肝病代謝物脂多糖檢測(cè)的研究進(jìn)展

李以婷,明燈明,楊雅瓊

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211800;2.南京師范大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 210023)

肝癌發(fā)病率位居全球惡性腫瘤發(fā)病率第6位,致死率位居第3位,全球每年約有超80萬(wàn)人死于肝癌[1]。全世界50%以上的新發(fā)和死亡肝癌患者出現(xiàn)在中國(guó)[2],然而早期肝癌的臨床癥狀并不明顯,具有隱蔽性,有超過(guò)60%的肝癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)入中晚期[3]。在中國(guó),肝癌的年齡標(biāo)準(zhǔn)化五年相對(duì)存活率僅為12.1%,死亡率僅次于胰腺癌[4]。因此,肝病的早期診斷和治療[5]尤為重要。

研究表明,肝癌的發(fā)生與腸道菌群存在密切聯(lián)系,涉及的原因有由菌群失調(diào)引起的膽汁酸代謝改變、肝星狀細(xì)胞(HSC)衰老、內(nèi)毒素代謝紊亂等[1,3,6-7]。天然的免疫系統(tǒng)是能夠區(qū)分病原和非病原的,而且能夠在宿主復(fù)雜的機(jī)體中快速檢測(cè)到與病原相關(guān)的生物標(biāo)志物。利用這種對(duì)病原的識(shí)別作用,可以得到一種識(shí)別能力強(qiáng)的生物檢測(cè)方法,這其中最重要的一種生物標(biāo)志物為與病原相關(guān)的分子表型(PAMPs)[8]。PAMPs可以與宿主內(nèi)識(shí)別受體結(jié)合,并激活先天的免疫反應(yīng)。在生物化學(xué)上,PAMPs是各類(lèi)的蛋白、脂肽、脂多糖、肽聚糖、壁酸以及核酸等[9];然而很多的檢測(cè)方法大多用于檢測(cè)蛋白[10-13]和核酸[14-17],而無(wú)法檢測(cè)其他種類(lèi)的PAMPs,這些PAMPs很難被檢測(cè)到的原因是由于其尺寸小,在宿主內(nèi)濃度很低以及其特殊的生物化學(xué)性質(zhì)。

脂多糖(LPS)作為一種PAMPs,在1956年作為抗原被人們發(fā)現(xiàn),此后對(duì)于脂多糖的研究一直較少,多是停留在對(duì)細(xì)菌及脂多糖免疫學(xué)性質(zhì)的研究階段,直到20世紀(jì)80年代,Mutharia等[9]根據(jù)抗原和抗體的相互作用,發(fā)展了酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)用于LPS檢測(cè),此后LPS再次成為研究熱點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì),1978—1988年,發(fā)表的關(guān)于LPS 的論文數(shù)量有225篇,而1989—1999年,發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)量達(dá)到了1 084篇,相比十年前增長(zhǎng)了4.82倍,同時(shí)人們對(duì)LPS的研究也不再局限于LPS本身,也開(kāi)始關(guān)注LPS與疾病之間的聯(lián)系,探索LPS在生命代謝過(guò)程中的作用機(jī)制(圖1)。

圖1 脂多糖檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展

20世紀(jì)以后,隨著人們對(duì)LPS認(rèn)識(shí)的發(fā)展,開(kāi)發(fā)LPS的檢測(cè)方法開(kāi)始成為新的研究熱點(diǎn)。由圖1(b)可以看出：近30年來(lái),酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)一直是LPS的主要檢測(cè)方法,然而酶對(duì)環(huán)境的穩(wěn)定性差,該方法不可避免地存在檢測(cè)靈敏度低、結(jié)果重現(xiàn)性差、環(huán)境依賴性強(qiáng)等問(wèn)題。因此,人們更趨向于發(fā)展無(wú)酶的LPS檢測(cè)方法。近十年來(lái),研究者開(kāi)發(fā)了各種新型的LPS檢測(cè)方法,如氣質(zhì)聯(lián)用法、生物傳感器法等。本文從脂多糖在生命代謝過(guò)程中的作用機(jī)制、脂多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及目前脂多糖常用的檢測(cè)方法進(jìn)行綜述,為尋求脂多糖的快速、靈敏、準(zhǔn)確定量分析提供理論支撐。

1 脂多糖在生命代謝過(guò)程中的作用機(jī)制

LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜的結(jié)構(gòu)成分[18]。當(dāng)LPS從細(xì)菌中釋放后會(huì)引發(fā)一系列靶器官毒性和全身毒性。肝臟是攝取和代謝LPS的主要器官,少量LPS進(jìn)入肝臟,可通過(guò)激活庫(kù)普弗細(xì)胞(Kupffer cell)等直接吞噬或釋放細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)來(lái)清除,從而起到增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用;若LPS劑量較大,炎癥應(yīng)答過(guò)于劇烈,會(huì)造成肝損傷[19-20],甚至肝衰竭[21],誘發(fā)敗血癥和敗血癥休克。當(dāng)LPS通過(guò)肺進(jìn)入人體免疫系統(tǒng),會(huì)導(dǎo)致感染性休克,而感染性休克是重癥監(jiān)護(hù)病房死亡的重要原因。Nolan等[22]發(fā)現(xiàn)肝硬化病人中會(huì)出現(xiàn)門(mén)靜脈和機(jī)體中高水平的LPS累積。另外,Riordan等[23]證明高水平的內(nèi)毒素可能是肝硬化慢性炎癥產(chǎn)生的原因。

2010年,Yu等[6]首次闡明肝病的發(fā)生與LPS含量有關(guān)，結(jié)果表明:內(nèi)源性LPS的積累會(huì)導(dǎo)致抑制細(xì)胞凋亡的癌前上皮細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)活性升高,促進(jìn)了癌細(xì)胞存活,并提高了形成腫瘤的可能性[24]。此外,LPS比對(duì)應(yīng)的蛋白更穩(wěn)定,并且可在感染的早期釋放[24-26]。因此,LPS含量可以作為肝癌早期診斷和檢測(cè)的理想標(biāo)志物。LPS的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)肝病早期預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。

2 脂多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

LPS是一種典型的帶負(fù)電的多糖,革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞膜幾乎全部是由LPS組成的,每一個(gè)大腸桿菌表面大約有106個(gè)脂質(zhì)A和107個(gè)甘油磷脂分子,占整個(gè)細(xì)胞膜的3/4,因此每個(gè)細(xì)胞表面相當(dāng)于含有62×10-12g LPS[27-29]。LPS具有兩親性的三維結(jié)構(gòu),是由脂質(zhì)A、核心多糖鏈和O-抗原多糖3部分組成(圖2)[30]。脂質(zhì)A是由6～7條脂肪酸尾巴組成,屬于LPS分子中的疏水部分。脂質(zhì)A也被稱(chēng)為內(nèi)毒素,是與致病密切相關(guān)的毒性成分,該部分能夠吸附哺乳動(dòng)物的先天免疫受體——人托爾樣受體4(TLR-4)[31]。從結(jié)構(gòu)上看,脂質(zhì)A與核多糖共價(jià)結(jié)合,核多糖可以進(jìn)一步分為內(nèi)核多糖和外核多糖,外核在糖基結(jié)構(gòu)和糖苷鍵位置上的保守性較差。

圖2 脂多糖的結(jié)構(gòu)[30]

LPS有兩種類(lèi)型,分別是S和R型。S型LPS的遠(yuǎn)端可以延伸到生物體中O-抗原多糖(O-ag)的長(zhǎng)鏈端,從而產(chǎn)生毒性。R型LPS雖然不含有O-ag,但是仍然能夠誘導(dǎo)免疫抗原反應(yīng)。O-ag由重復(fù)的亞基組成,每個(gè)亞基含1～7個(gè)糖基殘基。據(jù)報(bào)道，已有180個(gè)O-ag被證明屬于大腸桿菌類(lèi)型[32]，例如大腸桿菌O111:B4具有多達(dá)40個(gè)大小不一的亞基O-ag,O-ag獨(dú)特的糖類(lèi)型(脫氧巖藻糖、泊雷糖、甘露糖以及阿比可糖)使得其具有一定的特殊性,生物體中幾乎沒(méi)有與其相似的物質(zhì)。脂多糖的其他變化是通過(guò)引入非碳水化合物基團(tuán)實(shí)現(xiàn)的,如乙?；蛘呒谆?這些變化使得腸道中細(xì)菌的鑒別和檢測(cè)成為可能。所以,LPS是早期發(fā)現(xiàn)和鑒定革蘭氏陰性病原體的理想標(biāo)志物。

在水溶液中,兩親性的分子LPS會(huì)以膠束的形式存在。在不同環(huán)境條件下,當(dāng)濃度大于或者等于臨界膠束濃度(CMC)時(shí),單體、膠束或者超分子團(tuán)聚物存在動(dòng)態(tài)平衡,這會(huì)引起兩親性分子生物化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的變化,脂質(zhì)A中脂肪酸鏈的數(shù)量以及飽和程度都會(huì)很大程度影響LPS的形狀,所以S型LPS確切分子量檢測(cè)很困難。LPS的濃度一般是以單位體積的質(zhì)量或者內(nèi)毒素單位(EU)來(lái)表示的,常用1×10-10g=1 EU進(jìn)行單位轉(zhuǎn)化。脂質(zhì)A主要由氨基葡萄糖和長(zhǎng)鏈脂肪酸構(gòu)成，脂質(zhì)A中2個(gè)磷酸化的葡萄糖胺和核心寡糖中2個(gè)2-酮-3-脫氧辛酸單元使LPS帶負(fù)電,使LPS能與帶正電的分子結(jié)合。脂質(zhì)A是目前LPS檢測(cè)中最常用的識(shí)別位點(diǎn)。

3 常規(guī)測(cè)定方法

人們一直致力于開(kāi)發(fā)能夠用于臨床樣品以及藥品中LPS的定量檢測(cè)方法，這些方法可以分為家兔熱源法[33]和內(nèi)毒素鱟試劑(LAL)測(cè)定法[34-36]、氣質(zhì)聯(lián)用法[37]、酶聯(lián)免疫吸附分析法[38]、基于熒光[39-42]/電化學(xué)[32, 43-46]生物傳感器法。

3.1 家兔熱源法和內(nèi)毒素鱟試劑測(cè)定法

家兔熱源法是美國(guó)食品及藥品管理局(FDA)最早批準(zhǔn)用于LPS檢測(cè)的方法[33,47],其可通過(guò)家兔的發(fā)熱情況來(lái)簡(jiǎn)單地衡量脂多糖的含量[33]。家兔熱源法檢測(cè)簡(jiǎn)單,但是檢測(cè)中任何發(fā)熱反應(yīng)都會(huì)被認(rèn)為有LPS存在,所以非特異性低且檢測(cè)成本高,因而很快被內(nèi)毒素鱟試劑測(cè)定法取代。迄今為止，在腸外置裝置[48]和乙肝疫苗生產(chǎn)[47]中,家兔熱源法仍然是檢測(cè)內(nèi)毒素污染的標(biāo)準(zhǔn)方法。

1956年,Bang[34]首次發(fā)現(xiàn),當(dāng)加入內(nèi)毒素后鱟變形細(xì)胞由于存在蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)而產(chǎn)生膠黏物,Bang[34]和文獻(xiàn)[35-36]根據(jù)這一現(xiàn)象發(fā)明了內(nèi)毒素鱟試劑測(cè)定法,其中變形細(xì)胞的溶解物被稱(chēng)為鱟試劑,它是檢測(cè)脂質(zhì)A的黃金標(biāo)準(zhǔn)[49]。LAL測(cè)定法是最經(jīng)典且應(yīng)用最廣泛的LPS檢測(cè)法,其可使用濁度、發(fā)色團(tuán)、黏度測(cè)量獲得檢測(cè)結(jié)果；然而,LAL測(cè)定法需要經(jīng)過(guò)繁瑣的酶反應(yīng),耗時(shí)長(zhǎng)[46, 50],對(duì)溫度和pH的變化非常敏感[51],且LAL測(cè)定法對(duì)除LPS以外的糖衍生物(如β-葡聚糖)也會(huì)產(chǎn)生響應(yīng),從而導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性[39]，盡管存在這些問(wèn)題,LAL測(cè)定法仍被用于脂多糖檢測(cè),例如,Nachum等[52]用LAL測(cè)定法檢測(cè)了324例病人尿液中內(nèi)毒素含量,實(shí)驗(yàn)用時(shí)為2～4 h。美國(guó)食品及藥品管理局和我國(guó)現(xiàn)行藥典(2015版)都是采用LAL測(cè)定法來(lái)判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素限量是否符合規(guī)定。時(shí)至今日,該方法依然廣泛應(yīng)用于臨床樣品中內(nèi)毒素含量的檢測(cè)。

Muta等[53]發(fā)現(xiàn)了一種對(duì)內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞絲氨酸蛋白酶酶原因子C,可引發(fā)鱟試劑淋巴中的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng),使鱟試劑濁度、膠凝或顏色產(chǎn)生變化,從而可以用于LPS檢測(cè)。此后人們開(kāi)始對(duì)LAL測(cè)定法進(jìn)行優(yōu)化,Barnett等[54]將酶原因子C重組得到重組因子C,然后使用人工非熒光基板開(kāi)發(fā)了基于重組因子C的熒光檢測(cè)法[55],其中LPS可激活重組因子C,導(dǎo)致人工基質(zhì)的解離和熒光物質(zhì)的釋放,從而實(shí)現(xiàn)了冰川樣品中LPS的檢測(cè),該方法的靈敏度與LAL測(cè)定法相當(dāng),操作簡(jiǎn)單,更適用于LPS的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法

酶聯(lián)免疫吸附(ELSIA)檢測(cè)法是基于抗原與抗體的免疫反應(yīng)而發(fā)展的一種檢測(cè)LPS的方法。ELSIA檢測(cè)法可以分為兩種,第一種方法一般是在板平面接枝一級(jí)抗體,當(dāng)LPS抗原吸附后,進(jìn)行酶標(biāo)記或者二級(jí)抗體標(biāo)記,然后通過(guò)比色分析來(lái)檢測(cè)LPS[38,56];第二種方法是通過(guò)檢測(cè)LPS抗體滴度,從而篩查革蘭氏陰性細(xì)菌感染，這種方法一般在板式平面修飾抗原,然后加入人血清抗體(如免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)),通過(guò)測(cè)定抗體滴度來(lái)實(shí)現(xiàn)LPS的檢測(cè)。由于此種方法是建立在適應(yīng)性免疫的基礎(chǔ)上,在接觸病原體和增加抗體滴度之間存在時(shí)間差,從而使檢測(cè)變得十分困難。雖然此種方式特異性不強(qiáng),但是也被用于人體健康監(jiān)測(cè)以及傳染病流行病學(xué)研究。Suthienkul等[57]使用間接ELISA檢測(cè)法，將LPS被動(dòng)吸附在聚苯乙烯板上,并測(cè)量了霍亂患者的相關(guān)IgG和IgM滴度,結(jié)果表明IgG和IgM的滴度在年輕和老年患者中存在差異,這可能與LPS涂層的不一致或者存在交叉反應(yīng)有關(guān);另外,在板式平面實(shí)現(xiàn)兩親性LPS的修飾也很困難。Grallert等[38]開(kāi)發(fā)了一種LPS檢測(cè)試劑盒(EndoLISA),該試劑盒是以靶向LPS保守核心區(qū)域的噬菌體受體蛋白來(lái)提供LPS的選擇性,利用LPS激活細(xì)胞因子C,通過(guò)底物的轉(zhuǎn)換產(chǎn)生熒光信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)LPS檢測(cè),可檢測(cè)范圍為2.86×10-10～2.86×10-6mol/L，該試劑盒耐高鹽、耐尿素,并且能有效降低由β-葡聚糖、蛋白酶或磷脂等產(chǎn)生假陽(yáng)性的概率。

此外,在ELISA檢測(cè)中,由于LPS抗原不能夠?qū)崿F(xiàn)有效分離,ELISA試劑板常用全死細(xì)菌培養(yǎng)單克隆抗體,限制了特異性抗體的制備?？傊?ELISA檢測(cè)法靈敏度較低，結(jié)果重現(xiàn)性較差。因此,人們更傾向于發(fā)展無(wú)酶的LPS檢測(cè)法,以期實(shí)現(xiàn)對(duì)LPS的快速、靈敏、特異性檢測(cè)。

3.3 氣質(zhì)聯(lián)用法

氣質(zhì)聯(lián)用法被廣泛用于復(fù)雜組分的分離與鑒定,其利用了氣相色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度,是生物樣品中藥物及代謝物定性和定量分析的有效工具[58]。脂多糖作為由聚糖和脂肪酸組成的結(jié)構(gòu)[30],紫外吸收系數(shù)較小,很難用紫外光譜、液相色譜(紫外檢測(cè)器)檢測(cè),氣質(zhì)聯(lián)用法具有靈敏度高、檢測(cè)限低、特異性高等優(yōu)點(diǎn),可以用于脂多糖的定量分析,例如,de Santana等[37]將LPS先進(jìn)行乙酰化處理,去除羥基對(duì)氣相色譜的干擾,再用于LPS的定量檢測(cè),檢出限為5.714×10-14mol/L。

3.4 生物傳感器法

近年來(lái),研究者為了實(shí)現(xiàn)LPS的靈敏檢測(cè),發(fā)展了生物傳感器法,主要包括熒光/電化學(xué)生物傳感器法。此種檢測(cè)方法主要由兩部分組成[32,39-42,44-46,50,59]:一是識(shí)別元件,一般采用能夠捕獲樣品中LPS的特定小分子或者蛋白;二是用來(lái)感受信號(hào)變化的傳感元件。下文將從脂多糖的識(shí)別方式、檢測(cè)機(jī)制及其應(yīng)用情況對(duì)脂多糖生物傳感器法進(jìn)行分類(lèi)和總結(jié)。

目前報(bào)道的脂多糖識(shí)別元件主要有TLR-4[60]、多粘菌素B(PMB)[61]、重組內(nèi)毒素中和蛋白(ENP)[32]、適配體[62-64]、LPS結(jié)合肽[65-66]、金屬離子[67-68]、陽(yáng)離子復(fù)合物[69]。LPS進(jìn)入機(jī)體后會(huì)與脂多糖結(jié)合蛋白結(jié)合,激活機(jī)體免疫反應(yīng),誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化,巨噬細(xì)胞表面含有大量針對(duì)不同微生物的模式識(shí)別受體。在這些受體中,托爾樣受體(TLR)是外域中富含亮氨酸的跨膜蛋白,可選擇性識(shí)別LPS[70]。TLR-4主要在吞噬細(xì)胞中表達(dá),它與來(lái)自淋巴細(xì)胞抗原的適配器蛋白(MD-2)共表達(dá)形成二聚體,隨后LPS與MD-2正電區(qū)結(jié)合[71]。LPS的6條脂類(lèi)鏈中的5條與MD-2結(jié)合,其余的1條鏈與MD-2-TLR-4復(fù)合物的TLR-4相互作用,誘導(dǎo)TLR-4-MD-2-LPS二聚體的形成[72-74](圖3)。表1為不同識(shí)別元件的對(duì)比結(jié)果。

注:箭頭表示與TLR-4相互作用，從而形成TLR-4-MD-2-LPS二聚體的脂質(zhì)鏈。

表1 不同識(shí)別元件的對(duì)比

細(xì)菌也能產(chǎn)生具有LPS識(shí)別和結(jié)合能力的抗生素類(lèi)結(jié)構(gòu),PMB是其中的典型代表。PMB是一種陽(yáng)離子環(huán)脂肽抗生素,由疏水和親水結(jié)構(gòu)域組成,能與LPS的聚糖和磷脂結(jié)合,結(jié)合常數(shù)高達(dá) 108mol-1·s-1[50,79]。無(wú)脊椎動(dòng)物具有一種天生的免疫系統(tǒng),可以識(shí)別潛在病原體的微小表面成分。鱟(馬蹄蟹)的血細(xì)胞中能產(chǎn)生鱟因子C,它能選擇性識(shí)別脂多糖,并激活絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致鱟的血淋巴凝固[80]。從鱟中分離出來(lái)的重組內(nèi)毒素中和蛋白(ENP),能通過(guò)陰陽(yáng)離子相互作用和疏水作用與LPS結(jié)合。適配體是短寡核苷酸的片段(DNA或RNA),由指數(shù)富集(SELEX)法產(chǎn)生[81],通過(guò)氫鍵和疏水作用與LPS結(jié)合。LPS結(jié)合肽是通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選得到的[82],通過(guò)靜電相互作用和疏水作用與LPS結(jié)合。小分子物質(zhì)也能參與LPS的識(shí)別,硼酸基團(tuán)能與1,2-或1,3-二醇形成穩(wěn)定的五元或六元環(huán)酯,從而與LPS的核心多糖鏈結(jié)合[83-86]。凝集素是一種結(jié)構(gòu)多樣的蛋白質(zhì)或糖蛋白,可選擇性、可逆地與LPS核心多糖結(jié)構(gòu)中的單聚物和寡聚物結(jié)合[77]。金屬離子能與LPS的O-抗原結(jié)合,常作為L(zhǎng)PS的輔助識(shí)別分子。此外,由于LPS帶高度負(fù)電,陽(yáng)離子復(fù)合物能通過(guò)非特異的靜電相互作用識(shí)別LPS。

3.4.1 電化學(xué)傳感器法

LPS電化學(xué)傳感器法是在電極表面修飾一層活性物質(zhì),用于特異性捕獲LPS,LPS的捕獲會(huì)影響離子在電極表面發(fā)生電化學(xué)反應(yīng),通過(guò)脂多糖捕獲前后電化學(xué)信號(hào)的變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)LPS進(jìn)行定性和定量分析。目前，應(yīng)用于LPS檢測(cè)的電化學(xué)傳感器法包括庫(kù)侖分析法、循環(huán)伏安法、電化學(xué)阻抗譜法(EIS)、脈沖伏安法等[32,43-46,50,87]。電化學(xué)傳感器法具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)速度快,成本低以及能夠在線連續(xù)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn),目前已大量應(yīng)用于大腸桿菌、藥物、人血清中LPS檢測(cè)。表2為不同電化學(xué)傳感器法的對(duì)比結(jié)果。

表2 不同電化學(xué)傳感器法的對(duì)比

辣根過(guò)氧化物酶(HRP)能夠催化過(guò)氧化物在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)。Stromberg等[32]采用競(jìng)爭(zhēng)電化學(xué)檢測(cè)法,以ENP為識(shí)別元件,辣根過(guò)氧化物酶修飾的脂多糖(LPS-HRP)和LPS在電極表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附,抑制了辣根過(guò)氧化物酶對(duì)過(guò)氧化物的催化作用,根據(jù)電化學(xué)信號(hào)的變化,用循環(huán)伏安法檢測(cè)LPS。

Kato等[76]在金電極表面修飾一層含有心肌黃酶的牛血清白蛋白(BSA)膜,二茂鐵基硼酸衍生物在電極上會(huì)被氧化,而在還原性輔酶Ⅰ(NADH)存在下,會(huì)由底酶催化而再生。當(dāng)二茂鐵基硼酸衍生物與LPS上的糖基結(jié)合后,電流信號(hào)發(fā)生變化,二茂鐵基硼酸衍生物的消耗/再生周期中電流信號(hào)的變化可用于LPS的檢測(cè),同時(shí)酶催化反應(yīng)起到信號(hào)放大的作用,檢出限為5×10-8g/mL,然而二茂鐵基硼酸的識(shí)別系統(tǒng)與菌株和血清型的LPS結(jié)構(gòu)有關(guān),并且易受到其他具有二醇結(jié)構(gòu)化合物的干擾。Iijima等[50]采用二茂鐵結(jié)合的多粘菌素B(PMB-Fc)為識(shí)別元件,用含有葡萄糖氧化酶(GOD)的BSA膜修飾玻碳電極,結(jié)果表明:PMB-Fc的二茂鐵單元在電極表面被氧化,而在葡萄糖存在下,又被葡萄糖氧化酶還原為電中性。當(dāng)LPS與PMB-Fc形成復(fù)合物時(shí),電流減小,同時(shí)通過(guò)酶催化過(guò)程實(shí)現(xiàn)了信號(hào)放大,避免了高濃度單糖或聚二醇的干擾,可在5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)LPS的快速檢測(cè),檢出限為5×10-8g/mL(圖4)。

圖4 二茂鐵結(jié)合的多粘菌素B(PMB-Fc)和葡萄糖氧化酶(GOD)修飾的電極檢測(cè)LPS示意圖[50]

盡管電化學(xué)傳感器法已經(jīng)具有較高的靈敏度,但仍然遠(yuǎn)不如LAL測(cè)定法,且不能應(yīng)用于實(shí)際樣品中的LPS檢測(cè)。最近研究者們開(kāi)始將適配體作為識(shí)別元件,用于LPS的識(shí)別檢測(cè)，例如,Posha等[45]以LPS適配體為識(shí)別元件,將適配體修飾的金納米團(tuán)簇修飾在金電極(Apt/Au AC/Au)表面,采用脈沖伏安法和EIS法選擇性定量檢測(cè)LPS,檢出限為7.94×10-21mol/L,線性范圍為1×10-20～ 1×10-12mol/L，可用于檢測(cè)胰島素樣品中的LPS污染。Yuan等[88]采用聚乙烯亞胺(PEI)功能化的還原氧化石墨烯(rGO)和MoS2復(fù)合物(PEI-rGO-MoS2)修飾玻碳電極(GCE),提高了電荷傳導(dǎo)能力和電極表面積，有利于三甲苯胺藍(lán)(TB)的電子轉(zhuǎn)移。金納米粒子(Au NPs)用于LPS適配體(LBA)的修飾,同時(shí)能夠提高電極的生物相容性，增強(qiáng)電化學(xué)信號(hào)，該適配體傳感器線性范圍為5×10-14～2×10-7g/mL,檢出限為3.01×10-14g/mL。Wang等[89]采用適配體修飾電極表面,然后將LPS結(jié)合在適配體上,通過(guò)銅離子的絡(luò)合作用誘導(dǎo)L-半胱氨酸修飾的金納米粒子復(fù)合物(Cu/Au NPs)聚集, LPS的O-抗原通過(guò)與銅離子絡(luò)合，捕獲聚集的金納米粒子,實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大,采用脈沖伏安法檢測(cè)LPS,檢出限為3.3×10-14g/mL(圖5)，該方法能在5 min內(nèi)快速檢測(cè)人血清樣品中的LPS。Pourmadadi等[46]首先通過(guò)氧化還原石墨烯和金納米粒子(RGO/Au NPs)，將適配體鏈固定在GCE表面,鐵氰化物作為還原系統(tǒng),Ag/AgCl作為參比電極,采用循環(huán)伏安法檢測(cè)LPS,檢出限為3×10-14g/mL，該方法能用于區(qū)分健康人群與膿毒癥患者血清樣本。Duan等[90]將羧基功能化的聚吡咯納米線(PPy NWs)電化學(xué)聚合在電極表面,然后通過(guò)共價(jià)鍵將氨基功能化的適配體修飾在電極表面用于捕獲LPS,LPS的O-抗原能固定銅有機(jī)金屬骨架(Cu-MOF),用脈沖伏安法檢測(cè)LPS,線性范圍為1×10-12～1×10-9g/mL。

綜上所述,設(shè)計(jì)LPS電化學(xué)傳感器的通用策略如下:一是先在裸金電極表面修飾一層襯底,以減緩氧化還原探針離子在電極表面的氧化還原反應(yīng)速度;二是在襯底上耦聯(lián)LPS的識(shí)別元件,用于LPS的捕獲;三是利用LPS的空間位阻效應(yīng),限制氧化還原探針離子自由地穿過(guò)襯底到達(dá)電極表面,產(chǎn)生電化學(xué)阻抗譜以實(shí)現(xiàn)對(duì)LPS的定量分析。目前開(kāi)發(fā)的各類(lèi)電化學(xué)傳感器雖具有與LAL測(cè)定法相當(dāng)?shù)撵`敏度,但其只能測(cè)定特定pH下的樣品,極大地限制了臨床應(yīng)用[92-95]。不僅如此,由表2還可知:大部分的電化學(xué)傳感器法均具有較窄的線性范圍,盡管已經(jīng)有少數(shù)方法能拓展線性范圍,但普遍是以延長(zhǎng)響應(yīng)時(shí)間為代價(jià)的。此外,應(yīng)用于真實(shí)樣品分析的電化學(xué)傳感器法的檢測(cè)策略復(fù)雜,合成過(guò)程繁瑣。因此,開(kāi)發(fā)線性范圍寬、響應(yīng)時(shí)間短、對(duì)檢測(cè)介質(zhì)環(huán)境要求低、可再生的電化學(xué)傳感器仍然具有挑戰(zhàn)性。

3.4.2 比色傳感器法

比色傳感器法是通過(guò)測(cè)量特定波長(zhǎng)的紫外可見(jiàn)吸收光來(lái)進(jìn)行定量分析的方法,具有價(jià)格低廉、簡(jiǎn)單快速、可視化分析等優(yōu)點(diǎn)。2001年，美國(guó)布朗大學(xué)Basu課題組[96]首次報(bào)道了LPS比色傳感器,該傳感器使用1,3-丁二炔脂質(zhì)聚合生成脂質(zhì)體聚合物作為信號(hào)響應(yīng)元件和識(shí)別元件,交聯(lián)的脂質(zhì)體呈深藍(lán)色,當(dāng)LPS與其結(jié)合后,溶液顏色隨著LPS濃度的增大逐漸從深藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)槊倒寮t色,同時(shí)其吸收光譜發(fā)生了藍(lán)移,該傳感器實(shí)現(xiàn)了LPS的可視化檢測(cè),實(shí)際樣品的分析結(jié)果表明:該傳感器能夠區(qū)分5種不同的革蘭氏陰性細(xì)菌;然而,這種顏色變化需要相當(dāng)高濃度的LPS(約1×10-4mol/L)。

可視化分析一直是分析領(lǐng)域渴望達(dá)到的檢測(cè)效果。金納米粒子(Au NPs)通常以交替態(tài)存在于水溶液中,Au NPs具有距離依賴性的表面等離子共振吸收性質(zhì),這一性質(zhì)使得Au NPs隨著離子間距離的變化呈現(xiàn)不同的顏色,從而可廣泛應(yīng)用于比色視覺(jué)檢測(cè)[97-101]；同時(shí),金納米具有很好的生物相容性,能夠在不破壞生物分子活性的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)與多種生物分子的結(jié)合,其優(yōu)異的理化性質(zhì)使得金納米粒子標(biāo)記法成了現(xiàn)在常用的標(biāo)記技術(shù)之一?；诖?Sun等[102]制備了半胱氨酸修飾的金納米粒子(CSH-Au NPs),利用CSH-Au NPs與LPS電負(fù)性部分的靜電相互作用檢測(cè)識(shí)別LPS。當(dāng)LPS加入CSH-Au NPs溶液后,Au NPs發(fā)生聚集,溶液顏色由紅色變成藍(lán)色(圖6)，這種顏色變化對(duì)極低濃度的LPS(3.3×10-10mol/L)仍然敏感,Au NPs的加入大大提高了檢測(cè)方法的靈敏度。

圖6 CSH-Au NPs用于LPS比色分析法[102]

除了檢測(cè)靈敏度外,能否用于實(shí)際樣品分析也是評(píng)價(jià)LPS檢測(cè)方法的又一指標(biāo)。2012年,Lan等[39]合成了以3-苯基噻吩為基底的水溶性聚噻吩(CPT1)傳感器,該傳感器利用CPT1與LPS之間的靜電和疏水協(xié)同作用誘導(dǎo)共軛主鏈構(gòu)象發(fā)生變化[103-105],導(dǎo)致傳感器的吸收光譜和熒光光譜均出現(xiàn)顯著紅移,肉眼可觀察到其顏色由黃色變?yōu)榧t色,該傳感器具有高穩(wěn)定性和高水溶性,在其他負(fù)電分析物存在下仍顯示出對(duì)LPS的高選擇性,且檢測(cè)靈敏度為10-12mol/L;同時(shí),該傳感器可以區(qū)分革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。

傳感器在制備過(guò)程中,信號(hào)標(biāo)記過(guò)程往往會(huì)引起識(shí)別元件(例如適配體)的親和力下降,為了克服上述問(wèn)題,Xu等[106]巧妙設(shè)計(jì)了燈狀三重開(kāi)關(guān)(BTTS)的可切換適配體作為傳感器,該傳感器以鏈霉親和素辣根過(guò)氧化物酶(SA-HRP)修飾的雜交鏈反應(yīng)(HCR-HRP)作為信號(hào)放大元件和信號(hào)報(bào)告元件,適配體可與LPS結(jié)合形成復(fù)合物,而B(niǎo)TTS解離釋放DNA探針離子(BP),該DNA探針離子與捕獲探針離子(CP)結(jié)合引發(fā)雜交鏈反應(yīng)(HCR),之后反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)鏈霉親和素與生物素的相互作用,將辣根過(guò)氧化物酶(HRP)引入反應(yīng)系統(tǒng)中。HRP能夠有效催化H2O2介導(dǎo)的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的氧化,通過(guò)紫外可見(jiàn)吸收光譜檢測(cè)HRP催化氧化引起的溶液吸光度的變化,從而實(shí)現(xiàn)LPS的比色檢測(cè),檢出限為2.86×10-15mol/L，該傳感器的靈敏度與LAL測(cè)定法相當(dāng),但其合成過(guò)程繁瑣,檢測(cè)耗時(shí)(約4 h)。Li等[59]研制了一種苯硼酸修飾的磁性納米球(APBA/AMNSs)，用于酸性條件下LPS的定量分析。在酸性條件下,Fe2+能從磁性納米球中釋放,并進(jìn)入水溶液中[107-110],從而在H2O2存在下催化過(guò)氧化物酶底物2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)氧化生成綠色物質(zhì)。當(dāng)APBA/AMNSs 表面的苯硼酸捕獲LPS后,LPS上的疏水性脂鏈和親水性基團(tuán)在其表面形成脂質(zhì)雙分子層，抑制了Fe2+的釋放[59],導(dǎo)致綠色物質(zhì)的生成受限。隨著LPS濃度的增大,溶液吸光度逐漸降低,溶液顏色由深綠色變?yōu)闇\綠色,從而實(shí)現(xiàn)了LPS的可視化檢測(cè)。此外，磁分離可以消除復(fù)雜樣品基體中其他物質(zhì)的干擾,可用于食品中LPS的測(cè)定,檢出限為5.714×10-12mol/L。

綜上所述,比色傳感器法具有檢測(cè)操作方便、快速、簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉,且不需要大量樣品的優(yōu)點(diǎn),但是由于肉眼對(duì)顏色辨別存在較大差異,該方法仍然難以應(yīng)用于臨床。

3.4.3 熒光傳感器法

分子吸收能量(電能、熱能、化學(xué)能或光能)后被激發(fā)到激發(fā)態(tài),由單重激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)發(fā)射光子返回基態(tài)的過(guò)程中發(fā)射的光稱(chēng)為熒光。熒光傳感器用于LPS檢測(cè)分析,主要由兩個(gè)部分組成,一部分用于識(shí)別LPS,另一部分為信號(hào)元件——熒光分子,根據(jù)LPS結(jié)合前后熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)LPS的定量分析。

Wu等[111]以PMB修飾的聚二乙炔脂質(zhì)體(PDA)為識(shí)別元件發(fā)展了熒光增強(qiáng)型傳感器,該傳感器設(shè)計(jì)方式如下:首先,在紫外燈下,二乙炔基團(tuán)發(fā)生光聚合形成交聯(lián)的PDA;然后,將萘甲酸熒光標(biāo)記的五聚賴氨酸和組氨酸以摩爾比1∶9接枝到PDA上,此時(shí)由于PDA與萘甲酸基團(tuán)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致萘甲酸熒光猝滅;最后,當(dāng)LPS與PDA結(jié)合后,熒光恢復(fù),這種增強(qiáng)的熒光對(duì)LPS具有良好的選擇性,不受其他負(fù)電荷分析物(如核苷酸、葉綠體、DNA)干擾,在6.0×10-7～3.6×10-6mol/L的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

Wanhua等[78]為了提高檢測(cè)的特異性,研發(fā)了比率型熒光傳感器,該傳感器以2個(gè)陽(yáng)離子熒光團(tuán)甲氧檗因和1個(gè)陰離子熒光團(tuán)9, 10-蒽二甲酸丙二酸(AMDA)在水溶液中形成的絡(luò)合物作為比率熒光探針,AMDA帶4個(gè)負(fù)電荷,能夠特異性識(shí)別LPS,當(dāng)LPS結(jié)合到探針表面引起AMDA熒光增強(qiáng),甲氧檗因熒光降低,根據(jù)兩者熒光強(qiáng)度之比可用于LPS的定量分析,該傳感器能用于亞微摩爾濃度LPS的分析。

為了避免檢測(cè)基質(zhì)中自體熒光的干擾,提高檢測(cè)的靈敏度,Li等[112]開(kāi)發(fā)了一種近紅外熒光發(fā)射的熒光增強(qiáng)型傳感器,實(shí)現(xiàn)了脂多糖的定量檢測(cè),該方法采用等離子增強(qiáng)熒光信號(hào)放大策略,以金納米棒(Au NRs)作為等離子增強(qiáng)熒光激元,利用聚乙二醇(PEG)控制金納米棒與近紅外熒光團(tuán)之間的距離,從而實(shí)現(xiàn)熒光增強(qiáng),LPS捕獲后會(huì)破壞金納米棒與染料之間的猝滅-增強(qiáng)平衡,從而導(dǎo)致熒光進(jìn)一步增強(qiáng),實(shí)現(xiàn)了對(duì)脂多糖的定量檢測(cè)(圖7),該傳感器還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的可視化區(qū)分。

圖7 熒光增強(qiáng)型傳感器的檢測(cè)策略[112]

在熒光傳感器的實(shí)際應(yīng)用中常常會(huì)發(fā)生熒光基團(tuán)的聚集猝滅,造成檢測(cè)效果變差。近年來(lái),研究者們發(fā)現(xiàn)了一種新的熒光現(xiàn)象——聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE),具有AIE效應(yīng)的熒光團(tuán)聚集后,熒光反而增強(qiáng),這是由于聚集導(dǎo)致分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限所致[113-114],并以此開(kāi)發(fā)了一系列具有該效應(yīng)的典型熒光團(tuán)。2016年,Jiang等[115]合成了具有AIE效應(yīng)的TPEPyE熒光團(tuán)[116-118],TPEPyE帶負(fù)電,能夠通過(guò)靜電作用與LPS特異性結(jié)合,同時(shí)引起TPRPyE熒光光譜的改變(圖8)，該探針能實(shí)現(xiàn)尿液中LPS的檢測(cè),檢測(cè)限低至納摩爾水平。Tang等[42]用相同的策略開(kāi)發(fā)了LPS生物傳感器,該傳感器以多肽P16(G-(CKPTFRRLKWKYKC)-G)[113]作為L(zhǎng)PS識(shí)別元件,以AIE熒光團(tuán)(1-(4-羧基苯)-1,2,2-三苯(CTPY))[119]為熒光源,在1×10-7～1×10-4mol/L的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,檢出限低至6.97×10-9mol/L,該傳感器還可通過(guò)介孔二氧化硅的引入來(lái)實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中LPS的清除。

圖8 基于TPEPyE熒光團(tuán)的熒光增強(qiáng)型傳感器的檢測(cè)策略[115]

Niu等[41]發(fā)展了持續(xù)電堆積芯片(CI-ES)用于LPS熒光檢測(cè),該傳感器以6-羧基熒光素(6-FAM)標(biāo)記的適配體作為識(shí)別元件,當(dāng)其在氧化石墨烯(GO)表面結(jié)合后,會(huì)導(dǎo)致6-FAM的熒光猝滅;當(dāng)溶液中存在LPS,LPS與6-FAM標(biāo)記的適配體結(jié)合, 6-FAM標(biāo)記的適配體將從GO表面剝離,此時(shí)熒光恢復(fù)(圖9)，該芯片通過(guò)電堆疊作用進(jìn)行信號(hào)放大,實(shí)現(xiàn)了飛摩爾(1 fM=10-9μmol/L)水平下的LPS檢測(cè)；該芯片能檢測(cè)注射液、人血清蛋白樣品以及感染的小鼠模型中的LPS,并且能快速區(qū)分革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。

圖9 持續(xù)電堆積芯片用于脂多糖檢測(cè)的原理[41]

綜上所示,熒光傳感器法作為一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)方法,能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜生物樣品中的LPS檢測(cè),雖然其檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)不如LAL測(cè)定法,但其對(duì)檢測(cè)溫度、pH沒(méi)有嚴(yán)格要求,且不受碳水化合物(葡萄糖及其衍生物)的干擾[40-42,78,111,114,120](表3),若能提高其檢測(cè)靈敏度,有望替代LAL測(cè)定法應(yīng)用于臨床中。

表3 不同熒光檢測(cè)法用于LPS檢測(cè)

4 結(jié)語(yǔ)

LPS是肝病早期診斷以及食品、藥品質(zhì)量把控的關(guān)鍵指標(biāo),目前臨床上脂多糖的檢測(cè)完全依賴鱟試劑,而內(nèi)毒素鱟試劑檢測(cè)法一方面對(duì)溫度、pH等外部環(huán)境要求高,檢測(cè)耗時(shí),受碳水化合物干擾大;另一方面鱟作為瀕危動(dòng)物使其檢測(cè)試劑的來(lái)源更加困難。因此,開(kāi)發(fā)不依賴鱟試劑的快速、靈敏的脂多糖檢測(cè)法是目前的發(fā)展趨勢(shì)?；跓晒?、比色以及電化學(xué)的生物傳感器檢測(cè)法在室溫下即可檢測(cè),且其響應(yīng)時(shí)間均在20 min以下,電化學(xué)傳感器靈敏度甚至比LAL測(cè)定法高3～6個(gè)數(shù)量級(jí)。基于比色分析的傳感器能在較寬的pH適應(yīng)范圍內(nèi)檢測(cè),且能實(shí)現(xiàn)可視化分析,但其靈敏度遠(yuǎn)不如LAL測(cè)定法。基于熒光的傳感器普遍具有更寬的pH適應(yīng)范圍和更短的響應(yīng)時(shí)間,有利于生物樣品的檢測(cè),但需進(jìn)行復(fù)雜的熒光標(biāo)記和繁瑣的合成過(guò)程,難以實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用。迄今為止,僅有少數(shù)LPS檢測(cè)法能實(shí)現(xiàn)真實(shí)樣品中的LPS檢測(cè),它們多是以抗體、受體、適配體來(lái)捕獲LPS,所以能否實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中的特異性、高靈敏檢測(cè)是目前LPS生物傳感器檢測(cè)方法的發(fā)展方向。

綜上所述,要實(shí)現(xiàn)LPS實(shí)際臨床的快速、靈敏檢測(cè)應(yīng)從以下幾方面考慮:一是LPS識(shí)別元件的選擇,選擇高親和力的LPS識(shí)別元件(如抗體、適配體、配體、受體等)[74]，能在很大程度上排除生物體內(nèi)其他負(fù)電荷分析物以及葡萄糖等碳水化合物的干擾,從而提高檢測(cè)方法的選擇性;二是傳感元件的選擇,選擇性能穩(wěn)定的納米材料(如量子點(diǎn)、金納米簇等),可延長(zhǎng)傳感器的使用壽命,降低由于傳感元件不穩(wěn)定造成的偶然誤差,增強(qiáng)檢測(cè)方法的可信度;三是檢測(cè)環(huán)境的選擇,目前檢測(cè)環(huán)境的選擇均是以獲得檢測(cè)方法的最優(yōu)性能為佳,若能在保證檢測(cè)效果的前提下不受檢測(cè)環(huán)境的限制,減少高精尖檢測(cè)儀器的使用,更有利于將檢測(cè)方法應(yīng)用于臨床中。因此，構(gòu)建快速、靈敏的生物傳感法以替代LAL測(cè)定法用于臨床生物樣品中LPS的定量分析，是未來(lái)研究的重點(diǎn)、熱點(diǎn)和難點(diǎn)。