改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹(shù)脂納米結(jié)構(gòu)顆粒對(duì)內(nèi)毒素的吸附研究

裴宇盛，陳 晨，蔡 彤，陳丹丹，高 華

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹(shù)脂納米結(jié)構(gòu)顆粒是一種新型快速止血、消除炎癥的醫(yī)療器械。研究表明[1-2]，常見(jiàn)的納米類(lèi)成分能夠改善免疫細(xì)胞脫顆粒狀態(tài)，其抗炎機(jī)制可能與抑制機(jī)體肥大細(xì)胞功能活化，降低組胺及炎癥因子等相關(guān)介質(zhì)的釋放有關(guān)，在病理上表現(xiàn)出對(duì)模型動(dòng)物的保護(hù)作用。而本納米顆粒是以醫(yī)用高分子特異親和吸附材料為基礎(chǔ)，合成制備的具有“雙親性”的皂化醋酸乙烯酯/二乙烯基苯(saponification vinyl acetate/divinylbenzene，簡(jiǎn)稱(chēng)SVD)球狀顆粒共聚物骨架并固載分子手臂，以該高交聯(lián)低密度材料作為充填物，研發(fā)出的血液灌流器及口服膠囊劑型吸附材料，能夠特異性高效地清除高內(nèi)毒素血癥患者血液內(nèi)或腸源性的內(nèi)毒素，以阻斷內(nèi)毒素血癥的惡化。本課題組針對(duì)改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹(shù)脂納米結(jié)構(gòu)顆粒對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的吸附能力開(kāi)展研究，為其質(zhì)量控制和和臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1材料 改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹(shù)脂納米結(jié)構(gòu)顆粒(2021101301)由天津市權(quán)陽(yáng)醫(yī)療器械有限公司提供；動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑(2106090)購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(1810260)購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司；細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(150800-201601)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；無(wú)水乙醇(20210121)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉注射液(2012023104)購(gòu)自石家莊四藥有限公司。

1.1.2儀器 Multireax型旋渦混合器(德國(guó)Heidolph)；ELx808型內(nèi)毒素檢測(cè)儀(美國(guó)Biotek公司)。

1.2 方法

1.2.1納米材料的預(yù)處理 稱(chēng)取納米結(jié)構(gòu)顆粒1.0 g，置于50 mL無(wú)熱原的離心管中。加入10 mL無(wú)水乙醇，緩慢搖勻，浸泡10 min，用20 mL生理鹽水沖洗棄去液體，共洗5次。最后1次沖洗后、離心、去上清液，備用。

1.2.2內(nèi)毒素的吸附 在離心管中加入用內(nèi)毒素檢查用水制備的2 000 EU·L-1的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 mL，將離心管放入恒溫水浴振蕩器內(nèi)，以(90±10)r·min-1的速率，(37 ±1)℃恒溫振蕩吸附2 h。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及驗(yàn)證 取細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，使用檢查用水復(fù)溶、稀釋?zhuān)瑥?fù)溶時(shí)使用1 mL檢查用水，在旋渦混合器上混合15 min，將細(xì)菌內(nèi)毒素溶液稀釋至濃度為104、103、102、10 EU·L-1，每步稀釋都應(yīng)在混合器上混勻30 s，所得的4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌內(nèi)毒素溶液每一濃度平行2孔加入到內(nèi)毒素檢測(cè)反應(yīng)酶標(biāo)板中，每孔加樣體積為0.1 mL，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線所需溶液；另在2孔中分別加入0.1 mL檢查用水，作為陰性對(duì)照；然后每孔均加入0.1 mL已復(fù)溶好的動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑，放入酶標(biāo)儀在405 nm處進(jìn)行動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)間隔30 s，檢測(cè)持續(xù)時(shí)間90 min。進(jìn)行3次試驗(yàn)，記錄每一濃度的響應(yīng)值(Onset OD值)，并與陰性對(duì)照進(jìn)行比較。

1.2.4改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹(shù)脂納米結(jié)構(gòu)顆粒對(duì)內(nèi)毒素吸附力試驗(yàn) 使用1.2.3中的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及1.2.2制備的取吸附后的所得溶液，根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》通則1143中規(guī)定的光度法進(jìn)行吸附后液體中的內(nèi)毒素含量檢測(cè)。

1.2.5吸附率計(jì)算 按以下公式計(jì)算吸附率。

吸附率/% =(吸附前內(nèi)毒素濃度-吸附后內(nèi)毒素濃度)÷吸附前內(nèi)毒素濃度×100 %。

2 結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及驗(yàn)證結(jié)果3次試驗(yàn)的結(jié)果的陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間均大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度10 EU·L-1的反應(yīng)時(shí)間。將儀器所測(cè)結(jié)果，進(jìn)行雙對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化并采用線性擬合，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程擬合結(jié)果見(jiàn)Tab 1。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果符合規(guī)定。

Tab 1 Results of standard curve parameters

2.2 改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹(shù)脂納米結(jié)構(gòu)顆粒對(duì)內(nèi)毒素的吸附率納米顆粒在重量體積比(W/V)為10 kg·L-1的情況下，經(jīng)過(guò)預(yù)處理、吸附后，可將2 000 EU·L-1的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液吸附至內(nèi)毒素含量小于10 EU·L-1，計(jì)算吸附率數(shù)值為大于99.5%。

3 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素作為最常見(jiàn)的強(qiáng)力炎性誘導(dǎo)劑，通過(guò)被體液中的免疫細(xì)胞TLR4受體識(shí)別后，進(jìn)而使免疫細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，引起炎癥反應(yīng)[3-6]。在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染等應(yīng)激狀態(tài)下可出現(xiàn)全身網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙，免疫機(jī)能下降，腸道吸收的內(nèi)毒素過(guò)多而超過(guò)機(jī)體清除能力等情況。胃腸道粘膜缺血、壞死、屏障破壞，大量?jī)?nèi)毒素釋放入血，腸道吸收的內(nèi)毒素因肝功能障礙由側(cè)枝循環(huán)直接入體循環(huán)，或者某些組織、器官的感染也會(huì)引起外源性內(nèi)毒素入血[7]。以上情況都會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的內(nèi)毒素血癥。改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹(shù)脂納米結(jié)構(gòu)顆粒是通過(guò)吸附內(nèi)毒素的方法，高效清除患者體內(nèi)的內(nèi)毒素，因此，本課題組開(kāi)展了針對(duì)其內(nèi)毒素吸附能力的研究。采用經(jīng)典的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法—鱟試驗(yàn)法，使用納米材料吸附內(nèi)毒素，考察評(píng)價(jià)納米材料對(duì)內(nèi)毒素的吸附能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，改性苯乙烯二乙烯基苯親和樹(shù)脂納米結(jié)構(gòu)顆粒對(duì)于細(xì)菌內(nèi)毒素有高達(dá)99.5%以上的吸附力，提示該納米結(jié)構(gòu)顆粒能夠有效吸附內(nèi)毒素從而發(fā)揮藥理活性。納米結(jié)構(gòu)顆粒對(duì)內(nèi)毒素吸附的機(jī)制，可能與納米粒子的電性有關(guān)，對(duì)此我們將作進(jìn)一步研究。