百合AP2/ERF 家族轉錄因子基因LoERF4 的克隆和生物信息學分析*

王 浩，孫 亮，張濟民，賈文杰，吳雅文，張小平，李 想，王有國

(1.云南農業(yè)大學 園林園藝學院，云南 昆明 650201；2.金華職業(yè)技術學院 農學院，浙江 金華 321017；3.云南省農業(yè)科學院 花卉研究所，云南 昆明 650205)

百合(Liliumspp.)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生草本球根植物，是世界上重要的觀賞花卉之一。百合品種西伯利亞(Lilium oriental‘Siberia’)屬于東方百合雜種系，是百合中的名優(yōu)品種，由于其花色豐富、氣味芳香而深受消費者喜愛，在近幾年的國際和國內花卉市場中十分暢銷，在切花生產中的地位也越來越重要[1]。然而，百合鱗莖具有休眠的特性，解除休眠的時間太長或休眠解除不徹底會嚴重影響百合切花質量，造成品質差和產量低等問題，從而嚴重影響百合切花的經濟價值[2]。因此，研究百合鱗莖休眠機理并挖掘與篩選百合休眠相關基因至關重要。

AP2/ERF 轉錄因子是一種具有多種生物功能的基因家族，它包含1 個有60～70 個氨基酸的保守AP2/ERF DNA 結合區(qū)[3]。根據組成AP2/ERF 保守結構域數量和序列的差異，AP2/ERF 基因家族被劃分為4 個亞家族，包括AP2、CBF/EREB、RAV和ERF 亞家族[4]。作為AP2/ERF 轉錄因子家族的成員之一，乙烯響應因子(ethylene response factors，ERFs)擁有1 個典型的AP2/ERF 結構域。根據ERF基因的DNA 結合區(qū)和順式反應單元的特異性，ERF 轉錄因子的家族成員被分為2 種不同的類別，第1 種可以與GCC-box (AGC-CGCC)結合調控下游基因的表達；第2 種與DRE/CRT 順式作用元件結合，在誘導逆境(干旱、鹽堿和冷害等)基因表達過程中起重要作用[5]。

ERF 轉錄因子已被證明在植物生命周期中發(fā)揮著多種作用，是若干生物學過程的關鍵調節(jié)者，包括植物發(fā)育[6]、植物初級和次級代謝物調節(jié)[7]以及生物和非生物脅迫響應[8]等。另有研究指出：ERF 類轉錄因子還與植物的休眠解除密切相關。如：馮丹等[9]通過克隆從馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)塊莖中獲得1 個馬鈴薯ERF5基因，結合實時熒光定量的結果認為該基因在打破馬鈴薯的塊莖休眠以及塊莖芽的生長過程中發(fā)揮調控作用；在牡丹(Paeonia sufiuticosaAndr.)花芽的休眠解除過程中，PsERE11基因通過調控相關內源激素的合成對牡丹花芽休眠解除起作用[10]；JIMENEZ 等[11]研究發(fā)現(xiàn)：用乙烯利處理歐洲水青岡(Fagus sylvaticaL.)的種子，或在有限的含水量下通過潮濕的預冷卻處理打破休眠時，F(xiàn)sERF1基因的轉錄水平顯著增加，種子的休眠被打破、開始萌發(fā)；王月[12]研究認為：PpCERF1基因在中國櫻桃[Prunus pseudocerasus(Lindl.) G.Don]休眠解除過程中起關鍵作用，PpcERF1可能是通過調控CYP 和JA 類基因表達而發(fā)揮促進休眠解除的作用；此外，還有研究發(fā)現(xiàn)桃(Prunus persicaL.)PpeERF3b[13]以及楊樹(Populus simoniivar.przewalskii(Maxim.) H.L.Yang]EBB1基因[14]也與種子萌發(fā)相關。

目前，通過克隆和實時熒光定量檢測技術，ERF 類轉錄因子在大量物種中得到了研究，如：擬南芥(Arabidopsis thalianaL.)[15]、水稻(Oryza sativaL.)[16]、煙草(Nicotiana tabacumL.)[17]和玉米(Zea maysL.)[18]等，但這些研究重點關注了模式植物，在百合中的研究相對較少。本研究通過轉錄組測序技術獲得了百合品種西伯利亞小鱗莖休眠解除過程中的轉錄組數據，篩選和克隆參與小鱗莖休眠解除的AP2/ERF 基因LoERF4，并對該基因進行生物信息學分析和表達分析，旨在為探析百合ERF基因對百合鱗莖休眠解除的調節(jié)機制研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用材料為百合品種西伯利亞的小鱗莖。西伯利亞開花種球于2021 年1 月6 日購自云南沃德園藝有限公司，在28 ℃恒溫條件下包埋平均圍徑(12～14 cm)的中、外層鱗片，培養(yǎng)45 d 繁殖獲得小鱗莖。將小鱗莖用濕度為70%的椰糠基質包裹，放置在(4±1) ℃的低溫環(huán)境中冷藏處理70 d，冷處理結束后取出并將其根部切取1～2 cm，水洗后晾干備用。

1.2 方法

1.2.1 乙烯對百合小鱗莖休眠解除的影響

選擇60 個大小一致、鮮質量約為0.4 g 的供試小鱗莖隨機分成2 組，每組30 個(含3 次重復)，一組小鱗莖用蒸餾水(CK)浸泡處理2 h，另一組小鱗莖用100 μmol/L 的乙烯溶液處理2 h (該濃度是實驗室在前期試驗中篩選出的最佳處理濃度)。處理完畢后用吸水紙吸干，將小鱗莖接種到以瓊脂作為基質的玻璃瓶中，每瓶接種5 個小鱗莖；后將其置入恒溫箱中 28 ℃黑暗培養(yǎng)30 d，每天觀察小鱗莖萌發(fā)狀態(tài)，以小鱗莖培養(yǎng)至長出鱗片葉并突破頂端0.5 cm 即認為萌發(fā)，記錄各處理組小鱗莖開始萌發(fā)的時間；同時在培養(yǎng)后的0、10、20 和30 d 對小鱗莖進行取樣，用液氮迅速冷凍處理后存儲在-80 ℃的低溫冰箱中，0 和30 d 的材料用于轉錄組測序。每個樣品3 次生物學重復。

1.2.2 百合小鱗莖總RNA 及cDNA 的反轉錄

采用改良的CTAB 法[19]提取待測百合小鱗莖的總RNA，然后按照iScriptTMgDNA Clear cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明書，冰上配制16 μL 去gDNA 體系，25 ℃孵育5 min，75 ℃孵育5 min，去除gDNA。冰上配制20 μL 反轉錄體系，25 ℃孵育5 min，46 ℃孵育20 min，95 ℃變性1 min，冰上冷卻，立即用于qPCR 檢測。然后將cDNA置于-20 ℃冰箱內中保存待用。

1.2.3LoERF4基因全長序列克隆

本研究前期的轉錄組數據由北京百邁客生物科技有限公司通過邊合成邊測序(sequencing by synthesis，SBS)技術獲得，在這些數據中篩選得到LoERF4基因的序列，以cDNA 為模板，在該基因序列兩端分別設計帶有酶切位點(BsaI 與Eco32 I 雙酶切處理)的引物，由武漢伯遠生物科技有限公司合成正、反向引物(表1)。經聚合酶鏈式反應擴增技術擴增PCR，然后克隆LoERF4基因的全長片段。PCR 總反應體系為50 μL，包括cDNA 模版1 μL，正、反向引物各2 μL，dNTP 25 μL，去離子水20 μL。PCR 擴增反應程序為：94 ℃預變性5min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸36 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，16 ℃保持30 min，停止反應。PCR 擴增產物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳在5 v/cm 電壓條件下電泳20 min，在紫外燈下切取電泳片段，使用Axygen AxyPrepTMMag PCR 純化試劑盒進行溶膠回收和純化，檢測無誤后將PCR 產物連接至pBWA(V)HS 載體，再轉化至感受態(tài)細胞top10 上。菌落PCR 篩選陽性克隆，送至武漢伯遠生物科技有限公司測序。

1.2.4LoERF4的實時熒光定量PCR 表達分析

以1.2.2 節(jié)反轉錄待用的各處理cDNA 為材料，以Actin基因為內參基因，通過qRT-PCR 分析各處理下LoERF4基因在小鱗莖中的表達情況。參照bimake 生產的2× SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒的操作說明書進行熒光定量PCR 分析，引物序列見表1。qRT-PCR 反應體系為20 μL，包括SYBR Green qPCR Master Mix (2×)10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。溶解曲線制作程序為：95 ℃ 15 s，60 ℃60 s，95 ℃ 15 s。每個樣品均設3 個重復。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

采用2-ΔΔCt計算相對表達量；采用SPSS 軟件中的one-way ANOVA 進行方差分析，并用Turkey test 分析不同樣品間的顯著性；采用Origin 2018 制圖。

1.2.5 生物信息分析

利用ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析基因開放閱讀框(open reading frame，ORF)；利用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)進行序列比對和同源序列搜索；利用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/) 分析蛋白質的物理和化學性質；利用ProtScale (http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl) 分析蛋白質的親水性和疏水性；利用TMHMM Server v.2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0) 解析蛋白跨膜區(qū)域；利用SignalP3.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-3.0) 分析蛋白質信號肽；利用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/) 分析蛋白質的亞細胞定位方式；利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 分析蛋白質的保守結構域；利用Expasy (htps://www.expasy.org/) 分析蛋白質的二級結構；利用 SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/) 分析蛋白質的三維結構。

采用DNAman 軟件將LoERF4 氨基酸序列與NCBI 基因數據庫中陸地棉(Gossypium hirsutum，XP_016753339.1)、茶樹(Camellia sinensis，XP_028108250.1)、葡萄(Vitis vinifera，CBI30599.3)、圓錐南芥(Arabis alpina，KFK31657.1)、獼猴桃(Actinidia deliciosa，ADJ67436.1)、煙草(Nicotiana tabacum，NP_001312182.1)、雜交百合(Liliumhybrid division I，QYI40124.2)和冬瓜(Benincasa hispida，XP_038883348.1)的ERF 氨基酸序列進行比對；利用MAGA 7.0 中的鄰近法(neighbor-joining)對具有高相似度的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹構建，校驗參數步長(bootstrap)設置為1 000 次。

2 結果與分析

2.1 LoERF4 基因克隆及測序結果

以百合品種西伯利亞小鱗莖cDNA 為模板進行PCR 擴增，其產物在500～750 bp 間有1 條清晰的條帶(圖1)；切膠回收后的測序結果顯示其全長為606 bp，共編碼201 個氨基酸(圖2)。

圖1 LoERF4 的PCR 產物Fig.1 PCR products of LoERF4

圖2 LoERF4 基因序列及其編碼的氨基酸Fig.2 LoERF4 gene sequence and its encoded amino acid

2.2 LoERF4 基因所編碼蛋白的理化性質預測

LoERF4 蛋白氨基酸的區(qū)間含有1 個典型的保守AP2 結構域，證實LoERF4 蛋白屬于AP2/ERF家族成員蛋白。

ProtParam 分析結果顯示：LoERF4 蛋白的相對分子量約為21.52 ku，理論等電點為6.43，分子式為C950H468N268O301S2，共含有2 989 個原子。該蛋白由20 種不同的氨基酸組成，以丙氨酸的含量最高，占總量的12.9%；胱氨酸、蛋氨酸和色氨酸的含量最低，分別占總量的0.5%。LoERF4蛋白有24 個帶負電荷的殘基(Asp+Glu)和23 個帶正電荷的殘基(Arg+Lys)，不穩(wěn)定系數為53.72，表明該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數為61.79；總的平均親水性系數為-0.418。

ProtScale 分析結果(圖3)顯示：LoERF4 蛋白在氨基酸第86 位分數最低(-2.944)，擁有的親水性質最強，分數小于0 的位點多位于第5～8、16～49、52～61、66～75、81～112、130～138 和155～172 位；在第118 位分數最高(1.411)，擁有的疏水性質最強，分數大于0 的位點主要定位在第9～15、76～80、113～129、141～150、175～181、186～190 和192～196 位。因此，推測該蛋白是不穩(wěn)定的親水性蛋白。

圖3 LoERF4 蛋白的疏水性預測Fig.3 Hydrophobicity prediction of LoERF4 protein

2.3 LoERF4 蛋白跨膜區(qū)和亞細胞定位

LoERF4 蛋白不存在跨膜螺旋，其數值為0；N-末端位于細胞質側膜的總數為0.005 59。結合圖4 可知：全部蛋白質是膜外蛋白質的可能性大于1，而膜內蛋白質和跨膜蛋白的可能性是0，故認為該蛋白質沒有跨膜結構。WoLF PSORT 分析結果表明：LoERF4 蛋白可能定位于細胞核上。

圖4 LoERF4 蛋白跨膜結構分析Fig.4 Analysis of the tansmembrane structure of LoERF4 protein

2.4 LoERF4 蛋白結構預測

由圖5 可知：LoERF4 蛋白包含4 種二級結構，包括40 個氨基酸形成的α-螺旋(占19.90%)、43 條延伸鏈(占21.39%)、17 個氨基酸形成的β-轉角(占8.46%)和101 條隨機卷曲(占50.25%)。因此，該蛋白的主要結構為隨機卷曲。對Lo-ERF4基因所編碼蛋白的三級結構進行預測，結果(圖6)顯示：其三級結構以無規(guī)則卷曲為主，符合二級結構預測結果。

圖5 LoERF4 蛋白質的二級結構分析Fig.5 Secondary structure analysis of LoERF4 protein

圖6 LoERF4 蛋白質的三級結構分析Fig.6 Tertiary structure prediction of LoERF4 protein

由圖7 可知：LoERF4 蛋白存在信號肽的可能性為0.023，位于第18～19 位最可能剪切位點的可能性為0.015。該蛋白質剪切位點分值為0.044，位于第 36 位；綜合剪切位點分值為 0.045，位于第6 位；信號肽分值為0.332，位于第1 位；平均信號肽分值為0.268，位于第1～5 位。因此，預測LoERF4 所編碼的蛋白為非分泌蛋白，不存在信號肽。

圖7 LoERF4 蛋白質的信號肽分析Fig.7 Signal peptide analysis of LoERF4 protein

2.5 LoERF4 蛋白同源性與系統(tǒng)進化樹分析

由圖8 可知：LoERF4 同參與比對的植物氨基酸序列具有較高的相似性，且都含有1 個AP2/ERF 保守結構域。系統(tǒng)進化樹(圖9)顯示：百合品種西伯利亞與雜交百合在同一分支，表明它們之間的親緣關系最近。

圖8 LoERF4 蛋白與其他植物的同源性比對Fig.8 Homology comparison of LoERF4 protein with other plants

圖9 LoERF4 的系統(tǒng)進化樹Fig.9 Phylogenetic tree of LoERF4

2.6 小鱗莖不同休眠時期的形態(tài)學變化和LoERF4基因表達分析

由圖10 可知：乙烯處理組小鱗莖在第20 天表現(xiàn)出萌發(fā)特性，萌發(fā)出鱗片葉；而對照組小鱗莖直到第30 天才開始萌發(fā)，表明100 μmol/L 乙烯可以有效促進百合品種西伯利亞小鱗莖打破休眠并提前萌發(fā)。

圖10 不同休眠時期小鱗莖的形態(tài)變化Fig.10 Morphological changes of bulblets in different dormancy stages

由圖11 可知：乙烯處理后，LoERF4基因的相對表達量總體上呈現(xiàn)下降—上升—下降的趨勢，并且在0 d 時極顯著高于對照，表明該基因在乙烯處理后，快速響應并表達；10 d 時，乙烯處理組的表達量低于對照組，表明乙烯可能在小鱗莖休眠解除前期抑制了LoERF4基因的表達；20 d 時(小鱗莖開始萌發(fā))，乙烯處理組的表達量極顯著高于對照組，約為對照組的3.44 倍；30 d時，對照組和處理組的LoERF4基因均呈現(xiàn)低表達，表明乙烯主要在小鱗莖萌發(fā)時起作用。

圖11 不同休眠時期小鱗莖的LoERF4 基因相對表達量Fig.11 Relative expression level of LoERF4 gene in different dormancy stages

3 討論

作為百合科百合屬植物，百合在觀賞、食用和藥用等方面有廣泛的應用，探究百合的休眠調控機制對中國百合花卉產業(yè)有重要的價值。到目前為止，很少有ERF基因在百合屬植物中被克隆，關于該基因對百合休眠解除的影響也未見報道。

本研究從百合品種西伯利亞小鱗莖轉錄組數據中篩選、克隆得到1 個與小鱗莖休眠解除密切相關的基因LoERF4，并對其進行生物信息學分析和基因表達量分析，結果顯示：LoERF4全長606 bp，編碼201 個氨基酸，包含1 個典型的AP2保守區(qū)域，表明其屬于ERF 亞家族轉錄因子；其蛋白相對分子量約為21.52 ku，理論等電點為6.43，為親水性蛋白，無跨膜結構；通過蛋白質二級結構分析發(fā)現(xiàn)：LoERF4 蛋白中無規(guī)則卷曲占比最高，而螺旋相對較少，表明該蛋白是不穩(wěn)定蛋白，符合其三級結構分析結果。

ERF 類轉錄因子在不同的激素、非生物脅迫以及病原體所引起的信號傳導系統(tǒng)中發(fā)揮著關鍵作用[20]，如調節(jié)植物對激素、病原和脅迫等的應答反應，從而對植物的生長和逆境進行調控[21]。鑒于ERF 類轉錄因子是植物響應非生物脅迫的關鍵調節(jié)者，為排除水分等關鍵非生物脅迫因子對LoERF4表達的影響，課題組前期對小鱗莖進行了瓊脂糖培養(yǎng)、基質(無土)栽培和土壤栽培試驗，結果表明：在同樣處理條件下，瓊脂糖培養(yǎng)的百合小鱗莖萌發(fā)率相對一致，且在瓊脂糖培養(yǎng)條件下利用乙烯溶液浸泡處理小鱗莖后再進行栽培能有效解除西伯利亞小鱗莖的休眠[22]。本研究表明：100 μmol/L 乙烯溶液有助于打破小鱗莖休眠，這與前期研究得到的結果一致。結合基因表達量分析發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，乙烯處理組百合小鱗莖的LoERF4表達量在處理后的0 和20 d 極顯著上調，表明乙烯介導的百合小鱗莖萌發(fā)需要LoERF4在早期維持較高的表達水平，暗示Lo-ERF4可能是小鱗莖萌發(fā)的重要調節(jié)因子。

已有研究證明：ERF基因受各類信號分子的誘導表達并行使相應的功能。對枸杞(Lycium chinenseMiller)的研究發(fā)現(xiàn)：乙烯可誘導LchERF基因表達從而增強植株鹽脅迫抗性[23]；對擬南芥的研究也發(fā)現(xiàn)：在外源乙烯誘導下，AtERF4基因對乙烯的敏感性下降[24]；對多花水仙(Narcissus tazettavar.chinensis)[25]休眠的研究也發(fā)現(xiàn)：NtERF2和NtERF115可通過響應乙烯參與多花水仙鱗莖的休眠解除過程。這與本研究結果基本一致，但基因表達量的變化趨勢有所差異，推測這是由于不同植物對乙烯的敏感性不同以及乙烯處理材料的方法不同所致。此外，有研究發(fā)現(xiàn)：ERF 類轉錄因子可以通過調節(jié)下游基因表達實現(xiàn)相應的功能，如：在葡萄(Vitis viniferaL.)芽休眠解除過程中，轉錄因子VvERF59控制下游基因VvACS1的表達，參與乙烯生成、細胞壁降解、呼吸速率調節(jié)和非生物脅迫響應等，最終解除葡萄芽休眠[26]。然而，百合中ERF基因是如何調控下游基因的表達還需進行更深入的研究。

百合鱗莖休眠的形成和解除休眠的調節(jié)過程并不是由某一個基因調節(jié)引起的，而是由鱗莖各個系統(tǒng)和相應的代謝途徑共同決定。在蘭州百合[Lilium davidiivar.willmottiae(E.H.Wilson) Raffill]的鱗莖休眠解除過程中發(fā)現(xiàn)：維持休眠的內源脫落酸(ABA)含量明顯下降，而內源生長素(IAA)和赤霉素(GA3)水平快速上升，導致鱗莖休眠被打破并開始萌發(fā)[27]。已有研究也發(fā)現(xiàn)：乙烯參與植物種子的休眠和萌發(fā)過程，并通過調控脫落酸的代謝以及信號傳導途徑對脫落酸產生拮抗作用[28]。結合本研究結果和已有研究結論，推測LoERF4的表達量在0 和20 d 極顯著高于對照而在10 d 低于對照組的原因可能與小鱗莖內源乙烯或其他植物激素信號變化有關。今后可以結合小鱗莖休眠解除過程中的激素變化研究百合鱗莖休眠解除的分子機制。

4 結論

本研究在百合品種西伯利亞中成功克隆了LoERF4，該基因屬于ERF 亞家族轉錄因子，是沒有跨膜結構的親水性蛋白。LoERF4的表達量在小鱗莖萌發(fā)時極顯著上升，表明其參與了小鱗莖休眠解除且受到外源乙烯的誘導，推測LoERF4可能是引起小鱗莖休眠解除并萌發(fā)的潛在因子。