黃曲霉毒素檢測方法的研究進(jìn)展

◎ 袁京磊

（平邑縣檢驗檢測中心，山東 平邑 273300）

黃曲霉毒素（AFT）主要是由黃曲霉、寄生曲霉等霉菌產(chǎn)生的一類化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的毒性代謝產(chǎn)物，它們廣泛存在于土壤、動植物、各種堅果中，特別容易污染花生、玉米、稻米等糧食，是霉菌毒素中毒性最大的一類霉菌毒素[1]。最常見的6種AFT分別是黃曲 霉 毒 素 B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）、G2（AFG2）、M1（AFM1） 和 M2（AFM2）， 其 中AFB1的急性毒性、致癌性、致突變性、致畸性在所有的真菌毒素中均居首位。AFT是目前發(fā)現(xiàn)的較強(qiáng)的致癌物質(zhì)，主要誘發(fā)肝癌，嚴(yán)重威脅人類的健康。防止AFT污染的策略主要有防霉、去毒（物理去及化學(xué)去除法、生物脫毒方法）和檢測，其中對食品中AFT進(jìn)行檢測是防止AFT中毒的重要一環(huán)，也是保障食品安全的重要措施。

1 高效液相色譜法

目前，國標(biāo)法主要使用高效液相色譜（HPLC）對食品中的AFT進(jìn)行檢測，其原理是將試樣中的AFT提取后，再經(jīng)凈化柱凈化去除脂肪、蛋白質(zhì)、色素及碳水化合物等干擾物質(zhì)，再經(jīng)液相色譜分離、熒光檢測器檢測、外標(biāo)法定量等步驟，實現(xiàn)對AFT準(zhǔn)確的檢測。姚譽(yù)陽等[2]建立了QuEChERS-HPLC-柱后光化學(xué)衍生法測定糧谷類食品中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的分析方法；樣品經(jīng)過1%甲酸-乙腈提取，MgSO4+C18+PSA凈化，HPLC-柱后光化學(xué)衍生化法檢測，AFB1、AFG1和AFB2、AFG2線性范圍分別為 0.5 ～ 20 μg·L-1、0.125 ～ 5 μg·L-1，檢出限為0.1 ～ 0.3 μg·kg-1，定量限為 0.3 ～ 1.0 μg·kg-1，加標(biāo)回收率為86.4%～97.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.9%～6.3%，該方法可用于糧谷類食品中AFT的大批量檢測。劉穎等[3]建立了同步檢測飼料中AFB1、玉米赤霉烯酮（ZEN）及嘔吐毒素的高效液相色譜法；樣品用乙腈-水提取，過三合一免疫親和柱凈化，用甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)50 ℃濃縮氮氣吹干后用50%甲醇-水復(fù)溶，采用HPLC串聯(lián)光化學(xué)衍生器、熒光檢測器和紫外檢測器進(jìn)行檢測；其中，檢測AFB1標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍為2.5～50.0 ng·mL-1，平均加標(biāo)回收率為81.2%～92.3%，RSD為4.3%～9.5%；該方法具有準(zhǔn)確度和精密度高、穩(wěn)定性好的特點，可用于飼料中AFB1、ZEN及嘔吐毒素的同步檢測。

2 可視化檢測方法

可視化檢測方法能夠直觀地觀察到檢測結(jié)果，無需借助復(fù)雜的儀器設(shè)備，具有簡單、快速、結(jié)果可視化等優(yōu)勢。目前，已有應(yīng)用可視化檢測方法實現(xiàn)AFT檢測的報道。ABNOUS等[4]基于CRISPR-Cas12a、滾環(huán)放大和納米金的催化活性，建立了高靈敏度檢測AFM1的比色適配體傳感器；在AFM1存在的情況下，CRISPR-Cas12a會失活，添加T4 DNA連接酶和phi29 DNA聚合酶后，納米金表面會形成大的單鏈DNA結(jié)構(gòu)；因此，加入4-硝基苯酚后，顏色仍為黃色；當(dāng)不存在AFM1時，由于CRISPR-Cas12a激活和引物消失，納米金表面沒有形成大的DNA結(jié)構(gòu)，樣品的顏色變?yōu)闊o色；該方法對AFM1具有高選擇性，檢測限（LOD）低至0.05 ng·L-1，并成功用于牛奶樣品中AFM1的檢測。TANG等[5]設(shè)計了一種使用智能手機(jī)讀取比色信號的快速檢測AFB1的紙基微流控芯片，實現(xiàn)了對AFB1的可視化檢測，該方法的LOD和定量限分別為9.4 ng·mL-1、12.00 ng·mL-1。

3 電化學(xué)檢測方法

電化學(xué)檢測方法在食品安全檢測中有著廣泛的應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)對食品中有害成分高靈敏、準(zhǔn)確的檢測。近年來，隨著適配體研究的深入，基于適配體和電化學(xué)的新型檢測方法在AFT檢測中的應(yīng)用越來越多。惠媛媛等[6]基于還原氧化石墨烯（RGO）構(gòu)建了用于AFM1檢測的電化學(xué)適配體傳感器；采用紅棗汁還原氧化石墨烯（GO）制備RGO，通過滴涂法將RGO修飾在玻碳電極（GCE）表面，利用電沉積法將納米金修飾在RGO/GCE上，AFM1的適配體（Apt）通過Au-S鍵固定在AuNPs/RGO/GCE電極表面用于靶標(biāo)AFM1的捕獲；當(dāng)AFM1存在時，AFM1與適配體特異性結(jié)合形成AFM1-Apt復(fù)合物，該復(fù)合物阻礙了電子的傳遞，導(dǎo)致電化學(xué)信號減弱，該方法的檢測范圍為1×10-7～ 5×10-4ng·mL-1，LOD為 3.3×10-5pg·mL-1。GUO等[7]基于聚4-乙烯基吡啶、碳化鈦和羧化氧化石墨烯復(fù)合材料構(gòu)建了一種用于檢測AFB1的獨特開/關(guān)轉(zhuǎn)換電化學(xué)適配體傳感器，用于檢測酸性環(huán)境中的AFB1，該方法具有較寬的檢測范圍（0.01～50 ng·mL-1）和較低的LOD（3 pg·mL-1）。SINGH等[8]設(shè)計了一種基于氧化錳納米粒子的電化學(xué)免疫傳感器，實現(xiàn)了對AFB1的檢測；使用電泳技術(shù)在氧化銦錫表面上覆蓋了一層氧化錳納米粒子薄膜，用來固定AFB1抗體，再用差分脈沖伏安法選擇性檢測AFB1；檢測范圍為1 ～ 10 μg·mL-1，LOD為 0.54 pg·mL-1；對玉米提取物進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，回收率為98.6%。

4 熒光分析法

熒光分析法是指利用某些物質(zhì)被紫外光照射后處于激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子經(jīng)歷一個碰撞及發(fā)射的去激發(fā)過程所發(fā)生的能反映出該物質(zhì)特性的熒光，可以進(jìn)行定性或定量分析的方法，熒光分析法在AFT的檢測中應(yīng)用也較多。JIANG等[9]構(gòu)建了雙色持續(xù)發(fā)光納米傳感器，用于同時和無自發(fā)熒光測定AFB1和ZON；通過制備功能性雙色持續(xù)發(fā)光納米粒子與Fe3O4磁性納米粒子，并使用具有高親和力和特異性的適配體作為識別工具，實現(xiàn)對食品樣品中AFB1和ZON的高靈敏度和選擇性檢測，LOD分別為0.29 pg·mL-1和0.22 pg·mL-1，加標(biāo)回收率分別為93.6%～103.2%和94.7%～105.1%。QIAO等[10]基于AFM1/適配體復(fù)合物導(dǎo)致熒光信號變化的原理，設(shè)計了一種快速、簡單檢測牛奶中AFM1的方法；首先，將AFM1的適配體用羧基熒光素修飾，它的互補(bǔ)DNA（cDNA）用羧基四甲基羅丹明淬滅基團(tuán)修飾；在沒有AFM1的情況下，適配體與cDNA雜交，由于適配體的熒光團(tuán)靠近cDNA上的淬滅基團(tuán)，導(dǎo)致適配體熒光淬滅；當(dāng)AFM1存在的情況下，AFM1適配體復(fù)合物的形成誘導(dǎo)了適配體的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致cDNA釋放，從而產(chǎn)生熒光信號；該方法的線性響應(yīng)范圍為1～100 ng·mL-1，LOD為0.5 ng·mL-1；對牛奶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，回收率為93.4%～101.3%。

5 酶聯(lián)免疫吸附測定方法

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測方法，在疾病診斷和食品安全檢測中有廣泛的應(yīng)用。張寧等[11]結(jié)合間接競爭反應(yīng)機(jī)制，運(yùn)用ELISA方法建立了快速檢測AFT的改進(jìn)方法，該方法的半抑制濃度（IC50）＜ 0.1 μg·L-1，加標(biāo)回收率為 67% ～ 116 %，靈敏度達(dá)到0.03 μg·L-1。WANG等[12]建立了一種間接競爭性ELISA方法，用于快速檢測地甲蟲、蟑螂、蠶和蚯蚓中的AFB1；該方法的IC50為0.092～0.135 ng·mL-1，LOD為0.008～0.020 ng·mL-1；對實際樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與液相色譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜檢測的結(jié)果具有良好的相關(guān)性。YAN等[13]基于生物素化納米抗體Nb26和鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶設(shè)計了一種生物素-鏈霉親和素擴(kuò)增的ELISA方法，用于靈敏、快速地檢測谷物中的AFB1；該方法的IC50值為0.21 ng·mL-1，檢測時間為50 min，可節(jié)省多達(dá)98%的抗體；應(yīng)用該方法檢測兩種谷物樣品中的AFB1，檢測結(jié)果與HPLC的結(jié)果基本一致。

6 其他檢測方法

除以上檢測方法外，其他檢測AFT的方法主要有生物傳感器、免疫傳感器及熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、試紙條等，均能實現(xiàn)對AFT的快速、準(zhǔn)確檢測。HAMAMI等[14]設(shè)計了防污PEG/納米金復(fù)合物的生物傳感器，實現(xiàn)了對牛奶中AFM1的靈敏檢測，檢測范圍為 20 ～ 300 pg·mL-1，LOD低至 7.14 pg·mL-1。LI等[15]開發(fā)了一種超靈敏檢測牛奶中AFM1殘留的免疫傳感器；LOD為 0.018 6 ng·mL-1（18.10 ng·kg-1），線性范圍為0.003～0.81 ng·mL-1，對牛奶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，平均回收率為79.6%～112.5%，RSD為6.7%～13.3%。WU等[16]基于FRET構(gòu)建了一種用于檢測AFB1的新型上轉(zhuǎn)換納米材料適配體傳感器；線性范圍為 0.2 ～ 500 ng·mL-1，LOD為 0.028 ng·mL-1；該方法對花生油和小麥樣品進(jìn)行加標(biāo)檢測的精密度和準(zhǔn)確度與HPLC沒有明顯差異。LI等[17]開發(fā)了一種基于時間分辨熒光微球免疫層析試紙條，用于快速定量檢測牛奶及其制品中的AFM1；該試紙條的線性范圍為 0.05 ～ 2.0 ng·mL-1，IC50為 0.204 ng·mL-1，靈敏度為0.019 ng·mL-1，加標(biāo)回收率為84.6%～119.0%；檢測牛奶樣品中AFM1的結(jié)果與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的結(jié)果基本一致，可用于定量檢測牛奶中的AFM1。

7 結(jié)語

隨著適配體技術(shù)的不斷發(fā)展，以適配體為識別工具的快速檢測方法將在AFT的檢測中得到廣泛的應(yīng)用，尤其是基于適配體的電化學(xué)傳感器、生物傳感器、適配體傳感器等，將在AFT快速檢測中發(fā)揮越來越重要的作用。