。李冬梅[5]在探究烏靈菌粉抗抑郁作用的分子機制中，建立了習(xí)得性無助抑郁癥動物模型，發(fā)現(xiàn)烏靈菌粉改變了與TSPO介導(dǎo)的線粒體自噬信號通路相關(guān)的多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，從而實現(xiàn)抗抑郁作用。以上研究都說明TSPO與抑郁癥有一定的相關(guān)性，并且中藥有通過TSPO介導(dǎo)其抗抑郁作用的潛能。

芍藥內(nèi)酯苷(albiflorin)，又名白芍苷，在芍藥中的含量僅次于芍藥苷，同為芍藥中具有代表性的單萜類化合物。芍藥又稱為牡丹，白芍來源于毛茛科植物芍藥的根，是一種可以治療郁癥的中草藥，常用于中藥方劑，包括四逆散和逍遙散。在這些成分中，單萜糖苷提取物如芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷通常被描述為白芍最重要的活性成分[6]。據(jù)報道[7]，芍藥苷在大鼠和小鼠體內(nèi)具有抗抑郁作用。且何淑芬等[8]在芍藥苷與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TSPO親合力的研究時，發(fā)現(xiàn)與陽性藥TSPO特異性配體PK11195對比，無顯著性差異，提示芍藥苷與TSPO有高親合力。然而，單萜糖苷提取物的另一重要組分芍藥內(nèi)酯苷的抗抑郁作用較少報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，芍藥內(nèi)酯苷在小鼠絕望模型及大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型上有顯著的抗抑郁作用，并能增加腦內(nèi)單胺遞質(zhì)及BDNF的含量[9]。

在本課題中我們建立了小鼠慢性不可預(yù)知的應(yīng)激模型，利用了TSPO拮抗劑PK11195，首先在動物實驗中驗證了芍藥內(nèi)酯苷抗抑郁作用與TSPO的關(guān)系，并通過分子生物學(xué)方法進一步驗證了芍藥內(nèi)酯苷對TSPO及其下游NSTs的影響，探討TSPO在芍藥內(nèi)酯苷防治抑郁癥行為學(xué)效應(yīng)及其作用機制中的重要作用，從而為之后更深一步的研究和臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

清潔級ICR種小鼠80只，♂，體質(zhì)量(18～22) g，購于吳氏動物實驗公司[合格證號：SCXK(閩)201-0002]。動物分籠，在安靜、避強光且通風(fēng)的實驗室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，恒溫(22±2)℃，自然晝夜，自由食水。

芍藥內(nèi)酯苷(上海源葉生物科技有限公司，B21149-100 mg)；鹽酸氟西汀(上海源葉生物科技有限公司，S27345-5 g)；TSPO拮抗劑PK11195(上海源葉生物科技有限公司，B6401-10 mg)；蔗糖(上海源葉生物科技有限公司，S11055-100 g)；小鼠孕酮ELISA試劑盒(Enzo，美國，CATALOG NUMBER：ADI-900-011)；小鼠四氫孕酮ELISA試劑盒(ARBOR ASSAYS，美國，CATALOG NUMBER：K061-H1)；TSPO一抗(Abcam,美國，ab213654);二抗(Abcam,美國，ab205718)。

TGL-16G臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)：KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；EX224分析天平(奧豪斯儀器上海有限公司)；開場箱(50 cm×50 cm×30 cm，自制)；PM-200型高架十字迷宮裝置(成都泰盟科技有限公司)。

1.1 藥物的制備

1.1.1芍藥內(nèi)酯苷的制備[9]給藥劑量依據(jù)前期實驗結(jié)果配制如下：①低劑量組：0.875 mg藥品溶于5 mL蒸餾水中(3.5 mg·kg-1)；②中劑量組：1.75 mg藥品溶于5 mL蒸餾水中(7 mg·kg-1)；③高劑量組：3.5 mg藥品溶于5 mL蒸餾水中(14 mg·kg-1)。按分組灌胃給藥。

1.1.2鹽酸氟西汀的制備 現(xiàn)用現(xiàn)配，以蒸餾水溶解，5 mg藥品溶于10 mL蒸餾水中(10 mg·kg-1)，按分組灌胃給藥。

1.1.3TSPO拮抗劑PK11195的制備[10]現(xiàn)用現(xiàn)配，0.75 mg的PK11195以含0.4%Tween 80的蒸餾水5 mL，37 ℃超聲波水浴加熱30 min，配制成均一混懸液(3 mg·kg-1)，腹腔注射。

1.1.4蔗糖溶液的制備 現(xiàn)用現(xiàn)配，10 g的蔗糖溶于1 000 mL蒸餾水中，配置成1%(W/V)的蔗糖溶液。

1.2 糖水偏好試驗(sucrose preference test，SPT)將80只小鼠進行糖水偏好測試，實驗流程如Fig 1所示。糖水偏好測試包括培訓(xùn)和測試兩個過程。小鼠購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，首先進行48 h蔗糖飲水訓(xùn)練，前24 h只給予1%蔗糖水，后24 h同時給予1%蔗糖水和飲用水進行訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后斷水?dāng)嗍?4 h，然后進行糖水基線測試，用下式計算蔗糖偏好值(SP)：SP/%=蔗糖攝入量(g)/[蔗糖攝入量(g)+水?dāng)z入量(g)]×100%。

1.3 動物分組及給藥

將80只♂ ICR小鼠按SP值均衡分組，每組10只，分為8組即空白組、模型組、氟西汀組、芍藥內(nèi)酯苷低、中、高劑量組、PK11195組和芍藥內(nèi)酯苷高劑量+PK11195組。其中，芍藥內(nèi)酯苷高劑量+PK11195組中的給藥順序為：芍藥內(nèi)酯苷高劑量灌胃30 min后腹腔注射PK11195。在建立CUS模型期間，每天1次以0.2 mL/10 g體質(zhì)量進行給藥，連續(xù)給藥35 d。

Fig 1 Flow chart of experimental method

SPT：Sucrose Preference Test；OFT：Open Field Test；MBT：Marble Burying Test；EPMT：Elevated Plus Maze Test；NSFT：Novelty Suppressed Feeding Test

1.4 建立小鼠慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型(chronic unpredictable stress，CUS)小鼠經(jīng)受5周的慢性不可預(yù)見的應(yīng)激(CUS)。CUS方案[9,11]稍作修改，包括9種應(yīng)激：(1)24 h禁食；(2)24 h禁水；(3)暴露于頻閃和白噪聲2 h；(4)籠子傾斜(45°)12 h；(5)通宵照明；(6)潮濕籠24 h；(7)強迫游泳4 ℃，3 min；(8)束縛2 h；(9)夾尾6 min。

應(yīng)激在每天給藥1 h后以半隨機的方式施用，每天1次或2次。應(yīng)激順序每周改變，使應(yīng)激程序不可預(yù)測。這些應(yīng)激被隨機安排在1周內(nèi)，并在整個5周的實驗中重復(fù)。對照動物被安置在一個單獨的房間，并與受應(yīng)激的動物沒有接觸。

1.5 行為學(xué)測試在進行35 d CUS的最后一天，再次進行糖水偏好測試以估計CUS模型和藥物作用，確認(rèn)是否建模成功，之后進行如下所述的行為學(xué)測試。

1.5.1糖水偏好測試 同1.2。

1.5.2開場試驗(open field test，OFT) 根據(jù)文獻稍作修改[9]。小鼠開場試驗裝置為長50 cm，寬50 cm，高30 cm的無蓋正方形木箱，四周和底部均為灰黑色，用黑線將底面劃分為25個面積相等的方格，逐只進行測試。對待測小鼠在陌生新環(huán)境的隔音房間內(nèi)進行。實驗開始時將小鼠置于裝置中心方格內(nèi)，用錄像機記錄小鼠6 min內(nèi)的活動情況。記錄指標(biāo)包括：水平活動得分即小鼠穿越底面方格數(shù)(以小鼠四爪均進入方格記為1次)；垂直活動得分即小鼠直立的次數(shù)(以小鼠兩前肢離地至再放下記為1次)。每只動物只被測定1次，且被測定后需將其排泄物處理干凈，以保持裝置清潔，無測試小鼠氣味。

1.5.3新奇抑制攝食試驗[9](novelty suppressed feeding test，NSFT) 小鼠禁食24 h后，依次從固定角落被放入一個新的空鼠籠內(nèi)，中心放置已稱重的糧食。放入后，檢測小鼠首次進食的潛伏時間以及10 min消耗食物重量。小鼠進食標(biāo)準(zhǔn)為開始咀嚼食物，而不僅僅嗅食或擺弄食物。以吃食的潛伏期(s)為觀測指標(biāo)。

1.5.4高架十字迷宮試驗[9](elevated plus maze test，EPMT) 將小鼠按頭朝開臂的方向置于十字迷宮中央，高架的高度不超過30 cm，觀察者與迷宮至少保持1 m的距離，攝像機記錄5 min內(nèi)小鼠在開臂和閉臂內(nèi)的停留時間和進入次數(shù)。分別以小鼠在開臂的停留時間、進入開臂的次數(shù)除以開閉臂停留總時間、進入開閉臂總次數(shù)計算百分?jǐn)?shù)。

1.5.5彈珠埋葬試驗(marble burying test，MBT) 彈珠埋葬測試已被定性為測定小鼠焦慮癥狀的模型[12]。將小鼠單獨放置在一個長30 cm，寬30 cm，高30 cm的鼠籠中，其中含有20個干凈的玻璃球，均勻地放在直徑5 cm圓形深坑的旁邊。測試30 min，計數(shù)被埋藏的彈珠。

1.5.6取材 行為學(xué)測試后，小鼠被迅速斷頭處死，取雙側(cè)海馬，迅速冷凍并在-80 ℃下儲存待用。取3只用于Western blot法檢測海馬TSPO表達(dá)，4只用于小鼠海馬孕酮(PROG)、四氫孕酮(ALLO)含量測定。

1.6 Western blot法檢測海馬TSPO表達(dá)分離小鼠雙側(cè)海馬組織，使用RIPA裂解液提取總蛋白，測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，變性后保存至-80 ℃冰箱備用。在SDS-PAGE凝膠上分離蛋白(50 μg/泳道)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。封閉1 h后，將膜與兔多克隆抗TSPO(1 ∶1 000)或抗β-actin(1 ∶1 000)抗體在帶有Tween 20的Tris緩沖液中孵育4 ℃搖床過夜，在TBS-T中漂洗3×10 min后，加二抗孵育1 h，取出后漂洗，加入ECL化學(xué)發(fā)光底物，使用紅外成像系統(tǒng)進行成像。采用目的基因與內(nèi)參基因的吸光度比值表示相應(yīng)蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 小鼠海馬孕酮(PROG)、四氫孕酮(ALLO)含量測定按照孕酮、四氫孕酮試劑盒說明書進行操作和計算。

2 結(jié)果

2.1 芍藥內(nèi)酯苷對慢性應(yīng)激模型小鼠抑郁樣行為的影響與正常組比較，CUS模型組的SP值、水平活動得分和垂直活動得分都明顯降低(P<0.01；P<0.01；P<0.05)，攝食潛伏期明顯延長(P<0.01)，說明慢性應(yīng)激模型造模成功。與模型組相比，氟西汀組(P<0.01；P<0.01；P<0.01)、芍藥內(nèi)酯苷低、中、高劑量組(P<0.01，P<0.01；P<0.01，P<0.01，P<0.05；P<0.01，P<0.01，P<0.05)的SP值、水平活動得分和垂直活動得分均有明顯的升高，攝食潛伏期(P<0.01)明顯縮短，說明芍藥內(nèi)酯苷具有顯著的抗抑郁作用，其作用與氟西汀相當(dāng)；而PK11195組與模型組相比差異沒有顯著性，并且PK11195能逆轉(zhuǎn)芍藥內(nèi)酯苷高劑量組的作用(P<0.05，P<0.05，P<0.05；P<0.01)。見Tab 1。

2.2 芍藥內(nèi)酯苷對慢性應(yīng)激模型小鼠焦慮樣行為的影響與正常組相比，CUS模型組小鼠開臂時間百分比(P<0.01)、開臂次數(shù)百分比(P<0.05)明顯降低，彈珠埋葬數(shù)量明顯增多(P<0.01)；與模型組相比，氟西汀組(P<0.01)、芍藥內(nèi)酯苷組(P<0.01；P<0.01，P<0.05；P<0.05，P<0.01)能夠逆轉(zhuǎn)這一降低的趨勢，說明芍藥內(nèi)酯苷能改善CUS小鼠焦慮樣行為，并且PK11195能逆轉(zhuǎn)芍藥內(nèi)酯苷高劑量組的作用(P<0.05)。見Tab 2。

2.3 芍藥內(nèi)酯苷對慢性應(yīng)激模型小鼠海馬TSPO表達(dá)的影響與正常組相比，CUS模型組小鼠海馬TSPO表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，氟西汀組、芍藥內(nèi)酯苷組能夠逆轉(zhuǎn)這一降低的趨勢(P<0.01)，說明芍藥內(nèi)酯苷能改善CUS小鼠海馬TSPO 減少的情況，并且PK11195能逆轉(zhuǎn)芍藥內(nèi)酯苷高劑量組的作用(P<0.05)。

2.4 芍藥內(nèi)酯苷對慢性應(yīng)激模型小鼠海馬孕酮、四氫孕酮含量的影響與正常組相比，CUS模型組小鼠海馬孕酮和四氫孕酮含量明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，氟西汀組(P<0.01)、芍藥內(nèi)酯苷低、中、高劑量組(P<0.05；P<0.01；P<0.01)能夠逆轉(zhuǎn)這一降低的趨勢，說明芍藥內(nèi)酯苷能升高CUS小鼠海馬孕酮和四氫孕酮含量，并且PK11195能逆轉(zhuǎn)芍藥內(nèi)酯苷高劑量組的作用(P<0.01)。見Tab 3。

Tab 1 Effects of repeated administration of albiflorin on depressive-like behavior in CUS n=10)

Tab 2 Effects of administration of albiflorin on anxiety-like behavior in CUS mice n=10)

Fig 2 Effect of albiflorin on expression of TSPO in hippocampus of CUS mice n=3)

Tab 3 Effects of albiflorin on progesterone and tetrahydroprogesterone in hippocampus of CUS mice n=4)

3 討論

雖然白芍在臨床廣泛用于治療情緒失調(diào)類疾病，但研究其具體作用機制的藥理報道還較為缺乏。本課題組在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，芍藥內(nèi)酯苷在大小鼠抑郁模型中具有顯著抗抑郁作用[9]。為了進一步研究其抗抑郁機制，我們利用經(jīng)典的小鼠慢性不可預(yù)知抑郁模型(CUS)，并在藥物分組中增加了TSPO拮抗藥PK11195組，以驗證藥物的抗抑郁作用與抗抑郁新靶點TSPO的關(guān)系。

行為學(xué)實驗選取糖水偏好試驗、開場試驗和新奇抑制攝食試驗來驗證藥物的抗抑郁藥效。糖水偏嗜度實驗是判斷快感缺失的一種主要的行為學(xué)變化，而快感缺失是抑郁癥的核心癥狀。這些癥狀表現(xiàn)為對獎賞的低應(yīng)答反應(yīng)，比如對糖水?dāng)z入的減少[13]，實驗結(jié)果顯示CUS小鼠的糖水偏嗜度顯著降低，陽性藥和芍藥內(nèi)酯苷不同劑量組可逆轉(zhuǎn)此作用，說明藥物對CUS具有改善抑郁癥快感缺失的癥狀。為了進一步驗證藥物的抗抑郁藥效，我們繼續(xù)選取了開場試驗和新奇抑制攝食試驗來驗證藥效，其中，開場試驗可以用來評價動物對一些急性刺激的反應(yīng)，比如噪音等，在應(yīng)激狀態(tài)下動物的活動量會減少[14]；新奇抑制攝食本為焦慮模型，主要反映矛盾沖突狀態(tài)，但也常用于評價抗抑郁藥的慢性作用[15]。在開場試驗中，藥物能明顯逆轉(zhuǎn)CUS小鼠自發(fā)活動減少的癥狀；在新奇抑制攝食試驗中，藥物能逆轉(zhuǎn)CUS小鼠攝食潛伏期延長的作用，說明芍藥內(nèi)酯苷能增強抑郁小鼠的攝食欲望。在這3個試驗中，芍藥內(nèi)酯苷不同劑量組間無顯著性差異，PK11195都可以逆轉(zhuǎn)芍藥內(nèi)酯苷高劑量組的作用，而PK11195單用無作用，說明藥物的抗抑郁作用可能與TSPO相關(guān)，并且3個劑量均有效。

因抑郁癥常伴隨焦慮癥狀，因此我們對慢性應(yīng)激小鼠進行了高架十字迷宮和彈珠埋葬測試[12]，檢測藥物是否具有抗焦慮的作用。高架十字迷宮試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CUS小鼠進入開臂的時間和次數(shù)百分比顯著降低，說明抑郁小鼠伴有明顯的焦慮癥狀，而芍藥內(nèi)酯苷可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象；在彈珠埋葬測試中，藥物也能明顯減少CUS小鼠埋藏大理石數(shù)量增多的現(xiàn)象，說明芍藥內(nèi)酯苷能緩解抑郁小鼠的焦慮樣癥狀。同時 PK11195能夠逆轉(zhuǎn)高劑量芍藥內(nèi)酯苷的作用，說明其抗焦慮作用也與TSPO相關(guān)。

為了進一步驗證其作用機制，我們進行了Western blot和ELISA測試，檢測小鼠海馬區(qū)TSPO及其下游NSTs孕酮和四氫孕酮含量。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芍藥內(nèi)酯苷能增加CUS小鼠海馬區(qū)TSPO、孕酮和四氫孕酮含量。文獻證明[16]，TSPO為基于膠質(zhì)細(xì)胞的新生物標(biāo)志物，是近年來發(fā)現(xiàn)的最新抗抑郁作用靶點，目前國外研究發(fā)現(xiàn)，TSPO主要存在于類固醇合成組織中，包括大腦，在腦內(nèi)主要分布于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的線粒體外膜上，可以把膽固醇從線粒體膜外轉(zhuǎn)運到膜內(nèi)，合成NSTs(如四氫孕酮、孕烯醇酮等)，進而通過GABAA受體上的NSTs作用位點增強GABA傳導(dǎo)功能，改變神經(jīng)元興奮性，并抑制HPA軸功能，調(diào)節(jié)情緒及應(yīng)激反應(yīng)[17]，這些都說明了TSPO在藥物發(fā)揮抗抑郁效果中起著關(guān)鍵的作用，與本研究的結(jié)果相符。

芍藥內(nèi)酯苷的抗抑郁作用在動物實驗中能被TSPO拮抗劑PK11195阻斷，說明芍藥內(nèi)酯苷的抗抑郁藥效與TSPO有相關(guān)性。在機制研究中發(fā)現(xiàn)，芍藥內(nèi)酯苷還能增加小鼠海馬TSPO表達(dá)，并提高其下游NSTs含量，這些作用也能被PK11195阻斷，進一步說明了芍藥內(nèi)酯苷的抗抑郁作用與TSPO的關(guān)系。

綜上所述，給予芍藥內(nèi)酯苷后，可以改善慢性應(yīng)激模型小鼠的抑郁樣及焦慮樣行為，其作用機制可能與TSPO有關(guān)。但目前對芍藥內(nèi)酯苷抗抑郁作用的其他靶點及完整途徑還不夠明確，其具體的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制還有待進一步研究。