液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草魚中4種硝基呋喃類代謝物殘留量

◎ 謝冬霞

（深圳三方圓檢測監(jiān)管服務(wù)有限公司，廣東 深圳 518110）

硝基呋喃類藥物作為一種廣譜抗生素，以其價格低廉效果好，且不容易產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)勢在畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛[1]。然而，有研究表明，硝基呋喃類藥物及其代謝物對人體有潛在的致畸、致癌、致突變危害，世界上許多國家禁止在食源性動物飼養(yǎng)中使用該類藥物，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的第250號公告也禁止其在食品動物中使用[2]。硝基呋喃類藥物半衰期短，在動物和人體內(nèi)新陳代謝較快，但該類藥物的代謝物在生物體內(nèi)能以蛋白結(jié)合物的形式長期存在，因此通常通過檢測其代謝物含量來反映該類藥物的殘留情況[3-4]。目前，硝基呋喃類代謝物的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法以其選擇性高、靈敏度高、重現(xiàn)性好的優(yōu)勢，成為水產(chǎn)品中該類藥物代謝物的常用檢測方法[5]。本研究基于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31656.13—2021）[6]，結(jié)合實驗室設(shè)備條件和檢測需求，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草魚中3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-Amino-2-oxazolidinone，AOZ）、5-嗎啉甲基-3-氨基-2-噁唑烷基酮（5-morpholinomethy-3-amino-2-oxazolidinone，AMOZ）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲（1-aminohydantoin，AHD）、氨基脲（Semicarbazide，SEM）等4種硝基呋喃類代謝物殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗樣品：草魚（購于某農(nóng)貿(mào)市場）。

試劑：4種硝基呋喃代謝物混標(biāo)（編號80759GA，濃度為100 μg·mL-1）、4種硝基呋喃代謝物同位素混標(biāo)（編號80760GA，濃度為100 μg·mL-1），均由壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供；甲醇（色譜純，德國默克公司）；乙酸銨（色譜純，北京迪馬科技有限公司）；乙酸乙酯（色譜純，德國默克公司）；二甲亞砜（色譜純，天津拉斯維特化工貿(mào)易有限公司）；2-硝基苯甲醛（色譜純，北京迪馬科技有限公司）；無水磷酸氫二鉀（分析純，北京中馳銳精細(xì)化工有限公司）；鹽酸（優(yōu)級純，北京化工試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260-6460高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；HZ-104/35S分析天平（福州華志科學(xué)儀器）；KQ2200DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HSC-B水浴氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；HY-4A數(shù)顯調(diào)速振蕩器（上海精密儀器儀表有限公司）；DDL5大容量冷凍離心機（長沙英泰儀器有限公司）；VORTEX MS3渦旋混合儀（德國艾卡公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取2.00 g試樣于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入50 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋1 min，加入5 mL 0.5 mol·L-1鹽酸溶液，0.15 mL 0.05 mol·L-1的2-硝基苯甲醛溶液，渦旋1 min，于恒溫振蕩器中避光振蕩16 h。

在振蕩后的樣液中加入1.0 mol·L-1的磷酸氫二鉀溶液調(diào)節(jié)pH為7.0～7.5，加入8 mL乙酸乙酯，渦旋30 s，于6 000 r·min-1離心機中離心5 min，取上清液至10 mL離心管中，于40 ℃下的氮吹儀中吹干，加入1.0 mL 5%甲醇溶液溶解殘留物，再將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，于14 000 r·min-1離心機中離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜后上機分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

4種硝基呋喃代謝物混標(biāo)儲備液：準(zhǔn)確吸取0.05 mL濃度為100 μg·mL-1的4種硝基呋喃代謝物混標(biāo)，用甲醇稀釋、定容至100 mL容量瓶中，搖勻，配制成50 ng·mL-1的混標(biāo)儲備液。

4種硝基呋喃內(nèi)標(biāo)混標(biāo)工作液：準(zhǔn)確吸取1.0 mL濃度為100 μg·mL-1的4種硝基呋喃代謝物同位素混標(biāo)，用甲醇稀釋、定容至100 mL容量瓶中，搖勻，配制成 1 μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)工作液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：稱取6份空白基質(zhì)，分別準(zhǔn) 確 加 入 10 μL、20 μL、40 μL、100 μL、200 μL、400 μL濃度為50 ng·mL-1的4種硝基呋喃代謝物混標(biāo)儲備液及濃度為1 μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)工作液，配制成4種硝基呋喃代謝物標(biāo)準(zhǔn)系列濃度均為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)濃度為 50 ng·mL-1的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.3 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：Xtimate C18（150 mm×4.6 mm，3 μm），柱溫：35 ℃；流速：0.8 mL·min-1； 進(jìn) 樣 量：10 μL。 流 動 相：5 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液（A）+甲醇（B），梯 度 洗 脫 程 序：0.00～1.00 min，50%A+50%B；1.00～ 1.01 min，10%A+90%B；1.01～ 5.50 min，50%A+50%B；5.50～7.00 min，50%A+50%B。

（2）質(zhì)譜工作條件。離子源：AJS-ESI；離子模式：正離子；掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；霧化室壓力：55 psi；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流量：12 L·min-1；干燥氣溫度：325 ℃；干燥氣流量：10 L·min-1；毛細(xì)管電壓：4 000 V；噴嘴電壓：500 V；監(jiān)測離子參數(shù)情況見表1。

表1 硝基呋喃類代謝物特征離子質(zhì)譜條件表

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性關(guān)系

將配制的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液在儀器條件下上機測試，以特征離子質(zhì)量色譜峰外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為縱坐標(biāo)，相對應(yīng)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度點作為橫坐標(biāo)，采用色譜工作站自動擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2，結(jié)果表明，4種硝基呋喃代謝物在0.5～20.0 ng·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均大于0.995，滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對線性關(guān)系的規(guī)定。

表2 4種組分的線性方程與相關(guān)系數(shù)表

2.2 檢出限與定量限

稱取2.01 g陰性草魚，加入0.5 μg·kg-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3試樣處理過程和儀器條件分析測定，AOZ、AMOZ、AHD、SEM的信噪比分別為586.1、541.0、206.4、23.0，均大于3.0，本方法中AOZ、AMOZ、AHD 和 SEM 的檢測限為 0.5 μg·kg-1；稱取 2.00 g陰性草魚，加入1.0 μg·kg-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3試樣處理過程和儀器條件分析測定，AOZ、AMOZ、AHD、SEM的信噪比分別為114.1、142.2、37.4、27.3，均大于10.0，本方法中AOZ、AMOZ、AHD和SEM的定量限為1.0 μg·kg-1，檢出限與定量限均滿足標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)要求。

2.3 加標(biāo)回收率及精密度

稱取陰性草魚樣品，分別添加低（1.00 μg·kg-1）、中（2.50 μg·kg-1）高（5.00 μg·kg-1）3 個濃度水平的4種硝基呋喃代謝物混標(biāo)溶液，按照1.3試樣處理過程和儀器分析條件將各濃度水平平行測定6次，考察方法的加標(biāo)回收情況與精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示），試驗結(jié)果見表3，4種硝基呋喃代謝物在1.00～5.00 μg·kg-1添加水平下，平均回收率在74.3%～88.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在1.2%～5.1%，平均回收率與精密度均符合方法標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

表3 4種組分的加標(biāo)回收率與精密度試驗結(jié)果表

3 結(jié)論

本研究參照GB 31656.13—2021，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定草魚中AOZ、AMOZ、AHD和SEM等4種硝基呋喃類代謝物殘留量的分析方法，該方法前處理過程簡便，分離效果好，分析速度快，可以進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量分析，經(jīng)過方法學(xué)驗證，該方法線性關(guān)系良好，檢出限與定量限、加標(biāo)回收情況及方法精密度都滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，可以滿足食品檢驗檢測機構(gòu)對水產(chǎn)品中4種硝基呋喃類代謝物多殘留的批量快速檢測需求。