釀酒酵母PAD1 基因生物信息學(xué)分析*

尹 拓，馬福仙，韓沛辰，奚登賢，張漢堯

(西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)與草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

釀酒酵母(Saccharomyces cererisiae)隸屬于子囊菌門(Ascomycota)半子囊菌綱(Hemiascomycetes)酵母目(Saccharomy cetales)酵母科(Saccharomycetaceae) 酵母屬[Saccharomyces(E.C.Hansen 1838) Meyen][1]。幾千年前人類就已經(jīng)開始利用酵母，釀酒酵母與人類生產(chǎn)生活息息相關(guān)。20世紀(jì)中葉以來，釀酒酵母在化工行業(yè)和食品生產(chǎn)方面不斷得到推廣和應(yīng)用[2]，其研究備受關(guān)注。大量學(xué)者從基因?qū)用嫜芯酷劸平湍?，開始利用生物信息學(xué)分析法研究釀酒酵母的基因功能。張先昂等[3]采用生物信息學(xué)分析方法對貝酵母中ADR1基因進(jìn)行研究分析，最終發(fā)現(xiàn)ADR1基因是貝酵母乙醇代謝過程中與醇脫氫酶相關(guān)的正調(diào)節(jié)基因，同時(shí)也是生長過程中必要的調(diào)節(jié)基因。吳杰新等[4]采用生物信息學(xué)分析方法研究了釀酒酵母CAD1基因，結(jié)果表明：在重金屬鎘存在的逆境條件下，CAD1 蛋白與SKN7 蛋白相互作用，可增強(qiáng)釀酒酵母對鎘的抗性。

電子克隆(electronic cloning)又稱虛擬克隆(virtual cloning)，是以基因數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，利用表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags，ESTs)和基因組數(shù)據(jù)庫快速克隆已知基因或者找尋新基因的一種克隆方式。1994 年，電子克隆方法就被BOGUSKI 等用于獲取新基因；1996 年陳潤生等也開始使用電子克隆方法；后續(xù)更多學(xué)者利用電子克隆的方法搜尋新基因，到現(xiàn)在已經(jīng)獲得了眾多功能基因，如與人SR 相關(guān)的剪切調(diào)控蛋白508(SRp508)基因和TECTB基因等[5]。隨著酵母基因組研究的不斷完善，電子克隆也被引入到釀酒酵母的基因克隆。

自1980 年起，大批學(xué)者開始關(guān)注PAD1基因，關(guān)于微生物體內(nèi)的PAD1基因已經(jīng)有所報(bào)道。GOODEY 等[6]研究發(fā)現(xiàn)：啤酒酵母PAD1基因是造成POF+(POF 指引起某些特殊氣味的酚類物質(zhì))的主要原因；MEADEN 等[7]對POF1(即PAD1)基因進(jìn)行克隆，并將其轉(zhuǎn)入啤酒酵母中，但轉(zhuǎn)入的PAD1基因沉默；SHINOHARA 等[8]對200 多種葡萄酒和啤酒酵母進(jìn)行研究，結(jié)果表明：大多數(shù)都為POF 酵母，并采用Southern Blot 方法又一次證明PAD1基因是控制POF+的關(guān)鍵基因?？梢?，前人研究表明啤酒酵母中PAD1基因可以調(diào)節(jié)啤酒發(fā)酵過程中芳香族化合物的代謝。LARRSSON 等[9]在研究木質(zhì)纖維素水解時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)啤酒酵母的PAD1基因過量表達(dá)時(shí)啤酒中酒精的含量顯著增加；STRATFORD 等[10]發(fā)現(xiàn)有害酵母的PAD1基因可以調(diào)控山梨酸脫羧；PLUMRIDGE 等[11]發(fā)現(xiàn)：黑曲霉中包含的PAD1基因可以調(diào)控山梨酸和肉桂酸脫羧。PAD1基因在許多微生物中是芳香族羧酸代謝過程中的重要基因，在現(xiàn)代工業(yè)中，芳香族化合物是化工產(chǎn)業(yè)的重要原料；在釀造行業(yè)，適量芳香族化合物的存在可以極大地提高食品風(fēng)味。釀酒酵母作為模式生物，其體內(nèi)也存在PAD1基因，對其功能合理的開發(fā)利用可將釀酒酵母引入到芳香族化合物的工業(yè)生產(chǎn)和釀造行業(yè)，因此，對釀酒酵母中PAD1基因的研究具有重要意義。

本研究通過電子克隆獲取釀酒酵母PAD1基因，對PAD1基因所在的染色體進(jìn)行定位，再通過PAD1基因的堿基序列獲得氨基酸序列；借助多種在線分析工具對釀酒酵母PAD1基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、卷曲螺旋區(qū)域、潛在跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)以及三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測[3,12]，進(jìn)而為研究釀酒酵母中PAD1基因在芳香族化合物代謝過程中的作用和途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 釀酒酵母PAD1 基因序列的電子克隆

1.1.1 電子克隆探針的選取

對NCBI 數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知的PAD1基因進(jìn)行搜索，選取并下載1 條與釀酒酵母親緣關(guān)系較近的物種PAD1基因cDNA 序列[13]，然后利用NCBI 數(shù)據(jù)庫的BLAST工具進(jìn)行檢索，從檢索結(jié)果中選取多條同源性高(大于50%)的基因序列；利用同源性比對軟件MEGA-Ⅹ進(jìn)行DNA 同源性比對，再從比對結(jié)果中選擇高度保守的核苷酸序列片段(同源性為100%且連續(xù)堿基數(shù)大于18 的核苷酸序列片段)作為探針。

1.1.2 釀酒酵母基因組獲取

從酵母基因組數(shù)據(jù)庫(saccharomyces genome database，SGD)中下載釀酒酵母菌株X2180-1A(S.cerevisiaeX2180-1A)的全基因組序列[14]，并將其格式轉(zhuǎn)換為文檔格式保存。

1.1.3 目的基因在基因組中的定位

利用Word 的查找工具查找探針核苷酸序列在酵母基因組序列中的對應(yīng)位置并進(jìn)行標(biāo)記。

1.1.4 目的基因序列的獲取

PAD1基因長度一般小于1 000 bp，因此以探針標(biāo)記的位置為中心，上、下游分別延伸1 000 bp，獲得1 個(gè)長度約為2 000 bp 的核苷酸序列，即為探針延伸序列；將該序列提交至NCBI 提供的開放閱讀框(open reading frame，ORF)查找工具中查找ORF，查找結(jié)果中最長且最完整的ORF 所對應(yīng)的核苷酸序列即為電子克隆的目的基因序列。

1.2 釀酒酵母PAD1 基因的生物信息學(xué)分析

1.2.1 染色體定位

將電子克隆獲得的核苷酸序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/852150)中查詢即可獲得釀酒酵母PAD1基因的序列長度、基因編號、基因結(jié)構(gòu)以及所在染色體的定位等基本信息[3]。

1.2.2 編碼蛋白質(zhì)的進(jìn)化樹分析

將PAD1基因的堿基序列導(dǎo)入到NCBI 數(shù)據(jù)庫，利用NCBI 數(shù)據(jù)庫提供的在線分析工具BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對釀酒酵母PAD1核苷酸序列進(jìn)行翻譯，獲得對應(yīng)編碼的氨基酸序列；對該氨基酸序列進(jìn)行比對，從比對結(jié)果中選擇并下載多條與該氨基酸序列具有較高同源性的氨基酸序列，構(gòu)建PAD1基因的系統(tǒng)發(fā)生樹，分析PAD1基因編碼蛋白質(zhì)與所選取的多條氨基酸序列之間的親緣關(guān)系。建立系統(tǒng)進(jìn)化樹過程中，將參與建樹的全部氨基酸序列導(dǎo)入分子進(jìn)化遺傳分析軟件Mega-Ⅹ進(jìn)行多序列比對，采用鄰接法(neighbour-joining) (執(zhí)行參數(shù)：Bootstrap method 1 000；Poisson model；Pairwise deletion)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建[15-17]。

1.2.3 編碼蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)序列的基本性質(zhì)分析通常包括其理化性質(zhì)、親/疏水性、信號肽和亞細(xì)胞定位等4 個(gè)方面[18]。使用在線分析工具ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)分析PAD1基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；使用在線分析軟件ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)分析預(yù)測PAD1基因編碼蛋白質(zhì)的親/疏水性；使用信號肽在線預(yù)測軟件SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)對PAD1基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)測；使用在線分析工具TargetP 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/index.ph)和 PSORT Ⅱ(https://psort.hgc.jp/form2.html)預(yù)測PAD1基因編碼蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。

1.2.4 編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用在線分析工具TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測PAD1基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域；使用在線分析工具COILS Server (https://embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html)預(yù)測PAD1基因編碼蛋白質(zhì)的Coil 區(qū)；使用在線分析工具SOPMA (https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測PAD1基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.5 編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用基于同源建模的在線三維空間結(jié)構(gòu)分析工具Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/)對釀酒酵母PAD1基因所編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測[3-4,19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 獲取的釀酒酵母PAD1 序列

2.1.1 選取的電子克隆探針

通過NCBI 進(jìn)行BLAST，從結(jié)果中選取S.cerevisiaestrain Y169 chromosome Ⅳ (ID：CP0334-73.1)、S.cerevisiaestrain SY14 chromosome I,complete sequence (ID：CP029160.1)、S.cerevisiaestrain BY4742 chromosome Ⅳ,complete sequence (ID：CP026298.1)、S.cerevisiaestrain S288c chromosome Ⅳ,complete sequence (ID：CP020126.1)和S.cerevisiaeYJM555 chromosome Ⅳ sequence (ID：CP004677.2)共5 條同源性較高的核苷酸序列，經(jīng)MEGA-X 同源性比對后選取探針序列為：AGGATTTAATTACAAGAGCTGCCGATGTTTCGATTAAAGAGAATCGTAAGTTACTACTGGTTACTCGGGAAACCCCTTTATCTTCCATCCATCTTGAAAACATGTTGTCT。

2.1.2 獲取的目的基因序列

將包含目的基因的探針延伸序列提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫提供的開放閱讀框查找工具，共獲得19 個(gè)ORF，其中最長且最完整的1 條為ORF8。該核苷酸序列經(jīng)BLAST 后，結(jié)果 (圖1) 顯示：該基因編碼的蛋白質(zhì)與釀酒酵母S288C 菌株P(guān)AD1基因編碼的蛋白質(zhì)序列同源性高達(dá)100%，即認(rèn)為該核苷酸序列是所要獲取的目的基因序列。

圖1 PAD1 同源基因關(guān)系樹Fig.1 Relationship tree of PAD1 homologous genes

2.2 釀酒酵母PAD1 基因染色體定位

釀酒酵母PAD1基因?qū)氲絅CBI 基因數(shù)據(jù)庫查詢，結(jié)果表明：釀酒酵母PAD1又稱POF1，RNA 名稱phenylacrylic acid decarboxylasePAD1，外顯子數(shù)為1，全長729 bp，基因組序列：NC_001136.10，基因編號851 730，染色體定位于Ⅳ染色體1 510 902～1 511 630。

2.3 PAD1 基因的系譜發(fā)生分析

釀酒酵母PAD1基因的堿基序列全長為729 bp，其編碼的蛋白質(zhì)由242 個(gè)氨基酸連接構(gòu)成。核苷酸序列與氨基酸序列對應(yīng)如圖2 所示。

圖2 PAD1 基因核苷酸序列及蛋白質(zhì)序列Fig.2 Nucleotide sequence and protein sequence of the PAD1 gene

將由釀酒酵母PAD1基因翻譯獲得氨基酸序列導(dǎo)入到NCBI 在線分析工具中進(jìn)行蛋白質(zhì)的BLASTP，從結(jié)果中選取同源性較高的17 條蛋白質(zhì)序列(表1)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，結(jié)果顯示：克隆得到的釀酒酵母PAD1基因所編碼的蛋白質(zhì)和6 種釀酒酵母聚為一類，且與肉桂酸脫羧酶(AAA20484.1)最為接近，二者同源性高達(dá)99.59%，說明本研究克隆的PAD1基因序列正確無誤。

圖3 PAD1 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of PAD1

表1 同源性較高的17 條蛋白質(zhì)序列Tab.1 17 protein sequences with high homology

2.4 釀酒酵母PAD1 基因編碼的蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析

2.4.1 理化性質(zhì)分析

釀酒酵母PAD1基因編碼的蛋白質(zhì)包含242個(gè)氨基酸，該蛋白質(zhì)由C、H、N、O 和S 等5 種元素共同構(gòu)成，每個(gè)蛋白質(zhì)分子包含3 831 個(gè)原子，蛋白質(zhì)分子式為C1208H1950N328O336S9，相對分子質(zhì)量約為26 733.31 ku；該蛋白在pH 為9.69的溶液中呈電中性，即該蛋白質(zhì)理論等電點(diǎn)為9.69；在構(gòu)成PAD1基因編碼蛋白的所有氨基酸中，含量最高的是亮氨酸(10.7%)，含量最低的是色氨酸(1.2%)；吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸在該蛋白中都不存在；不穩(wěn)定指數(shù)為33.74，表明該蛋白是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)；脂肪指數(shù)為100.74，平均親水系數(shù)為0.137。

2.4.2 親/疏水性分析

由圖4 可知：高分值峰(score＞1.5)存在，故推斷該蛋白可能存在潛在的跨膜區(qū)；4 個(gè)高分值峰分別位于66、142、188 和196 氨基酸位點(diǎn)附近，在66 位點(diǎn)出現(xiàn)最高峰，峰值為1.700；于47 和97 氨基酸位點(diǎn)附近分別出現(xiàn)2 個(gè)低分值峰位，分值分別為-1.616 和-1.174；從整體圖像來看，正值的占比大于負(fù)值的占比。根據(jù)氨基酸疏水特性參數(shù)規(guī)律來看，氨基酸疏水性越強(qiáng)則疏水特性參數(shù)通常為越高的正值，而氨基酸的親水性強(qiáng)時(shí)則疏水特性參數(shù)通常為越低的負(fù)值[21]，故推斷PAD1基因所編碼的蛋白為疏水性蛋白，該推斷與理化性質(zhì)分析結(jié)果相符。

圖4 PAD1 基因編碼的蛋白質(zhì)的親/疏水性分析Fig.4 Analysis of hydrophobicity or hydrophobicity of protein encoded by the PAD1 gene

2.4.3 信號肽預(yù)測

由圖5 可知：釀酒酵母PAD1基因編碼的蛋白屬于非分泌蛋白，信號肽存在的概率為0.070，錨定蛋白存在的概率為0.372，在30 和31 氨基酸位點(diǎn)之間存在最大切割位點(diǎn)的概率為0.035。

圖5 PAD1 基因編碼蛋白質(zhì)的信號肽預(yù)測Fig.5 Signal peptide prediction of protein encoded by the PAD1 gene

2.4.4 亞細(xì)胞定位預(yù)測

TargetP 預(yù)測結(jié)果表明：該蛋白定位于線粒體的可能性最大(概率為0.795)，位于分泌通路的概率為0.066，位于其他位置的可能性最小(概率為0.104)，由PAD1基因所編碼蛋白的分泌途徑為“M”型，且可靠等級為2，即定位到線粒體。PSORT Ⅱ預(yù)測結(jié)果顯示：該蛋白亞細(xì)胞定位的可能性從大到小依次是線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，概率依次為47.8%、26.1%、13.0%、8.7%和4.3%。

2.5 釀酒酵母PAD1 基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5.1 蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域分析

由圖6 可知：該蛋白有部分跨膜區(qū)域存在。蛋白質(zhì)含有跨膜區(qū)，表示它可能作為膜受體起作用，也可能是在膜上的錨定蛋白或離子通道蛋白[22-23]，這些蛋白均不溶于水，故推斷該P(yáng)AD1基因編碼的蛋白質(zhì)為脂溶性蛋白。這些結(jié)果均與蛋白親/疏水性分析的推測結(jié)果相符。

圖6 PAD1 基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)分析Fig.6 Analysis of the transmembrane domain of the protein encoded by the PAD1 gene

2.5.2 蛋白質(zhì)的Coil 區(qū)分析

由圖7 可知：在Window14、28 和21 窗口中釀酒酵母PAD1基因編碼的蛋白質(zhì)殘基都不存在卷曲螺旋區(qū)域，故推斷釀酒酵母PAD1基因編碼的蛋白無卷曲螺旋區(qū)域存在。

圖7 PAD1 基因編碼蛋白質(zhì)Coil 區(qū)分析Fig.7 Analysis of Coil region of protein encoded by the PAD1 gene

2.5.3 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

預(yù)測釀酒酵母PAD1基因編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)如圖8 所示。二級結(jié)構(gòu)的組件含量自少至多依次為β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈、α-螺旋、隨機(jī)卷曲，其數(shù)量分別為20、34、84 和104，其含量占比分別為8.26%、14.05%、34.71%、42.98%?？梢?，在PAD1基因所編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和隨機(jī)卷曲是主要組件，β-轉(zhuǎn)角與延伸鏈在蛋白中分散存在。

圖8 PAD1 基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Prediction of secondary structure of protein encoded by PAD1 gene

2.6 釀酒酵母PAD1 基因編碼蛋白質(zhì)三級空間結(jié)構(gòu)預(yù)測

釀酒酵母PAD1基因所編碼蛋白質(zhì)的三級如圖9 所示。

圖9 PAD1 基因編碼蛋白質(zhì)的三級空間結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Prediction of tertiary spatial structure of protein encoded by PAD1 gene

3 討論

自20 世紀(jì)80 年代以來，有學(xué)者就微生物體內(nèi)的PAD1基因展開了較全面地研究。PLUMRIDGE 等[11]發(fā)現(xiàn)黑曲霉中含有PAD1基因，并證明了黑曲霉的PAD1基因是苯基丙烯酸脫羧相關(guān)的、芳香族羧酸脫羧重要的調(diào)控基因，可以調(diào)控山梨酸和肉桂酸的脫羧。RICHARD 等[24]在研究釀酒酵母中FDC1基因和PAD1基因的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)：PAD1基因可編碼1 種肉桂酸脫羧酶，可將反式肉桂酸轉(zhuǎn)化為苯乙烯；當(dāng)只有PAD1基因表達(dá)時(shí)，釀酒酵母對肉桂酸的耐受性與PAD1 蛋白含量成正比，最高可耐受0.6 mmol/L 肉桂酸；當(dāng)PAD1基因和FDC1基因都同時(shí)表達(dá)時(shí)，PAD1蛋白和FDC1 蛋白出現(xiàn)了明顯的相互作用，使釀酒酵母對肉桂酸的耐受性最高可達(dá)到10 mmol/L。本研究發(fā)現(xiàn)：PAD1基因編碼的蛋白質(zhì)與編碼肉桂酸脫羧酶的釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae，AAA20484.1)同源性高達(dá)99.59%，即PAD1基因編碼的蛋白質(zhì)極大可能是芳香族羧酸脫羧酶，參與微生物體內(nèi)芳香族羧酸的代謝，能夠賦予釀酒酵母對肉桂酸的抗性，這與PLUMRIDGE 等[11]和RICHARD 等[24]的研究結(jié)果一致。

肉桂酸經(jīng)脫羧酶可轉(zhuǎn)化成苯乙烯。苯乙烯是現(xiàn)代工業(yè)中的關(guān)鍵單體，可用于生產(chǎn)丁苯橡膠、離子交換樹脂、苯乙烯系列樹脂和醫(yī)藥品原料，在染料、農(nóng)藥制藥、石油和選礦等行業(yè)也被廣泛應(yīng)用[25]。MCKENNA 等[26]曾將大腸桿菌用于苯乙烯的生產(chǎn)；隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，采用合適技術(shù)充分利用釀酒酵母PAD1基因的功能特性選育能使肉桂酸快速脫羧的釀酒酵母菌株，再將該菌株用于生產(chǎn)苯乙烯，可為低成本的苯乙烯及其副產(chǎn)品商業(yè)生產(chǎn)提供新途徑。此外，果酒受到越來越多人的關(guān)注和喜愛，其獨(dú)特的口感將成為最大的賣點(diǎn)。研究表明：乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、苯乙醇和乙酸-2-苯乙酯等一系列的芳香族化合物、脂類、有機(jī)酸以及硫化物等是使果酒具有特殊香味的重要原因[27-31]。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，合理利用PAD1基因調(diào)控釀酒酵母中芳香族化合物的代謝，將有可能極大地提高酒的品質(zhì)。

4 結(jié)論

釀酒酵母PAD1基因是編碼芳香族羧酸脫羧酶的基因，編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可能在線粒體中參與代謝，與釀酒酵母芳香族羧酸的代謝和其對芳香族羧酸的耐受性存在直接聯(lián)系。本研究為后期該基因應(yīng)用于芳香族化合物的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。