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    羅爾斯通氏菌電合成還原CO2產(chǎn)聚羥基丁酸

    2022-12-14 11:34:54宋天順謝婧婧
    關(guān)鍵詞:生長質(zhì)量

    叢 暢,張 康,宋天順,謝婧婧

    (南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 211800)

    工業(yè)革命以來,社會和經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展,消耗了化石能源同時嚴(yán)重破壞了生態(tài)環(huán)境[1-3]。在此過程中,大量的CO2排到了大氣中,導(dǎo)致全球變暖,造成了嚴(yán)重的環(huán)境問題[4-5]。因此人們開發(fā)了CO2捕捉儲存技術(shù)和CO2轉(zhuǎn)化技術(shù)。 CO2捕捉儲存技術(shù)是利用物理或化學(xué)的方法將CO2收集并儲存起來[6],但沒有將CO2有效利用。CO2轉(zhuǎn)化技術(shù)則是通過某種手段將CO2資源化,例如化學(xué)還原[7]、光催化[8]和生物還原[9]等。通過這些手段將CO2轉(zhuǎn)化為可以直接利用的化學(xué)品,實現(xiàn)CO2的可循環(huán)利用。其中,微生物電合成系統(tǒng) (MES) 是近些年來新興的一種CO2資源化技術(shù),它具有反應(yīng)條件較為溫和、易于操作、產(chǎn)物可控等優(yōu)勢[10]。

    目前,自然界中已知的電自養(yǎng)微生物利用電子的方式分為直接電子傳遞和間接電子傳遞[11]。一些自養(yǎng)型微生物可以從電極上獲得電子,將CO2轉(zhuǎn)化為二碳化合物或者具有更高附加值的有機(jī)化合物[12]。例如,產(chǎn)乙酸菌Sporomusaovata[13]和Clostridiumljungdahlii[14]可通過Wood-Ljungdahl路徑,在MES中將CO2轉(zhuǎn)化為乙酸,但合成產(chǎn)物的附加值較低,此外運(yùn)行過程中需要用質(zhì)子膜將反應(yīng)器隔開,增加了反應(yīng)器的內(nèi)阻,對反應(yīng)器的設(shè)計有較多限制。因此,尋找高附加值產(chǎn)物是MES未來發(fā)展方向。羅爾斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)是一種兼性自養(yǎng)革蘭氏陰性細(xì)菌,可以通過間接電子傳遞的方式電化學(xué)驅(qū)動利用CO2,從而在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)和儲存大量的聚合物聚羥基丁酸(PHB)[15-19]。PHB的物理化學(xué)性質(zhì)與傳統(tǒng)塑料十分相近,PHB可以被微生物完全降解,對環(huán)境無害,可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的石油基塑料,是一種很有前景的新型環(huán)保材料[20-25]。但是傳統(tǒng)的發(fā)酵方式利用R.eutropha產(chǎn)PHB多以果糖等有機(jī)碳源作為原料,生產(chǎn)成本高,能耗大。因此,利用R.eutropha在MES中將CO2轉(zhuǎn)化為PHB, 一方面提高了產(chǎn)物的附加值,并且可在無膜的單室反應(yīng)器中運(yùn)行,簡化了反應(yīng)器的設(shè)計[26];另一方面使用無機(jī)碳源CO2作為原料,實現(xiàn)了CO2資源化,降低了反應(yīng)成本。但是,目前對于此體系,缺少關(guān)于培養(yǎng)基成分和電壓大小的系統(tǒng)研究。因此,本文研究電壓對R.eutropha利用MES 固定CO2產(chǎn)PHB的影響,并進(jìn)一步考察氮源和電解質(zhì)的濃度對反應(yīng)的影響,以期推動MES在固定CO2產(chǎn)高附加值產(chǎn)物中的應(yīng)用。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料及儀器

    R.eutrophaH16由中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所畢昌昊研究員惠贈。

    LB培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,酵母膏5.0 g/L。

    MM培養(yǎng)基:磷酸緩沖鹽36 mmol/L(KH2PO41.5 g/L,Na2HPO4·12H2O 9.0 g/L),(NH4)2SO41.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.08 g/L,CaSO4·2H2O 0.001 g/L,NiSO4·7H2O 0.56 mg/L,檸檬酸鐵1 mg/L,NaHCO30.2 g/L,pH 6.8。

    數(shù)據(jù)采集器(Keithley Instruments 2700),美國吉時利電子有限公司;電源(WYK-302),揚(yáng)州華泰電子有限公司;電化學(xué)工作站(CHI 660E),上海辰華儀器有限公司;氣相色譜儀(GC-2010 Plus),日本島津有限公司;紫外分光光度計(UV-1100),上海美譜達(dá)有限公司;電導(dǎo)率儀(DDS-307A),上海雷磁有限公司。

    1.2 MES反應(yīng)器構(gòu)建

    本文使用單室電解池,結(jié)構(gòu)如圖1所示。反應(yīng)器體積為270 mL,陽極材料為鈦銥釕(12.5 cm2),陰極材料為預(yù)處理碳?xì)?10 cm2),其中鈦絲作為導(dǎo)線,連接陰極和陽極,并施加一定的電壓,Ag/AgCl作為參比電極放入反應(yīng)器中。利用數(shù)據(jù)采集器測定陰極的電位和反應(yīng)電流。實驗過程中連續(xù)通入體積分?jǐn)?shù)為99.99%的CO2。碳?xì)衷谑褂们靶璺謩e于1 mol/L HCl中浸泡24 h,以去除金屬雜質(zhì);再用1 mol/L NaOH浸泡24 h,以去除表面吸附有機(jī)物;最后用去離子水洗凈,接入裝置。

    圖1 微生物電合成工作原理圖

    1.3 實驗方法

    1.3.1 菌株的培養(yǎng)

    從-80 ℃取出菌種,在加入硫酸慶大霉素(10 μg/L)的固體LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布,在30 ℃下培養(yǎng)48 h。然后將其接到包含10 g/L果糖的MM培養(yǎng)基中,在30 ℃、160 r/min 的搖床上活化24 h。培養(yǎng)好的菌液在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min,隨后倒掉上清液,用MM培養(yǎng)基洗滌2次并重懸浮后備用。

    1.3.2 MES反應(yīng)器的接種和運(yùn)行

    反應(yīng)器滅菌后,在超凈工作臺中加入200 mL的MM培養(yǎng)基。接種前,在反應(yīng)器的兩端施加電壓,密封后通入CO2運(yùn)行24 h。將培養(yǎng)好的菌液接入反應(yīng)器中,加入MM培養(yǎng)基將菌液稀釋至生物量(OD600)為0.1~0.2的溶液, CO2通氣速率為10 mL/min,定期取樣,測定PHB濃度。

    1.4 分析方法

    1.4.1 PHB的測定

    樣品經(jīng)8 000 r/min離心10 min后倒掉上清液,置于60 ℃烘干并稱質(zhì)量,其質(zhì)量為細(xì)胞的干質(zhì)量(DCW)。加入2 mL氯仿和2 mL甲醇(含3% H2SO4)到干燥的樣品中,105 ℃加熱6 h。冷卻至室溫后,加入1 mL蒸餾水振蕩1 min,靜置溶液至分層后取下層有機(jī)相進(jìn)行分析[27]。PHB濃度通過配備有氫離子火焰檢測器(FID)的氣相色譜儀檢測。氣相色譜條件:色譜柱為Agilent HP-INNOWax 毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度為220 ℃;檢測器溫度為250 ℃。色譜柱升溫程序:50 ℃保持2 min,然后以10 ℃/min升至220 ℃,平衡時間為2 min,共 21 min。載氣為超純N2,流速為1.32 mL/min。

    1.4.2 H2含量的測定

    采用配有熱導(dǎo)檢測器(TCD)的氣相色譜儀,在正常工作的MES反應(yīng)器上空取樣進(jìn)行H2含量的測定。色譜柱為 Porapak Q 填充柱;進(jìn)樣口溫度為120 ℃;TCD檢測器溫度為100 ℃;色譜柱溫度為60 ℃,保留5 min,無升溫程序;載氣為超純N2;CO2作為吹掃氣。測量前使用超純N2連續(xù)吹掃30 min使系統(tǒng)脫氧。

    1.4.3 DCW的計算

    DCW與OD600線性相關(guān),通過監(jiān)測OD600來計算DCW[28-29],計算方法見式(1)。

    DCW=0.469 5×OD600

    (1)

    2 結(jié)果與討論

    2.1 電壓對MES系統(tǒng)的影響

    3.0、3.5、4.0和4.5 V時,考察MES的性能,結(jié)果見圖2。由圖2可知:所有MES的OD600初始值約為0.13;除4.5 V電壓外的其余電壓下,OD600隨著時間的延長皆不斷變大,在實驗結(jié)束時,4.0 V的OD600最高(0.84);而4.5 V電壓下的OD600只在第1天略有增大,隨后不斷減小。整體來說,4.5 V時的電流和陰極電勢最高(電位絕對值),約為78 mA和-1.35 V(7 d),4.5 V下的H2含量明顯高于其他實驗組,H2體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.60%。由結(jié)果可看出,在不超過4.0 V的情況下,細(xì)菌的生長狀況與電壓呈正相關(guān)關(guān)系,但在4.5 V時細(xì)菌基本不能生長。這是由于在4.5 V電壓下,反應(yīng)電位增大,提高了產(chǎn)氫速率的同時,陽極產(chǎn)氧速率也會增加,并且O2會在陰極發(fā)生還原反應(yīng)產(chǎn)生H2O2,從而嚴(yán)重抑制細(xì)菌生長[30]。因此,在反應(yīng)結(jié)束后,測定了溶液中H2O2的含量,4.5 V下溶液中的H2O2濃度(37.24 μmol/L)遠(yuǎn)高于4.0 V電壓的(4.91 μmol/L)。反應(yīng)結(jié)束后,將菌液進(jìn)行稀釋并涂布培養(yǎng)24 h,觀察微生物生長情況,結(jié)果見圖3。由圖3可見:4.5 V電壓下的細(xì)菌數(shù)量要低于4.0 V的,從而證明了4.5 V下,過量的O2在陰極還原產(chǎn)生了H2O2,從而抑制細(xì)菌的生長。

    圖2 不同電壓下MES中的OD600、電流、電勢和H2含量

    圖3 反應(yīng)結(jié)束后菌液在LB平板上稀釋涂布

    為了進(jìn)一步分析電壓對MES的影響,測定體系中PHB產(chǎn)量。菌液中PHB質(zhì)量濃度(ρ)和細(xì)胞內(nèi)PHB含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w),以細(xì)胞干質(zhì)量計算)隨時間變化結(jié)果見圖4。由圖4可知:不同電壓下,PHB質(zhì)量濃度都在第1天達(dá)到最大值,此時3.5 V(62.2 mg/L)和4.0 V(58.2 mg/L)下PHB質(zhì)量濃度較高,隨后為3.0 V(51.1 mg/L),都遠(yuǎn)高于4.5 V的(8.7 mg/L)。細(xì)胞內(nèi)PHB含量隨時間延長的變化趨勢也是一樣,都在第1天達(dá)到最大值隨后逐漸下降。4.5 V時因細(xì)胞生長受到抑制,PHB含量一直保持在較低的水平;3.0、3.5、4.0 V時則是由于細(xì)胞在快速生長的同時消耗胞內(nèi)積累的PHB,導(dǎo)致隨后PHB含量的快速下降,使得PHB在細(xì)胞中不能持續(xù)累積[31]。因此,綜合考慮細(xì)胞生長情況,選擇4.0 V電壓進(jìn)行后續(xù)實驗研究。

    圖4 不同電壓下PHB質(zhì)量濃度和PHB含量

    2.2 氮源濃度對MES的影響

    在氣體發(fā)酵體系中,可以通過改變發(fā)酵條件來調(diào)控R.eutropha選擇性合成PHB,比如改變碳源或氮源的濃度[32-33]。因此,本文分別使用質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5和1.0 g/L的(NH4)2SO4,研究氮源濃度對MES性能的影響,結(jié)果見表1和圖5。由表1和圖5可知:當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量濃度從1.0 g/L降到0.2 g/L時,體系中的電導(dǎo)率和鹽度都會隨著(NH4)2SO4質(zhì)量濃度減小而減小,同時,整體的OD600也呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)初始(NH4)2SO4質(zhì)量濃度繼續(xù)降至0.1 g/L時,OD600急驟下降,這可能是因為過少的氮源不足以支撐細(xì)菌的大量增殖[34]。隨(NH4)2SO4質(zhì)量濃度減小,電流也不斷下降,這可能和溶液電導(dǎo)率下降有關(guān)。(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為0.1 g/L時的H2體積分?jǐn)?shù)(0.52%)要顯著高于其他濃度的,這可能是因為0.1 g/L時的菌體數(shù)量最低,導(dǎo)致對H2的消耗要少于其他實驗組。

    圖5 不同氮源濃度下的OD600、電流、電勢和H2含量

    表1 不同(NH4)2SO4質(zhì)量濃度下的電導(dǎo)率和鹽度

    研究(NH4)2SO4質(zhì)量濃度對菌液中PHB質(zhì)量濃度和細(xì)胞內(nèi)PHB含量的影響,結(jié)果見圖6。由圖6可知:當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量濃度從1.0 g/L降到0.1 g/L時,菌液中PHB不斷累積,PHB產(chǎn)量呈增大趨勢。(NH4)2SO4質(zhì)量濃度為0.2 g/L時,PHB質(zhì)量濃度獲得了顯著的提升,最大值達(dá)到了191.2 mg/L,同時細(xì)胞中PHB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有了顯著的增大,最大值達(dá)到78.2%。這說明通過改變氮源的濃度可以實現(xiàn)PHB在細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)累積。

    圖6 不同氮源濃度下的PHB質(zhì)量濃度和PHB含量

    當(dāng)?shù)闯渥銜r,細(xì)胞內(nèi)的代謝碳通量主要流向TCA循環(huán)[35],為細(xì)菌的生長和繁殖提供能量。而當(dāng)?shù)床蛔銜r,細(xì)菌的生長和增殖減慢至停止,并刺激細(xì)菌內(nèi)部某些相關(guān)基因的表達(dá),促使代謝碳通量開始轉(zhuǎn)向PHB的合成,從而強(qiáng)化了胞內(nèi)PHB合成路徑,進(jìn)而提高了PHB的產(chǎn)量[36]。所以合適的氮源濃度在此體系內(nèi)極為關(guān)鍵,故選擇0.2 g/L為最優(yōu)的(NH4)2SO4氮源質(zhì)量濃度。

    2.3 電解質(zhì)濃度對MES的影響

    通過調(diào)節(jié)磷酸緩沖鹽濃度(36、54、108 mmol/L),研究不同電解質(zhì)濃度對MES體系的影響,結(jié)果見表2和圖7。由表2和圖7可得:隨電解質(zhì)濃度增大,電導(dǎo)率和鹽度也相應(yīng)增大。電解質(zhì)濃度為36和54 mmol/L時,OD600隨時間延長不斷地增大,而電解質(zhì)濃度為108 mmol/L時,前3天OD600有所增大但增大率略低于36和54 mmol/L的,從第4天開始OD600不斷減小,這可能是因為高鹽度對細(xì)菌有抑制作用。體系中的電流隨電解質(zhì)濃度的增大而增大,這是因為電解質(zhì)濃度的增大有效提高了溶液的電導(dǎo)率。陰極電位和H2含量也是隨著電解質(zhì)濃度的增大而增大。電解質(zhì)濃度為108 mmol/L時的H2體積分?jǐn)?shù)最高(2.7%),其次為54 mmol/L時的(0.8%),最低為36 mmol/L時的(0.3%)。

    表2 不同電解質(zhì)濃度下的電導(dǎo)率和鹽度

    圖7 不同電解質(zhì)濃度下的OD600、電流、電勢和H2含量

    研究電解質(zhì)濃度對菌液中PHB質(zhì)量濃度和細(xì)胞內(nèi)PHB含量的影響,結(jié)果見圖8。由圖8可知:在電解質(zhì)濃度為36和54 mmol/L時,電解質(zhì)濃度的變化對菌液中PHB質(zhì)量濃度影響不大,都在第5天達(dá)到了最高值,最高值分別為167.7和148.6 g/L,同時細(xì)胞內(nèi)PHB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也有相似的規(guī)律,第5天達(dá)到了73.7%和70.8%。但在電解質(zhì)濃度為108 mmol/L時,細(xì)胞內(nèi)PHB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高只能達(dá)到58.53%。這可能是因為電解質(zhì)濃度增大使得體系鹽度增大,從而抑制了細(xì)菌的生成。綜合考慮實驗效果,電解質(zhì)濃度選擇36 mmol/L。

    圖8 不同電解質(zhì)濃度下的PHB質(zhì)量濃度和PHB含量

    3 結(jié)論

    1)電壓對體系中細(xì)菌的生長速率具有重要的影響,電壓的提高會促進(jìn)細(xì)菌的生長,提高體系的電流,4.0 V下細(xì)菌的生長速率最快,但是當(dāng)電壓增大到4.5 V時,會使體系中H2O2大量積累,從而抑制細(xì)菌的生長。

    2)氮源濃度對體系中細(xì)菌累積PHB起決定性作用,過高的氮源濃度會抑制PHB的合成,氮源過低又會抑制細(xì)菌的生長進(jìn)而影響PHB的合成,在本體系中,氮源質(zhì)量濃度為0.2 g/L時,可以有效地促進(jìn)細(xì)菌生長,并使得PHB在體系內(nèi)持續(xù)累積,體系內(nèi)PHB的產(chǎn)量最大。

    3)電解質(zhì)濃度會影響體系的電導(dǎo)率和鹽度,從而影響到微生物的生長和體系中的反應(yīng),適宜的電解質(zhì)濃度為36 mmol/L。

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