豬細小病毒感染的實驗室診斷

方振華，沈振國，孫倩

（海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱帶農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院 ?？?570216）

豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）是導(dǎo)致豬繁殖障礙性傳染病豬細小病毒病的病原，該病以造成母豬流產(chǎn)，特別是初產(chǎn)母豬產(chǎn)木乃伊胎、畸形胎、死胎等為主要臨床癥狀[1-3]。PPV 可增殖于豬的多種傳代細胞，如豬睪丸（swine testicle，ST）細胞、豬腎（porcine kidney-15，PK-15）細胞，同時造成明顯的細胞病變效應(yīng)[4,5]。該病常發(fā)生在種豬生產(chǎn)中，造成養(yǎng)豬業(yè)重大經(jīng)濟損失，給畜牧業(yè)的健康發(fā)展帶來嚴重不利影響。2021 年6 月，海南省某豬場初產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)及死胎現(xiàn)象，豬細小病毒PCR 檢測為陽性，經(jīng)臨床觀察，結(jié)合病理剖檢變化診斷為豬細小病毒感染。

1 發(fā)病情況及剖檢變化

2021 年6 月下旬，海南省某豬場初產(chǎn)母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎，無其他明顯癥狀。經(jīng)產(chǎn)母豬也未出現(xiàn)癥狀。對死胎進行剖檢，可見皮下水腫或充血、肝脾腫大等。根據(jù)臨床表現(xiàn)及剖檢變化，初步懷疑為豬細小病毒感染。

2 實驗室診斷

2.1 病料處理

流產(chǎn)胎兒的脾臟、腎臟、腸系膜淋巴結(jié)等組織，剪碎后研磨，用生理鹽水進行5 倍稀釋，3 次重復(fù)凍融，用5,000r/min 離心15min，再吸取上清液，然后加入雙抗凍存起來備用。

2.2 引物的設(shè)計與合成

所用試驗引物位于豬細小病毒（PPV）VP2 基因內(nèi)，預(yù)期擴增片段為415bp，上游引物：5'-AATACTTGGGGGAGGGCTTG-3'，下游引物：5'-CTAGGTGCTGCTGGTGTGTA-3'。引物序列送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.3 所用試劑及儀器

病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒來自天根生化科技（北京）有限公司；DNA 純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖購自為Sigma 公司；dNTP、DL2000 DNA Marker 等購自大連寶生物工程有限公司；ExTaq 酶購自購自北京全式金生物公司；6× DNA 上樣緩沖液（DNA loading buffer，6× ）購自Solarbio life Sciences 公司；豬PK-15 細胞為本實驗室保存；胎牛血清為四季青浙江天杭生物科技股份有限公司；DMEM 培養(yǎng)基為Gibco 產(chǎn)品；胰酶消化液購自碧云天（Beyotime）生物試劑公司。主要儀器為超凈工作臺、生物安全柜、離心機（Thermo Fisher Scientific）、凝膠成像分析儀（Bio-Rad）、PCR 儀（Bio-Rad）、倒置顯微鏡（Olympus/ 奧林巴斯）等。

2.4 病毒DNA 提取

按照病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒說明書步驟進行操作。在含有20μ L 蛋白酶K 的離心管中加入200μ L 病料上清液，再加入200μ L Carrier RNA 工作液，振蕩15s，56℃孵育15min；加入250μ L 無水乙醇，振蕩后室溫放置5min；將溶液轉(zhuǎn)移至RNase-Free 吸附柱CR2 后，8,000rpm 離心1min，加入500μ L 緩沖液GD，8,000rpm 離心1min，再加入600μ L 漂洗液PW，靜置2min后，8,000rpm 離心1min；隨后加入500μ L 無水乙醇，8,000rpm 離心1min；最后將吸附柱放入一個RNase-Free 離心管中，室溫放置3min，滴加50μ L RNase-Free ddH2O，室溫放置5min 后12,000rpm離心1min，收集DNA 樣品，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 豬細小病毒VP2 基因的PCR 擴增

模板DNA 2μ L，Premix Taq 12.5μ L，上下游引物（20μ mol/L）各1μ L，用滅菌的ddH2O 補至25μ L。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min→94℃變性30s→57℃退火30s→72℃延伸30s，執(zhí)行34 個循環(huán)，結(jié)束后72℃延伸10min。反應(yīng)完畢，取PCR 產(chǎn)物6μ L，加入1μ L 6× DNA 上樣緩沖液（DNA loading buffer，6× ），經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠成像分析系統(tǒng)進行拍照。發(fā)現(xiàn)PCR 擴增后獲得1 條415bp 的特異性條帶（圖1）。將PCR 產(chǎn)物應(yīng)用DNA 純化回收試劑盒進行回收和純化，純化后的DNA 送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析，測序結(jié)果經(jīng)比對分析，發(fā)現(xiàn)與豬細小病毒VP2 基因的同源性為99.5%。以上結(jié)果表明待測樣品呈現(xiàn)豬細小病毒陽性，再同臨床癥狀和病理變化結(jié)合，診斷該豬場病豬為豬細小病毒感染。

2.6 病毒分離培養(yǎng)

將上述處理的病料上清液經(jīng)0.22μ m 濾膜過濾后接種于PK-15細胞，與此同時，使用正常細胞加以對照，在37℃下吸附1h，加入含2%胎牛血清DMEM 維持液，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后觀察細胞病變，并用PCR 對細胞培養(yǎng)物進行豬細小病毒檢測。由結(jié)果可知，病料經(jīng)盲傳后，培養(yǎng)96h，PK-15 細胞出現(xiàn)了零星的細胞病變（圖2）。將細胞裂解后，收集培養(yǎng)液進行豬細小病毒檢測，結(jié)果顯示，所分離病毒為豬細小病毒。

圖2 接種臨床樣本后，PK-15 細胞呈現(xiàn)的細胞病變

3 討論

豬細小病毒是單股線性DNA 病毒，無囊膜，基因組全長為4～6.3kb[6]，引起母豬繁殖障礙，導(dǎo)致流產(chǎn)或死胎等，在全球范圍內(nèi)，豬細小病毒是造成豬繁殖障礙的主要致病原之一，對全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[7]。該病毒適應(yīng)力較強，耐熱，在56℃溫度下可存活48h，甚至在70℃下也可存活2h，但80℃經(jīng)過5min 后該病毒就失去了感染性。此外，該病毒耐受pH 范圍廣，一般在3.0～9.0 的pH 范圍內(nèi)都可保持較高的穩(wěn)定性[8]。當(dāng)健康豬感染豬細小病毒弱毒株后，機體自身可產(chǎn)生免疫反應(yīng)，往往不會使胎盤感染。但產(chǎn)前母豬具有較高的易感性，特別是初產(chǎn)母豬，其發(fā)病率高于經(jīng)產(chǎn)母豬[9]。

豬細小病毒與其它引起豬繁殖障礙的病原如豬乙腦病毒、豬瘟病毒、衣原體、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒等感染后引起的臨床表現(xiàn)相近[10]，因此，只根據(jù)臨床癥狀常無法診斷，所以需依靠實驗室檢測才能確診。臨床上對豬細小病毒常采用免疫學(xué)方法，如血凝抑制試驗，在豬感染豬細小病毒后約1 周左右的時間里，抗體可維持相對較長的時間，抗體檢查水平顯著提高。血凝試驗和血凝抑制試驗，雖然不需要借助其他特殊設(shè)備，但靈敏性相對較差，操作較為復(fù)雜且繁瑣，結(jié)果判讀也可能受到人為因素影響[11]。乳膠凝集試驗也是較為常用的檢測方法，其特異性較強，并具有敏感性，該法可直接用于抗體檢測以及豬細小病毒病的流行病學(xué)調(diào)查，但該法只能進行定性診斷，卻不能有效監(jiān)測豬血清樣本中的抗體滴度。此外，血清中和試驗是通過細小病毒與待檢血清中的抗體發(fā)生中和反應(yīng)，然后接種細胞，根據(jù)病變計算血清的抗體滴度，此法特異性雖較好，但操作過于繁雜[12]。PCR 反應(yīng)具有特異性強、省時、操作方便、靈敏度高等優(yōu)點，成為豬細小病毒病診斷的主要方法[13]。豬細小病毒基因中的VP2 基因是一個較保守基因，對豬細小病毒的診斷有著非常重要的意義[14]。本次診斷以采集的流產(chǎn)和死胎胎兒臟器組織為病料，提取DNA 后，應(yīng)用豬細小病毒VP2 基因的特異性引物，經(jīng)擴增后獲得和預(yù)期一致的目的片段，PCR 產(chǎn)物經(jīng)序列測定發(fā)現(xiàn)與豬細小病毒VP2 基因的同源在99.5%以上，由此，可確診為豬細小病毒感染。

對于豬細小病毒的分離培養(yǎng)，目前還是研究該病的主要基礎(chǔ)，接種其特異性的PK-15 細胞，可收獲滴度較高的病毒[15]。此次實驗室診斷是用無菌操作采集的死胎和流產(chǎn)的器官組織為病料，無菌處理后接種于PK-15 細胞上，出現(xiàn)比較明顯的細胞病變是在感染96h 時，細胞培養(yǎng)液經(jīng)PCR 擴增，也同樣出現(xiàn)了豬細胞病毒VP2 基因片段，說明成功分離了豬細小病毒。此診斷結(jié)果反饋給養(yǎng)殖場后，管理人員淘汰了陽性經(jīng)產(chǎn)母豬，隔離陽性初產(chǎn)母豬，并對豬場進行了徹底消毒，加強了免疫接種等綜合防治措施，取得了較好的效果。