丁香酚對2型糖尿病小鼠的降血糖作用及肝臟糖脂代謝信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控

張金山，金國范，劉 艷，張立會，權(quán)海燕

(1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室，2.延吉市依蘭鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院藥局，吉林 延吉 133000)

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一種由胰島素分泌缺陷及(或)胰島素抵抗引起的以高血糖為特征的慢性、全身性代謝性疾病，臨床分型主要為1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)，其中T2DM占90%～95%。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會最新發(fā)布的全球糖尿病地圖顯示, 2019年全球糖尿病患病率約為9.3%(4.63億人)，預(yù)計到2030年將增加25%升至10.2%(5.78億人)，到2045年將增加51%升至10.9%(7億人)，其中50.1%的糖尿病患者未知自己患有糖尿病[1]。已知，T2DM與遺傳因素、自身免疫以及腸道菌群等密切相關(guān)，但其病因及發(fā)病機制仍未完全闡明。此外，T2DM患病人群年輕化及其并發(fā)癥導(dǎo)致的高死亡率使其已然成為危害公眾健康的嚴(yán)重疾病之一[2]，因此，尋找能夠改善T2DM的藥物也成了研究的熱點。

肝臟作為調(diào)控機體糖脂代謝平衡的重要器官，是胰島素調(diào)控血糖平衡的主要靶器官之一，在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，機體內(nèi)糖脂代謝及胰島素穩(wěn)態(tài)受眾多共同信號通路以及交錯形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[3]。肝臟脂肪變性導(dǎo)致胰島素抵抗，使外周組織和靶器官對葡萄糖的利用障礙，導(dǎo)致血糖水平升高。因此，通過調(diào)控肝臟糖脂代謝紊亂可抑制胰島素抵抗，進(jìn)而改善T2DM。

丁香酚(eugenol)是丁香揮發(fā)油的主要揮發(fā)性成分，存在于丁香、肉桂、羅勒、肉豆蔻等芳香植物種。目前，有報道稱丁香酚具有抗炎、抗氧化、抗病毒和抗癌等多種藥理活性[4-5]。其中，丁香酚對炎癥和氧化應(yīng)激的實驗研究相對較多，但是其對T2DM及肝臟糖脂代謝等代謝性疾病的藥理作用尚不清楚。本研究以高脂飼料誘導(dǎo)C57BL/6小鼠的T2DM模型為實驗對象，探討丁香酚能否改善T2DM及肝臟糖脂代謝紊亂及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物5周齡的SPF級C57BL/6雄性小鼠通過延邊大學(xué)購買，許可證號SCXK(遼)2015-0001，飼養(yǎng)條件為(22±2)℃、濕度(50±5)%，12 h/12 h光照黑暗循環(huán)，自由攝食飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實驗。

1.2 藥物、試劑及實驗儀器丁香酚、二甲雙胍、蘇木素染液(sigma公司)?？贵wSHP、pFOXO1、pCREB、PEPCK、G6Pase購自Cell Signaling Technology；內(nèi)參actin購自Santa Cruz Biotechnology；血糖(plasma glucose, PG)、胰島素(insulin, RI)、甘油三酯(triglyceride, TG)、膽固醇(cholesterol, CT)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, AST)、抵抗素(resistin, RP)、瘦素(leptin, LP)、胃饑餓素(ghrelin, GHRP)、胰高血糖素(glucagon, GC)、血漿纖溶酶原激活抑制劑-1(Plasma plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1)試劑盒購自Stanbio Laboratory；蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶公司。臺式離心機(美國Beckman Coulter公司)；凝膠成像儀(美國protein Simple公司)；顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1高脂飼料誘導(dǎo)小鼠2型糖尿病模型的建立、分組及給藥 C57BL/6小鼠高脂飼料飼養(yǎng), 試驗飼料的成分(Tab 1)。以上述飼料飼養(yǎng)8周后，尾尖采血測定空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)，選取11.1 mmol·L-1≤FBG≤33.3 mmol·L-1者納入實驗。小鼠分為普通飼料組(RD)、高脂飼料組(HFD)、丁香酚給藥組(40 mg·kg-1·d-1)及二甲雙胍給藥組(200 mg·kg-1·d-1)，RD組及HFD組給予等量蒸餾水。以上各組均為灌胃給藥，每周測定1次血糖和體質(zhì)量，連續(xù)給藥6周。6周后，采血分離血清待測，取出肝臟組織稱質(zhì)量、-80 ℃保存，部分用4%多聚甲醛固定。

Tab 1 Composition of experimental diets

1.3.2肝指數(shù)測定 取各組小鼠肝臟，稱質(zhì)量并計算肝指數(shù)，肝指數(shù)=肝質(zhì)量/體質(zhì)量。肝組織中脂質(zhì)含量、TC、AST、ALT是利用試劑盒(Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA)和全自動分析儀(SMARTLAB, Mannheim, Germany)檢測。

1.3.3口服糖耐量試驗(OGTT)測定 給藥6周后測OGTT，小鼠禁食不禁水12 h后，測定0 h血糖，然后灌胃葡萄糖溶液(2 g·kg-1)，分別在30、60、90、120 min測量血糖。計算葡萄糖曲線下面積(arae under curve,AUC)。AUC=1/4×FBG值+1/2×0.5 h血糖值+3/4×1 h血糖值+1/2×2 h血糖值。

1.3.4生化指標(biāo) 血清中PG、RI、TG、TC、RP、LP、GHRP、GC、PAI-1是利用試劑盒(Stanbio Laboratory, Boerne, TX, USA)和全自動分析儀(SMARTLAB, Mannheim, Germany)檢測。

1.3.5肝臟組織HE染色 肝組織用4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片，HE染色、二甲苯透明，做形態(tài)學(xué)觀察。

1.3.6Western blot檢測 采用RIPA裂解液提取小鼠肝臟組織總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)等濃度后，加上樣緩沖液使蛋白變性。80 V恒壓電泳30 min，轉(zhuǎn)100 V恒壓電泳1 h，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜120 min，用5% BSA溶液封閉90 min,加入一抗SHP(1 ∶1 000)、pFOXO1(1 ∶1 000)、pCREB(1 ∶1 000)、PEPCK(1 ∶1 000)、G6Pase(1 ∶1 000)和內(nèi)參β-actin(1 ∶2 500)4 ℃孵育過夜，洗膜3次，10 min/次，加入二抗HRP(1 ∶5 000)孵育90 min, 再次洗膜后在顯影成像儀中顯色曝光，條帶用Image Lab 6.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 丁香酚對T2DM小鼠體重及肝臟的影響與RD組相比，HFD組小鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.01)，形態(tài)明顯臃腫，肝臟體積增大，脂肪變性，表面呈淡紅色。與HFD組相比，MET200組和E40組小鼠體質(zhì)量降低差異無統(tǒng)計學(xué)意義，肝臟體積減小，顏色接近于健康的暗紅色，見Fig 1。

2.2 丁香酚對T2DM小鼠肝指數(shù)、脂代謝及肝功能的影響與RD組相比，HFD組小鼠肝質(zhì)量、肝指數(shù)、脂質(zhì)含量、肝甘油三酯、ALT、AST升高2.3倍、1.3倍、3.2倍、1.5倍、6.2倍、7.8倍；與HFD組相比，MET200組和E40組小鼠肝質(zhì)量降低41.2%和18.37%、肝指數(shù)降低35.4%和12.3%、脂質(zhì)含量降低52.9%和28.9%、肝甘油三酯53.4%和46.2%、AST降低69.8%和47.2%、ALT降低47.1%和37.2%，見Fig 2。

2.3 丁香酚對T2DM小鼠OGTT的影OG-TT結(jié)果顯示，各組小鼠血糖值在30 min時間點到達(dá)頂峰后逐漸降低。與RD組比較，HFD組小鼠不同時間點的血糖值均明顯升高(P<0.01)；與HFD組比較，MET200組小鼠在不同時間點的血糖值均降低(P<0.05)，而E40組小鼠在120 min時間點的血糖值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。根據(jù)AUC表明，與RD組相比，HFD組小鼠AUC增加1.8倍；與HFD組相比，MET200組和E40組小鼠AUC降低26.6%和12.7%，見Fig 3。

Fig 1 Effects of eugenol on body weight and liver

##P<0.01 vs RD group.

2.4 丁香酚對T2DM小鼠血清各項指標(biāo)的影響與RD組相比，HFD組小鼠血清中血糖、膽固醇、抵抗素、瘦素、胰高血糖素、纖溶酶原激活物抑制劑-1水平分別升高1.9倍、1.8倍、2.4倍、33.1倍、3.6倍、2.1倍，胃饑餓素降低2.5倍，其中胰島素水平明顯升高(P<0.01)。與HFD組相比，MET200組和E40組小鼠血清中血糖降低16.6%和24.6%、胰島素降低83.0%和68.9%、瘦素降低25.7%和28.9%、胰高血糖素降低27.8%和54.5%、纖溶酶原激活物抑制劑-1水平降低24.3%和57.0%。與MET200組相比，E40組小鼠血清中抵抗素、胰高血糖素、纖溶酶原激活物抑制劑-1水平降低，見Fig 4。

2.5 丁香酚對T2DM小鼠肝組織病理學(xué)改變的影響HE染色結(jié)果顯示，RD組小鼠肝細(xì)胞大小均一、排列整齊、無細(xì)胞壞死與脂肪變性；HFD組小鼠肝細(xì)胞明顯腫脹、脂肪變性、胞質(zhì)內(nèi)可見脂滴空泡。

Fig 2 Effects of eugenol on liver index, lipid metabolism and liver function of mice

Fig 3 Effect of eugenol on OGTT in mice

與HFD組比較，MET200組和E40組小鼠細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞脂肪變性及炎癥浸潤減輕，見Fig 5。

2.6 丁香酚對T2DM病小鼠肝組織中SHP/pFOXO1/pCREB/PEPCK/G6Pase信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果示，與RD組相比，HFD組小鼠肝組織中SHP蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，PEPCK、G6Pase蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。與HFD組相比，MET200組和E40組SHP、pFOXO1、pCREB蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，PEPCK、G6Pase蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。與MET200組相比，E40組小鼠肝組織中SHP、pFOXO1、pCREB蛋白表達(dá)上調(diào)，見Fig 6。

3 討論

近年來，人們對T2DM的病因及發(fā)病機制有了深入的研究，有報道稱β細(xì)胞功能障礙和胰島素抵抗[6]、外周組織和靶器官對葡萄糖的利用障礙[7]、脂質(zhì)代謝紊亂[8]、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)[9]以及腸道菌群失調(diào)[10]等與T2DM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，尋找和研究能夠改善上述病因及發(fā)病機制的中草藥已成為研究熱點，其中，丁香酚以其所特有的抗炎、抗氧化作用而備受關(guān)注。有研究表明，丁香酚通過調(diào)節(jié)GLUT4/AMPK信號通路，增強胰島素敏感性和外周組織和靶器官對葡萄糖的利用、抑制氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)進(jìn)而延緩T2DM的發(fā)展進(jìn)程[11]。另有實驗研究指出，丁香酚通過調(diào)控肝功能標(biāo)記酶和PEPCK、G6Pase等糖代謝關(guān)鍵酶活性，降低T2DM大鼠的體質(zhì)量和肝糖原含量，提高血漿胰島素水平，從而改善T2DM[12]。本研究結(jié)果提示，丁香酚在降低T2DM血糖水平及肝臟糖脂代謝紊亂方面具有一定的療效作用。

Fig 4 Effect of eugenol on various indexes in mouse serum

1：RD； 2：HFD； 3：HFD+MET200； 4：HFD-E40.##P<0.01vsRD group;*P<0.05,**P<0.01vsHFD group

Fig 5 The histopathological changes of mouse liver (HE，100×)

Fig 6 Effects of eugenol on expression of SHP, pFOXO1, pCREB, PEPCK and G6Pase in mouse liver

#P<0.05,##P<0.01vsRD group;*P<0.05,**P<0.01vsHFD group.

2002年，McGarry在美國糖尿病協(xié)會上提出了“糖尿病是糖脂病”, 這一概念的提出使人們對T2DM發(fā)病機制的認(rèn)識逐漸從早期的胰素抵抗/血糖中心論逐漸轉(zhuǎn)向脂質(zhì)代謝紊亂為中心[13]。肝臟作為機體重要的能量代謝器官，其糖原合成和糖異生在糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗中起重要作用，因此，調(diào)控肝臟糖脂代謝可以改善T2DM[14]。本研究結(jié)果顯示，與HFD組相比，MET200組和E40組小鼠體重降低，肝臟體積減小且呈現(xiàn)健康的暗紅色。MET200組和E40組較HFD組肝指數(shù)、肝臟脂質(zhì)代謝及肝功能指標(biāo)降低。OGTT試驗顯示，MET200組和E40組較HFD組葡萄糖耐量增強，曲線下面積顯著降低，胰島β細(xì)胞功能正常。相較于HFD組，MET200組和E40組血清中血糖、胰島素、甘油三酯、抵抗素、瘦素、胰高血糖素以及纖溶酶原激活物抑制劑-1水平降低。HE染色顯示，HFD組肝細(xì)胞明顯增大并伴有大泡性脂肪變性，MET200組和E40組明顯改善肝細(xì)胞脂肪變性及肝臟病理狀態(tài)。此外，與MET200組相比，E40組小鼠血清中血糖、抵抗素、胰高血糖素、纖溶酶原激活物抑制劑-1降低水平及肝細(xì)胞脂肪變性改善更加明顯。上述研究結(jié)果顯示，丁香酚可以降低小鼠體重及肝指數(shù)、調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝紊亂、改善肝功能和肝細(xì)胞脂肪變性、抑制胰島素抵抗進(jìn)而改善T2DM。

小異二聚體伴侶(small heterodimer partner, SHP)是核激素受體超家族的孤核成員，是一種關(guān)鍵的代謝傳感器，其作為一種轉(zhuǎn)錄共抑制因子與多種核受體及轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，參與調(diào)節(jié)肝臟糖質(zhì)代謝、胰島素抵抗和β細(xì)胞功能障礙，與肥胖和T2DM切相關(guān)[15]。SHP的下游靶標(biāo)叉形頭轉(zhuǎn)錄因子1(forkhead transcription factor 1, FOXO1)和環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白B(cAMP-response element binding protein, CREB)分別在氧化應(yīng)激和胰島素抵抗、肝臟糖異生和脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用[16]。在肝臟中，活化的SHP通過直接磷酸化其下游靶標(biāo)FOXO1和CREB[17]，進(jìn)而調(diào)節(jié)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6Pase)等糖異生關(guān)鍵酶的蛋白表達(dá)[18]。與HFD組相比，MET200組和E40組小鼠肝組織中SHP、pFOXO1、pCREB蛋白表達(dá)上調(diào)，PEPCK、G6Pase蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。與MET200組相比，E40組小鼠肝組織中SHP、pFOXO1、pCREB蛋白表達(dá)明顯增加。本研究結(jié)果顯示，丁香酚能夠明顯活化SHP，激活其下游靶點FOXO1和CREB的磷酸化，抑制PEPCK、G6Pase的表達(dá)，從而調(diào)控肝臟糖脂代謝紊亂和抑制胰島素抵抗，改善T2DM。

綜上所述，丁香酚可能通過上調(diào)SHP的蛋白表達(dá)、FOXO1與CREB的磷酸化，下調(diào)PEPCK和G6Pase的蛋白表達(dá)來調(diào)控肝臟糖脂代謝和抑制胰島素抵抗，降低血糖水平，進(jìn)而為T2DM及肝臟糖脂代謝紊亂等代謝性疾病開辟新的潛在的治療途徑。