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    咖啡因?qū)57BL/6小鼠防脫發(fā)的實(shí)驗(yàn)研究

    2022-12-15 07:14:06郭曉東趙麗娟
    關(guān)鍵詞:米諾地爾咖啡因毛囊

    郭曉東,趙麗娟

    (1.呂梁市中醫(yī)院,山西 呂梁 033000;2.湖北省襄陽市谷城縣第二人民醫(yī)院,湖北 襄陽 441100)

    0 引言

    隨著現(xiàn)在工作壓力、生活壓力等逐漸增加,不少人群都存在脫發(fā)的情況。生理性脫發(fā)指的是毛發(fā)在休止期時(shí)自然脫落,病理性脫發(fā)是由于各種因素導(dǎo)致每日脫發(fā)數(shù)量超過100根的現(xiàn)象,打破了頭發(fā)生長的動(dòng)態(tài)平衡,頭發(fā)變得稀疏,甚至?xí)霈F(xiàn)禿頂?shù)那闆r,不僅對容貌造成影響,也對人的心理和精神產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[1]。

    迄今為止,F(xiàn)DA只批準(zhǔn)口服非那雄胺與外用米諾地爾治療脫發(fā),但20%-30%的患者在治療一段時(shí)間后仍舊沒有好的療效,而且會產(chǎn)生藥物依賴性??Х纫蚴且环N天然的生物堿,主要來源是咖啡豆,其次是茶。有研究表明咖啡因可逆轉(zhuǎn)睪酮對毛囊的生長抑制作用[2],目前對毛囊和毛細(xì)血管的研究較少,本文旨在研究咖啡因作用在小鼠毛囊和毛細(xì)血管時(shí)對毛發(fā)生長的影響,現(xiàn)報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    60只近交系C57BL/6小鼠,雌雄各半,6~8周齡,體重15~20g,購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,[編號:SCXK(京)2012-0001]。飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所動(dòng)物飼養(yǎng)室(SPF級),溫度(22±1)℃,濕度(50±5)%,每日通風(fēng)1次,小鼠有充足活動(dòng)空間、正常飲食,適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后實(shí)驗(yàn)。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

    治療藥物為1%咖啡因溶液(自配);5%米諾地爾溶液(自配,生產(chǎn)批號,60mL);RTPCR試劑盒、DNA Marker為日本TaKaRa公司產(chǎn)品;Trizol為美國Sigma公司產(chǎn)品;丙酸睪酮注射液(1mL:25mg,天津金耀藥業(yè)有限公司,產(chǎn)品批號:國藥準(zhǔn)字H12020531);小鼠CD34單克隆抗體試劑盒,為美國Biolegend公司產(chǎn)品。

    1.1.3 主要儀器

    正置熒光顯微鏡(廣東艾斯拓鼎,型號:ASTD);電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺(桂林廣陸,型號:211-102F);皮膚毛發(fā)觀察儀(南京倍寧,型號:BNPFMF-8001)。凝膠掃描(ThermoFisher E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng))成像。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

    將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為4組,每組15只。分別為①空白組;②模型組(陰性對照組);③1%咖啡因組(實(shí)驗(yàn)組);④米諾地爾組(陽性對照組)。

    1.2.2 動(dòng)物模型的建立及干預(yù)方案

    以平行脊椎為長軸,空白組皮下注射注射用油,其余三組皮下注射丙酸睪酮注射液,4組均1次/d,劑量為5mg/(kg·d)。造模次日進(jìn)行干預(yù),空白組不予處理,模型組涂抹生理鹽水,咖啡因組與米諾地爾組涂抹給藥,除空白組外,另外三組用棉簽涂抹5min后使用生理鹽水沖洗干凈。每日定時(shí)給藥1次,連續(xù)給藥18d。

    1.3 指標(biāo)監(jiān)測

    1.3.1 觀察結(jié)果

    觀察各時(shí)段各組小鼠的一般狀態(tài)。從第4周開始收集小鼠脫落毛發(fā);在相同條件下梳理小鼠背部毛發(fā),隨后用眼科鑷收集脫落毛發(fā)并保存在自封袋中,測量脫發(fā)重量,用于小鼠脫發(fā)程度的考察。

    1.3.2 HE染色

    在涂藥第7周,每組取3只小鼠觀察區(qū)皮膚約2cm×2cm面積大小,進(jìn)行常規(guī)組織脫水、石蠟包埋、切片、HE染色(蘇木精-伊紅染色),通過電子顯微鏡與NISElements BR軟件聯(lián)用,在顯微鏡下觀察小鼠毛囊個(gè)數(shù)以及形態(tài)學(xué)變化。觀察毛囊橫斷面和縱切面,制片時(shí)取同一水平面的皮膚橫斷面統(tǒng)計(jì)毛囊總數(shù),每張切片取3個(gè)視野(100倍下)。

    1.3.3 RT-PCR檢測

    提取總RNA 及 RT-PCR。脫毛后第7周取背部皮膚,Trizol法提取總RNA,采用DNA Marker試劑盒進(jìn)行一步法RT-PCR。針對小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF mRNA的特異性引物序列為5'-CAGGCTGCTGTAACGATGAA-3'及5'-AATGCTTTCTCCGCTCTGAA-3',反應(yīng)產(chǎn)物為266bp。針對小鼠肝細(xì)胞生長因子HGF特異性引物序列為5'-CCATGAATTTGACCTC-TATG-3'及5'-ACTGAGGAATGTCACAGACT-3',反應(yīng)產(chǎn)物為421bp。針對小鼠類胰島素一號生長因子 IGF-1 特異性引物序列為5'-CACACCCAGGAGGGGAACAG-3'及5'-GTGTTGTTGATGCTCCGTCC-3',反應(yīng)產(chǎn)物為327bp。RT-PCR步驟按照 DNA Marker 試劑盒說明書進(jìn)行,RT-PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳(100V,25min),溴乙啶染色。凝膠掃描(ThermoFisher E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng))成像。

    1.3.4 CD34免疫組化染色

    CD34表達(dá)采用免疫組化法,操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。以抗CD34抗體標(biāo)記顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞,顯微鏡下每條棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇代表單獨(dú)微血管。先于100倍視野內(nèi)選擇CD34標(biāo)記的微血管密度高的區(qū)域,再在200倍視野內(nèi)選取5個(gè)視野,取平均值(MVD)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較使用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 四組小鼠一般狀態(tài)觀察

    給藥組小鼠注射丙酸睪酮注射液后,有明顯活動(dòng)增加,并出現(xiàn)相互廝打現(xiàn)象。持續(xù)給藥4周后,小鼠背部毛發(fā)呈灰暗顏色,持續(xù)給藥6周后毛發(fā)脫落??Х纫蚪M和米諾地爾組比模型組脫落的毛發(fā)少,其中米諾地爾組最為明顯,咖啡因組較為明顯。

    表1 各組小鼠脫發(fā)重量(n=15,±s)

    表1 各組小鼠脫發(fā)重量(n=15,±s)

    注:*咖啡因組與模型組比較,t=9.673,P<0.01,米諾地爾組與模型組比較,t=12.420,P<0.01。#與米諾地爾組相比較,t=2.308,P<0.05。

    組別 脫毛重量(mg)空白組 10.6±1.62模型組* 26.6±2.33咖啡因組*# 18.5±2.08米諾地爾組* 16.8±1.79

    2.2 四組小鼠毛囊數(shù)量

    HE染色后,于顯微鏡下觀察毛囊縱切面及同一水平橫斷面。觀察縱切面模型組毛囊稀疏,而咖啡因組與米諾地爾組毛囊密度較好。同一水平橫斷面比較各組毛囊數(shù)量,咖啡因與米諾地爾兩組明顯較模型組增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小鼠毛囊數(shù)量比較,見表3。

    表2 4組小鼠毛囊數(shù)量比較(n=15,±s)

    注:*咖啡因組與模型組比較,t=2.130,P<0.05,米諾地爾組與模型組比較,t=5.332,P<0.01。#與米諾地爾組相比較,t=3.254,P<0.01。

    組別 毛囊數(shù)量(個(gè))空白組 75.4±10.18模型組* 34.3±10.85咖啡因組*# 42.9±10.51米諾地爾組* 55.9±10.52

    2.3 咖啡因?qū)π∈笃つw VEGF mRNA 表達(dá)的影響

    脫毛后第18天,咖啡因組、米諾地爾組在小鼠皮膚266bp處檢測到VEGF mRNA 表達(dá)、模型組及空白組有輕微特異性條帶,見圖1。

    2.4 咖啡因?qū)π∈笃つw HGF mRNA 表達(dá)的影響

    脫毛后第18天咖啡因組及米諾地爾組小鼠皮膚在421bp處檢測到HGF mRNA 表達(dá),空白組與模型組可見輕微HGF特異性條帶,見圖2。

    2.5 咖啡因?qū)π∈笃つw IGF-1 mRNA 表達(dá)的影響

    脫毛后第18天咖啡因組及米諾地爾組小鼠皮膚在327bp處檢測到IGF-1 mRNA 表達(dá),空白組與模型組可見輕微IGF-1特異性條帶,見圖3。

    2.6 免疫組化CD34測定小鼠脫毛區(qū)MVD

    取平均值之后的差異性對比發(fā)現(xiàn),咖啡因組與米諾地爾組對比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)??Х纫蚪M與空白組對比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

    3 討論

    脫發(fā)是一種由多因素引發(fā)的常見疾病,會造成抑郁、焦慮等多種心理問題,并對生活質(zhì)量有巨大的負(fù)面影響,包括使一個(gè)人的自我意識增強(qiáng)、失去自信和降低自尊心等[3-4]。主要病因是雄性激素入血后,至頭皮轉(zhuǎn)化為毒性物質(zhì),使毛囊的能量和蛋白質(zhì)代謝發(fā)生障礙,導(dǎo)致脫發(fā)。微循環(huán)是生命的基本特征之一,其發(fā)生障礙可導(dǎo)致血液流量下降,毛囊供血不足,發(fā)無生長之源而脫落[5]。迄今為止,非那雄胺和米諾地爾治療20%-30%的脫發(fā)患者療效不佳[6],同時(shí)具有藥物依賴性。

    最近已有研究報(bào)道咖啡因的抗纖維化、抗炎和抗氧化活性[7],同時(shí)觀察到咖啡因在皮膚微血管中的作用,增強(qiáng)皮膚小動(dòng)脈和毛細(xì)血管的微血管功能[8]。大量研究[9]表明局部使用咖啡因能夠刺激毛囊生長,從而防止脫發(fā)。N.Otberg[10]等通過對6名男性志愿者使用咖啡因洗發(fā)水(Alpecin;Dr.Kurt Wolff GmbH)進(jìn)行試驗(yàn),研究結(jié)果表明在使用2min后,檢測到咖啡因滲透到角質(zhì)層和毛囊中,在使用2h后達(dá)到最高值。Rachita Dhurat[11]等研究發(fā)現(xiàn)在6個(gè)月時(shí),使用5%米諾地爾溶液組的毛狀圖的生長期比值平均改善率為11.68%,而使用1%咖啡因溶液組的生長期比值平均改善率為10.59%,兩組間均值差異為1.09%;意味著1%的咖啡因溶液可以達(dá)到防止毛發(fā)脫落的效果。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)使用0.2%的咖啡因溶液的頭皮瘙癢基線有顯著改善,而5%的米諾地爾溶液沒有改善。因此,對于雄激素性脫發(fā),基于咖啡因的局部液體效果不低于5%米諾地爾溶液,且不良反應(yīng)事件較少。但是有研究[12]觀察到使用較高濃度的咖啡因具有抑制作用,高濃度的咖啡因可能會導(dǎo)致毛囊處于高代謝狀態(tài),消耗大量能量后導(dǎo)致脫發(fā)。所以,在治療脫發(fā)時(shí)要注意咖啡因的使用濃度,這也為后續(xù)研究提供新思路。

    毛囊的正常發(fā)育和周期性循環(huán)取決于毛囊上皮與鄰近的間充質(zhì)真皮乳頭的相互作用[13]。單個(gè)毛囊可分生長期、退行期和休止期[14],而生長期對于新毛發(fā)的產(chǎn)生至關(guān)重要,其中毛發(fā)長度(未剪斷)與生長期(頭皮毛發(fā):2-8年)的長度成正比[15]。從生長期到退行期的轉(zhuǎn)變受維持生長的類胰島素一號生長因子(IGF-1)的影響[16]。IGF-1是種胰島素生長因子,能促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖,同時(shí)也可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長。通過刺激IGF-I表達(dá),可以促進(jìn)毛囊的生長,抑制毛囊進(jìn)入退行期,達(dá)到相對延長毛發(fā)生長期的目的[17]。因此,IGF-1的高表達(dá)有利于維持生長期。另一種研究較多的是利于維持生長期的生長因子,即血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),它是一種二聚體糖蛋白,可刺激血管生成。多項(xiàng)研究表明,VEGF可以促進(jìn)頭發(fā)生長,增加毛囊大小和頭皮厚度。VEGF是可作用于毛囊的生長因子,其表達(dá)高低影響著毛囊周圍血液微循環(huán),VEGF表達(dá)增加能促進(jìn)毛囊細(xì)胞新陳代謝和發(fā)育[18]。肝細(xì)胞生長因子(HGF)有多種功能,但其調(diào)節(jié)毛囊毛發(fā)生長的機(jī)制可能為:調(diào)節(jié)真皮乳頭細(xì)胞和上皮角質(zhì)形成細(xì)胞之間的相互作用;誘導(dǎo)毛囊周圍血管的形成;影響毛囊的周期性循環(huán)[19]。CD34陽性細(xì)胞是毛囊循環(huán)再生的因素之一,用于評估皮膚的毛細(xì)管密度,其缺乏可能導(dǎo)致毛囊循環(huán)的中斷,但其具體機(jī)理有待進(jìn)一步證明和研究[20]。

    綜上所述,咖啡因?qū)57BL/6小鼠毛發(fā)、微循環(huán)血供的研究結(jié)果表明,1%咖啡因與米諾地爾皆可以減少小鼠毛發(fā)脫落,增加頭皮毛囊數(shù)量,并增強(qiáng)VEGF mRNA、HGF mRNA、IGF-1 mRNA表達(dá);增加毛細(xì)血管密度,最終達(dá)到防止小鼠毛發(fā)脫落的效果。

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