咖啡因?qū)57BL/6小鼠防脫發(fā)的實(shí)驗(yàn)研究

郭曉東，趙麗娟

（1.呂梁市中醫(yī)院，山西 呂梁 033000；2.湖北省襄陽市谷城縣第二人民醫(yī)院，湖北 襄陽 441100）

0 引言

隨著現(xiàn)在工作壓力、生活壓力等逐漸增加，不少人群都存在脫發(fā)的情況。生理性脫發(fā)指的是毛發(fā)在休止期時(shí)自然脫落，病理性脫發(fā)是由于各種因素導(dǎo)致每日脫發(fā)數(shù)量超過100根的現(xiàn)象，打破了頭發(fā)生長的動(dòng)態(tài)平衡，頭發(fā)變得稀疏，甚至?xí)霈F(xiàn)禿頂?shù)那闆r，不僅對容貌造成影響，也對人的心理和精神產(chǎn)生了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[1]。

迄今為止，F(xiàn)DA只批準(zhǔn)口服非那雄胺與外用米諾地爾治療脫發(fā)，但20%-30%的患者在治療一段時(shí)間后仍舊沒有好的療效，而且會產(chǎn)生藥物依賴性?？Х纫蚴且环N天然的生物堿，主要來源是咖啡豆，其次是茶。有研究表明咖啡因可逆轉(zhuǎn)睪酮對毛囊的生長抑制作用[2]，目前對毛囊和毛細(xì)血管的研究較少，本文旨在研究咖啡因作用在小鼠毛囊和毛細(xì)血管時(shí)對毛發(fā)生長的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只近交系C57BL/6小鼠，雌雄各半，6~8周齡，體重15~20g，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，[編號：SCXK(京)2012-0001]。飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所動(dòng)物飼養(yǎng)室（SPF級），溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%，每日通風(fēng)1次，小鼠有充足活動(dòng)空間、正常飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

治療藥物為1%咖啡因溶液（自配）；5%米諾地爾溶液（自配，生產(chǎn)批號，60mL）；RTPCR試劑盒、DNA Marker為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；Trizol為美國Sigma公司產(chǎn)品；丙酸睪酮注射液（1mL:25mg，天津金耀藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號：國藥準(zhǔn)字H12020531）；小鼠CD34單克隆抗體試劑盒，為美國Biolegend公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器

正置熒光顯微鏡（廣東艾斯拓鼎，型號：ASTD）；電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺（桂林廣陸，型號：211-102F）；皮膚毛發(fā)觀察儀（南京倍寧，型號：BNPFMF-8001）。凝膠掃描（ThermoFisher E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)）成像。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法將其隨機(jī)分為4組，每組15只。分別為①空白組；②模型組（陰性對照組）；③1%咖啡因組（實(shí)驗(yàn)組）；④米諾地爾組（陽性對照組）。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立及干預(yù)方案

以平行脊椎為長軸，空白組皮下注射注射用油，其余三組皮下注射丙酸睪酮注射液，4組均1次/d，劑量為5mg/（kg·d）。造模次日進(jìn)行干預(yù)，空白組不予處理，模型組涂抹生理鹽水，咖啡因組與米諾地爾組涂抹給藥，除空白組外，另外三組用棉簽涂抹5min后使用生理鹽水沖洗干凈。每日定時(shí)給藥1次，連續(xù)給藥18d。

1.3 指標(biāo)監(jiān)測

1.3.1 觀察結(jié)果

觀察各時(shí)段各組小鼠的一般狀態(tài)。從第4周開始收集小鼠脫落毛發(fā)；在相同條件下梳理小鼠背部毛發(fā)，隨后用眼科鑷收集脫落毛發(fā)并保存在自封袋中，測量脫發(fā)重量，用于小鼠脫發(fā)程度的考察。

1.3.2 HE染色

在涂藥第7周，每組取3只小鼠觀察區(qū)皮膚約2cm×2cm面積大小，進(jìn)行常規(guī)組織脫水、石蠟包埋、切片、HE染色（蘇木精-伊紅染色），通過電子顯微鏡與NISElements BR軟件聯(lián)用，在顯微鏡下觀察小鼠毛囊個(gè)數(shù)以及形態(tài)學(xué)變化。觀察毛囊橫斷面和縱切面，制片時(shí)取同一水平面的皮膚橫斷面統(tǒng)計(jì)毛囊總數(shù)，每張切片取3個(gè)視野（100倍下）。

1.3.3 RT-PCR檢測

提取總RNA 及 RT-PCR。脫毛后第7周取背部皮膚，Trizol法提取總RNA，采用DNA Marker試劑盒進(jìn)行一步法RT-PCR。針對小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF mRNA的特異性引物序列為5＇-CAGGCTGCTGTAACGATGAA-3＇及5＇-AATGCTTTCTCCGCTCTGAA-3＇，反應(yīng)產(chǎn)物為266bp。針對小鼠肝細(xì)胞生長因子HGF特異性引物序列為5＇-CCATGAATTTGACCTC-TATG-3＇及5＇-ACTGAGGAATGTCACAGACT-3＇，反應(yīng)產(chǎn)物為421bp。針對小鼠類胰島素一號生長因子 IGF-1 特異性引物序列為5＇-CACACCCAGGAGGGGAACAG-3＇及5＇-GTGTTGTTGATGCTCCGTCC-3＇，反應(yīng)產(chǎn)物為327bp。RT-PCR步驟按照 DNA Marker 試劑盒說明書進(jìn)行，RT-PCR 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳（100V，25min），溴乙啶染色。凝膠掃描（ThermoFisher E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)）成像。

1.3.4 CD34免疫組化染色

CD34表達(dá)采用免疫組化法，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。以抗CD34抗體標(biāo)記顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞，顯微鏡下每條棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇代表單獨(dú)微血管。先于100倍視野內(nèi)選擇CD34標(biāo)記的微血管密度高的區(qū)域，再在200倍視野內(nèi)選取5個(gè)視野，取平均值（MVD）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較使用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠一般狀態(tài)觀察

給藥組小鼠注射丙酸睪酮注射液后，有明顯活動(dòng)增加，并出現(xiàn)相互廝打現(xiàn)象。持續(xù)給藥4周后，小鼠背部毛發(fā)呈灰暗顏色，持續(xù)給藥6周后毛發(fā)脫落?？Х纫蚪M和米諾地爾組比模型組脫落的毛發(fā)少，其中米諾地爾組最為明顯，咖啡因組較為明顯。

表1 各組小鼠脫發(fā)重量（n=15，±s）

表1 各組小鼠脫發(fā)重量（n=15，±s）

注：＊咖啡因組與模型組比較，t=9.673，P＜0.01，米諾地爾組與模型組比較，t=12.420，P＜0.01。#與米諾地爾組相比較，t=2.308，P＜0.05。

組別 脫毛重量（mg）空白組 10.6±1.62模型組＊ 26.6±2.33咖啡因組＊# 18.5±2.08米諾地爾組＊ 16.8±1.79

2.2 四組小鼠毛囊數(shù)量

HE染色后，于顯微鏡下觀察毛囊縱切面及同一水平橫斷面。觀察縱切面模型組毛囊稀疏，而咖啡因組與米諾地爾組毛囊密度較好。同一水平橫斷面比較各組毛囊數(shù)量，咖啡因與米諾地爾兩組明顯較模型組增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小鼠毛囊數(shù)量比較，見表3。

表2 4組小鼠毛囊數(shù)量比較（n=15，±s）

注：＊咖啡因組與模型組比較，t=2.130，P＜0.05，米諾地爾組與模型組比較，t=5.332，P＜0.01。#與米諾地爾組相比較，t=3.254，P＜0.01。

組別 毛囊數(shù)量（個(gè)）空白組 75.4±10.18模型組＊ 34.3±10.85咖啡因組＊# 42.9±10.51米諾地爾組＊ 55.9±10.52

2.3 咖啡因?qū)π∈笃つw VEGF mRNA 表達(dá)的影響

脫毛后第18天，咖啡因組、米諾地爾組在小鼠皮膚266bp處檢測到VEGF mRNA 表達(dá)、模型組及空白組有輕微特異性條帶，見圖1。

2.4 咖啡因?qū)π∈笃つw HGF mRNA 表達(dá)的影響

脫毛后第18天咖啡因組及米諾地爾組小鼠皮膚在421bp處檢測到HGF mRNA 表達(dá)，空白組與模型組可見輕微HGF特異性條帶，見圖2。

2.5 咖啡因?qū)π∈笃つw IGF-1 mRNA 表達(dá)的影響

脫毛后第18天咖啡因組及米諾地爾組小鼠皮膚在327bp處檢測到IGF-1 mRNA 表達(dá)，空白組與模型組可見輕微IGF-1特異性條帶，見圖3。

2.6 免疫組化CD34測定小鼠脫毛區(qū)MVD

取平均值之后的差異性對比發(fā)現(xiàn)，咖啡因組與米諾地爾組對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？Х纫蚪M與空白組對比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

3 討論

脫發(fā)是一種由多因素引發(fā)的常見疾病，會造成抑郁、焦慮等多種心理問題，并對生活質(zhì)量有巨大的負(fù)面影響，包括使一個(gè)人的自我意識增強(qiáng)、失去自信和降低自尊心等[3-4]。主要病因是雄性激素入血后，至頭皮轉(zhuǎn)化為毒性物質(zhì)，使毛囊的能量和蛋白質(zhì)代謝發(fā)生障礙，導(dǎo)致脫發(fā)。微循環(huán)是生命的基本特征之一，其發(fā)生障礙可導(dǎo)致血液流量下降，毛囊供血不足，發(fā)無生長之源而脫落[5]。迄今為止，非那雄胺和米諾地爾治療20%-30%的脫發(fā)患者療效不佳[6]，同時(shí)具有藥物依賴性。

最近已有研究報(bào)道咖啡因的抗纖維化、抗炎和抗氧化活性[7]，同時(shí)觀察到咖啡因在皮膚微血管中的作用，增強(qiáng)皮膚小動(dòng)脈和毛細(xì)血管的微血管功能[8]。大量研究[9]表明局部使用咖啡因能夠刺激毛囊生長，從而防止脫發(fā)。N.Otberg[10]等通過對6名男性志愿者使用咖啡因洗發(fā)水（Alpecin；Dr.Kurt Wolff GmbH）進(jìn)行試驗(yàn)，研究結(jié)果表明在使用2min后，檢測到咖啡因滲透到角質(zhì)層和毛囊中，在使用2h后達(dá)到最高值。Rachita Dhurat[11]等研究發(fā)現(xiàn)在6個(gè)月時(shí)，使用5%米諾地爾溶液組的毛狀圖的生長期比值平均改善率為11.68%，而使用1%咖啡因溶液組的生長期比值平均改善率為10.59%，兩組間均值差異為1.09%；意味著1%的咖啡因溶液可以達(dá)到防止毛發(fā)脫落的效果。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)使用0.2%的咖啡因溶液的頭皮瘙癢基線有顯著改善，而5%的米諾地爾溶液沒有改善。因此，對于雄激素性脫發(fā)，基于咖啡因的局部液體效果不低于5%米諾地爾溶液，且不良反應(yīng)事件較少。但是有研究[12]觀察到使用較高濃度的咖啡因具有抑制作用，高濃度的咖啡因可能會導(dǎo)致毛囊處于高代謝狀態(tài)，消耗大量能量后導(dǎo)致脫發(fā)。所以，在治療脫發(fā)時(shí)要注意咖啡因的使用濃度，這也為后續(xù)研究提供新思路。

毛囊的正常發(fā)育和周期性循環(huán)取決于毛囊上皮與鄰近的間充質(zhì)真皮乳頭的相互作用[13]。單個(gè)毛囊可分生長期、退行期和休止期[14]，而生長期對于新毛發(fā)的產(chǎn)生至關(guān)重要，其中毛發(fā)長度（未剪斷）與生長期（頭皮毛發(fā)：2-8年）的長度成正比[15]。從生長期到退行期的轉(zhuǎn)變受維持生長的類胰島素一號生長因子（IGF-1）的影響[16]。IGF-1是種胰島素生長因子，能促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖，同時(shí)也可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長。通過刺激IGF-I表達(dá)，可以促進(jìn)毛囊的生長，抑制毛囊進(jìn)入退行期，達(dá)到相對延長毛發(fā)生長期的目的[17]。因此，IGF-1的高表達(dá)有利于維持生長期。另一種研究較多的是利于維持生長期的生長因子，即血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），它是一種二聚體糖蛋白，可刺激血管生成。多項(xiàng)研究表明，VEGF可以促進(jìn)頭發(fā)生長，增加毛囊大小和頭皮厚度。VEGF是可作用于毛囊的生長因子，其表達(dá)高低影響著毛囊周圍血液微循環(huán)，VEGF表達(dá)增加能促進(jìn)毛囊細(xì)胞新陳代謝和發(fā)育[18]。肝細(xì)胞生長因子（HGF）有多種功能，但其調(diào)節(jié)毛囊毛發(fā)生長的機(jī)制可能為：調(diào)節(jié)真皮乳頭細(xì)胞和上皮角質(zhì)形成細(xì)胞之間的相互作用；誘導(dǎo)毛囊周圍血管的形成；影響毛囊的周期性循環(huán)[19]。CD34陽性細(xì)胞是毛囊循環(huán)再生的因素之一，用于評估皮膚的毛細(xì)管密度，其缺乏可能導(dǎo)致毛囊循環(huán)的中斷，但其具體機(jī)理有待進(jìn)一步證明和研究[20]。

綜上所述，咖啡因?qū)57BL/6小鼠毛發(fā)、微循環(huán)血供的研究結(jié)果表明，1%咖啡因與米諾地爾皆可以減少小鼠毛發(fā)脫落，增加頭皮毛囊數(shù)量，并增強(qiáng)VEGF mRNA、HGF mRNA、IGF-1 mRNA表達(dá)；增加毛細(xì)血管密度，最終達(dá)到防止小鼠毛發(fā)脫落的效果。