淡竹葉多肽的提取及抑菌性研究

◎ 李 琴，王 倩，潘麗燕，蔣 行，鮑會(huì)梅

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

淡竹葉（Lophatherum gracileBrongn.）是禾本科，屬多年生草本植物，富含多酚、黃酮、多糖、三萜類等生物活性物質(zhì)[1]?！侗静菥V目》記載了淡竹葉這種草藥具有多種藥理活性，包括利尿作用及舒緩心臟壓力、口腔潰瘍和煩躁不安[2]。除作藥用外，淡竹葉還可應(yīng)用于食品、保健品等領(lǐng)域[3]。

目前的果蔬防腐保鮮方法通常是物理法和化學(xué)法，但都有一定的缺點(diǎn)。例如，物理法使用冷藏，成本高，而化學(xué)法使用化學(xué)殺菌劑存在一定的潛在毒性[4]。植物源抑菌劑通常是來源于天然植物中的一些生物活性物質(zhì)，相比較于人工合成的抑菌劑，植物源抑菌劑安全性高、毒副作用小且綠色環(huán)保，具有較高的開發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景[5]。

當(dāng)前，對(duì)于藥食同源的原料淡竹葉的研究集中于其藥理作用和其中活性物質(zhì)如黃酮的提取與活性研究[6-7]，而對(duì)淡竹葉中多肽的研究鮮有報(bào)道。本研究對(duì)淡竹葉多肽進(jìn)行提取并測(cè)其抑菌活性，為淡竹葉多肽作為天然抑菌劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡竹葉：八仙村野生草藥坊店鋪購買；堿性蛋白酶：夏盛（北京）生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、牛血清蛋白、葡萄糖、三氯乙酸、蛋白胨和牛肉膏：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母菌、青霉菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌：南京漢欣微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與設(shè)備

101-3BS粉碎機(jī)：永康市圣象電器有限公司；FE20 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；KH5200B超聲波清洗儀：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；TDL-5M離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-2700紫外分光光度計(jì)：島津公司；HH-4水浴鍋：常州國華電器有限公司；LMQC-100E高壓滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)：蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 淡竹葉多肽的提取及工藝優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.1 淡竹葉預(yù)處理

將淡竹葉于45 ℃烘箱中干燥1～2 d，用粉碎機(jī)充分打磨成粉末后，過60目篩。利用環(huán)己烷進(jìn)行脫脂，干燥密封保存。

1.3.2 淡竹葉蛋白的制備

稱取一定量的淡竹葉粉置于燒杯中，加入水，調(diào)節(jié)料液比為1∶15，pH為9.5。60 ℃水浴超聲（400 W）提取2 h。提取結(jié)束后，在轉(zhuǎn)速4 800 r·min-1下離心20 min取上清。然后調(diào)節(jié)上清pH為5.0，4 800 r·min-1離心20 min，收集沉淀，用去離子水洗滌3次，冷凍干燥得淡竹葉總蛋白。

1.3.3 淡竹葉多肽的制備

淡竹葉多肽的制備流程為淡竹葉→預(yù)處理→制備淡竹葉蛋白→酶解淡竹葉蛋白→滅酶（沸水浴15 min）→冷卻→離心（4 500 r·min-1，20 min）→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→冷凍干燥。

1.3.4 淡竹葉多肽含量及得率的測(cè)定

采用比色法[8]測(cè)定多肽含量，配制0 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1和 1.4 mg·mL-1的 Gly-Gly-Tyr-Arg 四 肽標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，雙縮脲試劑8 mL，振蕩混勻，靜置45 min后，取上清液于540 nm下測(cè)定吸光度值。樣品測(cè)定時(shí)，往樣品溶液中加入等體積10%的三氯乙酸溶液，混勻靜置30 min后，離心15 min（4 000 r·min-1），取上清液2 mL，按標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定方法操作得到吸光度值。以多肽含量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.063 8x+0.002 8，R2=0.996 3。多肽得率計(jì)算公式為

式中：V為樣品溶液體積，mL；C為樣品溶液多肽的濃度，mg·mL-1；m為原料中蛋白質(zhì)的含量，mg。

1.3.5 酶解淡竹葉蛋白試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取堿性蛋白酶，料液比為1∶15，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)探究酶解溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃）、酶解時(shí)間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h）、酶 解 pH（7.5、8.5、9.5、10.5和 11.5）、 加 酶 量（3 000 U·g-1、4 000 U·g-1、5 000 U·g-1、6 000 U·g-1和7 000 U·g-1）對(duì)酶解效果的影響，確定酶解制備淡竹葉多肽的最佳條件。

利用Design-Expert 8.0.6軟件，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.4 抑菌活性檢測(cè)

1.4.1 菌種的活化培養(yǎng)

參考曹陽等[9]的方法，將青霉菌、酵母菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌分別放置于相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。無菌條件下，分別挑取5環(huán)菌株置于對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，分別在28 ℃和37 ℃下培養(yǎng)24 h和48 h備用。

1.4.2 淡竹葉片多肽液抑菌效果的測(cè)定

采用濾紙片法[10]對(duì)淡竹葉多肽的抑菌性進(jìn)行測(cè)定，并稍作修改。將打孔滅菌處理過的濾紙片分別置于0%、20%、40%、60%、80%和100%的淡竹葉多肽提取液中，浸泡5 h。將菌懸液接種到各個(gè)固體培養(yǎng)基上。取出浸泡的濾紙，放入各介質(zhì)中，用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑。抑菌性指標(biāo)由抑菌圈直徑來衡量。

2 結(jié)果與分析

2.1 淡竹葉多肽制備工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1顯示了酶解各因素對(duì)淡竹葉多肽得率的影響。圖1a表明，隨著酶解溫度的升高，多肽得率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)。當(dāng)酶解溫度在30～50 ℃時(shí)，酶活性能被最大限度地激活，酶解反應(yīng)加快，多肽得率也大大提高。酶解溫度為50 ℃時(shí)，多肽得率達(dá)到最大。但當(dāng)酶解溫度過高時(shí)，酶的活性會(huì)降低，因此確定最佳酶解溫度為50 ℃。圖1b表明，多肽得率隨酶解時(shí)間的延長而呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，酶解2 h時(shí)多肽得率達(dá)到（7.78±0.25）%。再繼續(xù)酶解，多肽得率并未增加，推測(cè)原因是溶液中底物濃度達(dá)到飽和[11]，因此確定酶解最適時(shí)間為2.0 h。pH的改變會(huì)影響酶活力部位的帶電情況，從而影響酶與底物的結(jié)合。由圖1c可知，淡竹葉蛋白在堿性環(huán)境下酶解效果較好，最適的pH為9.5[12]。由圖1d可知，隨著加酶量的增加，多肽得率先增加后減少，當(dāng)加酶量為5 000 U·g-1時(shí)，多肽得率最高，可達(dá)（7.85±0.21）%。這是因?yàn)樵诘孜锍渥愕臈l件下，酶反應(yīng)的速率與酶濃度成正相關(guān)，而當(dāng)酶濃度過高時(shí)，酶分子之間可能發(fā)生相互水解，導(dǎo)致酶活力下降[13]。

圖1 酶解各因素對(duì)多肽得率的影響圖

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。多元回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，得到方差的顯著性檢測(cè)和回歸方程為多肽得率=7.86+0.19A+0.26B+0.48C+0.45D+0.087AB-0.085AC-0.140AD+0.050BC+0.060BD+0.11CD-0.80A2-1.12B2-0.87C2-0.47D2。由表3可知模型顯著，說明模型擬合度高，可用來對(duì)本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。各因素的顯著性顯示，酶解溫度、酶解時(shí)間pH和加酶量對(duì)酶解提取多肽的工藝有極顯著的影響（P＜0.01）。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

表3 多元回歸方程的方差分析表

2.1.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)曲面開口朝下，說明響應(yīng)值存在極大值點(diǎn)。等高線圖可反映兩因素間交互作用的強(qiáng)弱。等高線形狀為橢圓形和圓形分別表示兩因素之間交互作用顯著和不顯著[14-15]。

由圖2～圖4可知，淡竹葉多肽得率隨著酶解溫度、時(shí)間、pH的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，存在極大值。圖2～圖4中AB、AC、BC等高線似圓形，表明彼此間相互作用較弱，與表3中得到的方差分析結(jié)果一致。

圖2 酶解溫度和酶解時(shí)間對(duì)淡竹葉多肽得率影響圖

圖3 酶解溫度和pH對(duì)淡竹葉多肽得率影響圖

圖4 酶解時(shí)間和pH對(duì)淡竹葉多肽得率影響圖

2.1.4 最佳提取工藝驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面模型，獲得的淡竹葉多肽的最佳提取工藝模型為酶解溫度50.06 ℃、酶解時(shí)間2.14 h、pH值9.81、加酶量5 525 U·g-1。通過最佳提取工藝，淡竹多肽得率達(dá)到8.07%。為驗(yàn)證回歸模型的可靠性，將條件修正為酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間2 h、pH值9.8、加酶量5 525 U·g-1進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果為（7.95±0.15）%。試驗(yàn)結(jié)果接近預(yù)測(cè)值，說明此響應(yīng)面優(yōu)化工藝用于提取淡竹葉多肽是可行的，回歸模型和實(shí)際值契合性較好。

2.2 抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，淡竹葉酶解產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有較好的抑菌效果，對(duì)酵母菌和青霉菌抑菌效果不明顯。隨著淡竹葉多肽液的體積分?jǐn)?shù)增大，對(duì)5種菌的抑制作用也在不斷增強(qiáng)。前人在研究淡竹葉提取物抑菌防腐作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、綠膿桿菌和大腸桿菌都具有一定的抑菌效果，且對(duì)金黃色球菌抑制效果最強(qiáng)，而對(duì)青霉抑菌效果不明顯[16]。江惠[17]在研究竹葉天然多肽的抑菌效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，竹葉多肽對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均具有良好的抑菌作用，且對(duì)前兩種菌種的抑制作用最強(qiáng)，本文研究結(jié)果與其相似。

表4 抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果表

3 結(jié)論

以淡竹葉為原料，通過堿性蛋白酶酶解法制備得到淡竹葉多肽。響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳提取工藝為酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間2 h、pH為9.8、加酶量5 525 U·g-1，在此條件下，淡竹葉多肽的得率達(dá)到了（7.95±0.15）%。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，淡竹葉多肽液對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，而對(duì)酵母菌和青霉菌抑制效果不明顯。淡竹葉多肽可作為天然的抑菌劑添加到果蔬中，達(dá)到抑菌防腐的效果。