一起人間布魯氏菌病聚集性疫情的病原學(xué)確診及基因分型研究

聶守民，羅波艷，孫養(yǎng)信，范鎖平，王文靜，周地佳，孫 杰，常文輝，安翠紅

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌屬(Brucella)細(xì)菌感染而引起的可在全世界范圍內(nèi)發(fā)生流行的、人獸共患的一種自然疫源性的傳染性疾病，簡(jiǎn)稱為布病[1]。人主要是通過(guò)直接接觸受布魯氏菌感染的病畜及其分泌物或病畜的肉、奶、皮毛等加工品經(jīng)消化道、呼吸道、破損的皮膚黏膜等方式而被感染，感染以后會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)疼痛等臨床癥狀[2]；動(dòng)物主要是通過(guò)交配或接觸被布魯氏菌感染的病畜污染的環(huán)境和飼料等經(jīng)消化道、呼吸道、破損的皮膚黏膜等方式而被感染，感染以后會(huì)出現(xiàn)孕畜流產(chǎn)、公畜睪丸炎、跛行等臨床表現(xiàn)[3]。人間布病是我國(guó)法定的乙類傳染病，畜間布病是我國(guó)法定的多種動(dòng)物共患的二類動(dòng)物疫病[4]。布病不僅嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展，阻礙社會(huì)經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)，更是危害人民群眾身體健康、社會(huì)持續(xù)性穩(wěn)定及公共衛(wèi)生安全的重大威脅[5]。

2020年3月，陜西省咸陽(yáng)市三原縣發(fā)生一起人間布魯氏菌病家庭聚集性疫情，本實(shí)驗(yàn)室在2名患者血液內(nèi)分離到2株布魯氏菌，利用MLVA16方法進(jìn)行分型鑒定，為陜西省內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的新基因型。

1 材料與方法

1.1 流行病學(xué)調(diào)查 對(duì)2名患者進(jìn)行個(gè)案調(diào)查，每位患者采集2份靜脈血，用于虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)及雙相血培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。

1.2 儀器設(shè)備 生物安全柜(賽默飛世爾科技公司)，恒溫生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，金屬浴(杭州米歐儀器有限公司)，高速離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司)，PCR擴(kuò)增儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)，水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，凝膠成像儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，ABI3730測(cè)序儀(賽默飛世爾科技公司)，立式蒸汽高壓滅菌鍋(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)。

1.3 試劑耗材 虎紅平板凝集抗原(蘭州生物所)，試管凝集抗原(蘭州生物所)，雙相血培養(yǎng)瓶(貝瑞特生物技術(shù)(鄭州)有限責(zé)任公司)，單項(xiàng)特異性血清A、M(青島中創(chuàng)匯科生物科技有限公司)，菌種保藏管(上海寶錄生物科技有限公司)，細(xì)菌核酸提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，超純水(北京索萊寶科技有限公司)，2×PCR擴(kuò)增混合液(2 × TSINGKE Master Mix，北京擎科生物科技有限公司西安分公司)，PCR用管(上海百賽生物技術(shù)股份有限公司)，瓊脂糖(賽默飛世爾科技公司)，5×TBE電泳緩沖液(賽默飛世爾科技公司)，DNA染料(賽默飛世爾科技公司)，DNA Marker(100 bp Plus DNA Ladder Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

1.4.1 血清學(xué)檢測(cè) 采用虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清學(xué)初篩，試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清學(xué)確診，按照國(guó)家布病診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定，血清滴度≥1∶100(++)為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4.2 病原學(xué)檢測(cè) 取患者5～10 mL靜脈血無(wú)菌注射到雙相血培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放置在37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)時(shí)間為7～21 d。出菌后安全轉(zhuǎn)移至三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室，在生物安全柜內(nèi)用接種環(huán)挑取菌落至培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行純化培養(yǎng)。利用單項(xiàng)特異性血清A、M凝集試驗(yàn)進(jìn)行菌株種型鑒定。

1.4.3 核酸檢測(cè) 在生物安全柜內(nèi)用10 μL接種環(huán)挑取半環(huán)純菌至提前加有300 μL超純水的Ep管中混勻，放置在金屬浴中80 ℃持續(xù)30 min。按照細(xì)菌核酸提取試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行核酸提取。采用BCSP31-PCR從菌屬水平上對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增出223 bp目的片段即為布魯氏菌屬；采用AMOS-PCR從菌種水平上對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增出731 bp目的片段即為羊種布魯氏菌(羊種1型、羊種2型或羊種3型)。引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序均參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。分離菌株種型鑒定要根據(jù)單項(xiàng)特異性血清A、M凝集結(jié)果及核酸檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判定。

1.5 分子分型

1.5.1 多位點(diǎn)序列分析(multilocus sequence typing，MLST) MLST方法選擇9個(gè)布魯氏菌基因片段(gap、aroA、glk、dnaK、gyrB、trpE、cobQ、int-hyp、omp25)作為靶標(biāo)基因。9對(duì)引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序均參照文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司西安分公司進(jìn)行雙向測(cè)序，通過(guò)比對(duì)序列，獲得分離菌株的基因序列型及MLST基因型。

1.5.2 多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(multi-variable-number tandem repeat analysis，MLVA) MLVA通過(guò)16個(gè)基因位點(diǎn)對(duì)分離菌株進(jìn)行分型。16對(duì)引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序均參照文獻(xiàn)[9-10]進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度檢測(cè)，通過(guò)比對(duì)片段長(zhǎng)度得到串聯(lián)重復(fù)數(shù)。登錄MLVAbank for Microbes Genotyping (https://microbesgenotyping.i2bc.paris-saclay.fr/)，將所得串聯(lián)重復(fù)數(shù)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而確定分離菌株的MLVA基因型。

1.5.3 聚類分析 用Excel匯總本研究分離菌株與陜西省其他分離菌株、國(guó)內(nèi)外部分參考菌株的MLST分型數(shù)、MLVA16分型數(shù)，利用BioNumerics(Version7.6)軟件，通過(guò)UPGMA(平均連鎖聚類法)對(duì)分離菌株進(jìn)行聚類分析，用最小生成樹(shù)(Minimum spanning tree)進(jìn)行高級(jí)聚類分析。

2 結(jié) 果

2.1 疫情概況 首發(fā)病例趙某，男，48歲，陜西省咸陽(yáng)市三原縣人，農(nóng)民，主要從事奶羊養(yǎng)殖工作?；颊咦允?020年2月26日出現(xiàn)乏力癥狀，3月2日出現(xiàn)膝蓋疼痛癥狀并伴有發(fā)熱，體溫38.5 ℃，自行服用酚氨咖敏膠囊后癥狀緩解，3 d后發(fā)熱反復(fù)，自覺(jué)乏力及膝關(guān)節(jié)疼痛；患者李某，女，49歲，為首發(fā)病例趙某的妻子，農(nóng)民，主要從事奶羊養(yǎng)殖工作?；颊咦允鲇?月15日出現(xiàn)乏力癥狀病伴有指關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)輕微疼痛。3月27日，2人一同前往醫(yī)院就診，診斷為布魯氏菌病。通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查得知趙某家有2只奶羊于2020年1月15日出現(xiàn)流產(chǎn)，夫妻2人在處理流產(chǎn)物時(shí)未采取有效防護(hù)措施。患者對(duì)布魯氏菌病的知曉程度不高，在日常的養(yǎng)殖過(guò)程中不注重個(gè)人防護(hù)，奶羊圈養(yǎng)環(huán)境較差。

確診后隨即對(duì)兩名患者建立了治療檔案并定期進(jìn)行隨訪，督促患者足量、足療程用藥，同時(shí)對(duì)患者居家環(huán)境及奶羊圈養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行了終末消毒，對(duì)病例同村村民進(jìn)行了布病防治知識(shí)宣傳。由于患者確診及時(shí)，尚處在布魯氏菌病急性期，現(xiàn)已痊愈。

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果 夫妻2人虎紅平板凝集初篩試驗(yàn)和試管凝集確診試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性：趙某為1∶400(+++)，李某為1∶200(++)。

2.2.2 病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果 2020年3月27日采集夫妻2人血液進(jìn)行培養(yǎng)，趙某的雙相血培養(yǎng)瓶于4月2日出現(xiàn)菌落，編號(hào)為SN2020.2；李某的培養(yǎng)瓶于4月3日出現(xiàn)菌落，編號(hào)為SN2020.4。經(jīng)單相特異性A、M血清凝集試驗(yàn)，2株分離菌株的結(jié)果均為A不凝集，M凝集(A-，M+)。該結(jié)果表示分離菌株可能是羊種1型布魯氏菌或牛種4、5、9型布魯氏菌。

2.2.3 核酸檢測(cè)結(jié)果 2株分離菌株的核酸經(jīng)BCSP31-PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)223 bp的片段，證明分離菌株屬于布魯氏菌屬；經(jīng)AMOS-PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)731 bp的片段，證明分離菌株是羊種布魯氏菌，結(jié)合A、M血清凝集試驗(yàn)結(jié)果，判定2株分離菌株為羊種1型布魯氏菌。

2.3 MLST結(jié)果 2株分離菌株MLST9個(gè)位點(diǎn)gap-aroA-glk-dnaK-gyrB-trpE-cobQ-(int-hyp)-omp25的序列號(hào)為3-2-3-2-1-5-3-2-8，MLST基因型確定為ST8，與陜西省分離菌株的ST型相同。

2.4 MLVA結(jié)果 2株分離菌株的16個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)Bruce06-Bruce08-Bruce11-Bruce12-Bruce42-Bruce43-Bruce45-Bruce55-Bruce18-Bruce19-Bruce21-Bruce04-Bruce07-Bruce09-Bruce16-Bruce30的基因型為1-5-3-8-2-2-3-2-4-41-8-4-4-3-5-5。分析發(fā)現(xiàn)，該基因型在12位點(diǎn)VNTR結(jié)果為8，與陜西省其他菌株(結(jié)果為13)不一致。通過(guò)查詢布魯氏菌的MLVA數(shù)據(jù)庫(kù)，該2株分離菌株的基因型為首次發(fā)現(xiàn)，panel 1基因型命名為8-N1型，MLVA11基因型命名為11-N1型[11]。

2.5 聚類分析結(jié)果 MLST聚類分析見(jiàn)圖1，MLVA聚類分析見(jiàn)圖2，MLVA高級(jí)聚類分析的最小生成樹(shù)見(jiàn)圖3。

3 討 論

布魯氏菌病是我國(guó)法定的乙類傳染病，同時(shí)也是法定的二類動(dòng)物疫病。傳染源一般在畜間，如果不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)很容易造成人間布病疫情的發(fā)生。布魯氏菌病的病死率很低，但是急性期如果未能及時(shí)發(fā)現(xiàn)、診斷和治療，將會(huì)轉(zhuǎn)變成遷延不愈的慢性布魯氏菌病，會(huì)嚴(yán)重危害患者的身心健康并造成非必要的經(jīng)濟(jì)損失。畜間布魯氏菌病發(fā)生會(huì)阻礙畜牧業(yè)及社會(huì)經(jīng)濟(jì)的良好發(fā)展，同時(shí)也是對(duì)公共衛(wèi)生安全的一種威脅。因此，要加強(qiáng)對(duì)布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)報(bào)告病例，盡早控制疫情的蔓延。

三原縣隸屬于陜西省咸陽(yáng)市，位于關(guān)中平原中部，是咸陽(yáng)市大力發(fā)展千億級(jí)奶山羊產(chǎn)業(yè)鏈的主要縣(區(qū))之一。隨著奶山羊養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，散養(yǎng)戶數(shù)量及羊只存欄量急劇上升，畜間及人間布魯氏菌病的防控壓力增大。三原縣東與臨潼、富平、閻良相接，西與涇陽(yáng)、淳化相連，北與耀州相鄰，南與高陵相靠，四周接壤的都是布病高發(fā)的縣區(qū)，因患病羊只的肆意流動(dòng)導(dǎo)致布魯氏菌病疫情的風(fēng)險(xiǎn)增大。本次家庭聚集性疫情就是由于奶羊散養(yǎng)戶在日常養(yǎng)殖過(guò)程中及處理流產(chǎn)物時(shí)沒(méi)有采取有效個(gè)人防護(hù)造成的，散養(yǎng)戶作為布魯氏菌病的高危人群缺乏對(duì)該傳染病的知曉，在今后的防控工作中應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)高危人群的健康教育工作，大力普及布魯氏菌病的防治知識(shí)，增強(qiáng)散養(yǎng)戶等高危人群的防護(hù)意識(shí)。

虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)和試管凝集試驗(yàn)(SAT)在基層使用廣泛，能夠?yàn)榕R床診斷提供支持，對(duì)布魯氏菌病疫情的早發(fā)現(xiàn)具有重要的意義。本次疫情分離得到的兩株布魯氏菌經(jīng)血清凝集實(shí)驗(yàn)及核酸檢測(cè)鑒定為羊種1型，而陜西省多年來(lái)流行的主要種型為羊種3型，結(jié)合患者臨床癥狀及流行病學(xué)分析未發(fā)現(xiàn)兩種不同型別的羊種布魯氏菌引起的疫情有所區(qū)別，但陜西省多年來(lái)未有關(guān)于羊種1型布魯氏菌疫情的報(bào)道，所以本次疫情值得進(jìn)一步研究分析。

圖1 MLST聚類分析圖Fig.1 MLST cluster analysis diagram

注：框選部分為本次疫情的分離菌株信息。圖2 MLVA聚類分析圖Fig.2 MLVA cluster analysis diagram

圖3 MLVA分型最小生成樹(shù)Fig.3 Minimum spanning tree of MLVA

對(duì)分離菌株進(jìn)行分子分型也是一項(xiàng)很重要的工作，能對(duì)疫情的判定及流行病學(xué)溯源等提供有力的支持。傳統(tǒng)分型鑒定具有操作繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、生物安全要求高、易發(fā)生實(shí)驗(yàn)室感染等諸多不足，已經(jīng)不能滿足當(dāng)前布魯氏菌病的防控需要。多位點(diǎn)序列分析(MLST)、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)都是基于PCR技術(shù)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行基因分析的分子生物學(xué)技術(shù)[12-13]，在分子分型方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。三原縣的2株布魯氏菌分離株的MLST結(jié)果顯示與陜西省其他菌株的ST型一致，與新疆、內(nèi)蒙、福建、土耳其分離的羊種3型菌有較近的進(jìn)化關(guān)系，與青海、海南分離的羊種1型菌遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，說(shuō)明生物型相同的菌株其基因型別可能存在很大的差別。MLVA結(jié)果顯示本次疫情分離得到的菌株基因型為首次發(fā)現(xiàn)，豐富了陜西省布魯氏菌的基因庫(kù)；在全國(guó)范圍內(nèi)未發(fā)現(xiàn)存在與本次疫情分離株基因型近源的菌株；同時(shí)分型結(jié)果還表明不同疫情分離的菌株各自成簇，同一疫情分離的菌株具有同一基因型，說(shuō)明同一疫情的不同個(gè)體之間存在相同的傳染源。經(jīng)過(guò)分子分型研究，結(jié)合流行病學(xué)分析，本次聚集性疫情確定為本地發(fā)生的，但是菌株間的突變進(jìn)化關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。

為做好全省的人間布魯氏菌病的防控工作，建議市級(jí)疾控中心能夠掌握布魯氏菌的分子分型技術(shù)，建立各市的布魯氏菌分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：聶守民，羅波艷，孫養(yǎng)信，等. 一起人間布魯氏菌病聚集性疫情的病原學(xué)確診及基因分型研究[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(11)：1007-1011. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.154